董佳涵，朱淑文

(1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240;2.上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240)

犬繁殖調(diào)控技術(shù)研究進(jìn)展

董佳涵1，朱淑文2

(1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240;2.上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240)

由于犬具有一些獨(dú)特的生殖生理特點(diǎn)，使犬的繁殖調(diào)控技術(shù)的發(fā)展一直面臨著一些困難。目前犬繁殖調(diào)控技術(shù)的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他哺乳動(dòng)物。本文綜述了犬誘導(dǎo)發(fā)情、精液保存、人工受精、胚胎移植及克隆等犬的繁殖調(diào)控技術(shù)國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展。

犬;誘導(dǎo)發(fā)情;精液保存;人工受精;胚胎移植;克隆

2005年底公布的犬全基因組圖譜顯示，犬與人的基因相似度比人與鼠高，犬作為研究人類遺傳疾病的動(dòng)物模型具有很大的潛力，目前是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。因此在這種背景下，犬的繁殖生物技術(shù)也進(jìn)入了快速發(fā)展階段。但是由于犬具有一些獨(dú)特的生殖生理特點(diǎn)，使犬繁殖控制技術(shù)的發(fā)展目前仍然面臨著一些困難，如誘導(dǎo)發(fā)情、精液冷凍保存及人工授精(artificial insemination，AI)、胚胎移植(embryo transfer，ET)、體 外 受 精 (in vitro fertilization，IVF)等胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)以及克隆(clone)等，這些技術(shù)的應(yīng)用不僅能夠提高良種犬繁殖潛能，保護(hù)犬的種質(zhì)資源，對(duì)犬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基礎(chǔ)研究具有重要促進(jìn)作用。

1 誘導(dǎo)發(fā)情

與一般家畜相比，犬雖是季節(jié)性發(fā)情動(dòng)物，但是具有一個(gè)相對(duì)較長(zhǎng)的發(fā)情周期，其持續(xù)時(shí)間大約相當(dāng)于其它大家畜的10倍，除此之外，犬的生殖活動(dòng)和繁殖率也具有一定的不穩(wěn)定性，交配妊娠率有較大的差別。由于犬的間情期黃體壽命與妊娠期的一樣長(zhǎng)，因此犬經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)假孕現(xiàn)象［1］。

犬一般在出生后10～12個(gè)月開始表現(xiàn)性行為，大多數(shù)犬約每年發(fā)情2次，發(fā)情期所持續(xù)時(shí)間為一周左右，每次間隔約為半年。發(fā)情期的間隔長(zhǎng)短因品種個(gè)體、營(yíng)養(yǎng)狀況不同而有較大差異。據(jù)統(tǒng)計(jì)家養(yǎng)犬1年只發(fā)情1次的占26.1%，發(fā)情兩次的占65.2%，發(fā)情3次的占8.7%［2］。母犬的發(fā)情周期表現(xiàn)受體內(nèi)生殖激素的變化所調(diào)控，在進(jìn)入發(fā)情期前體內(nèi)雌激素水平明顯升高，持續(xù)約7 d后，開始下降，孕激素水平較低;而此時(shí)LH水平急劇升高，持續(xù)時(shí)間較短，當(dāng) LH達(dá)峰值后24～48 h，開始排卵，雌激素水平后降至正常值［3］。

母犬到了性成熟年齡后和配種季節(jié)到來后仍未見發(fā)情，可采用激素誘導(dǎo)發(fā)情。目前在國(guó)內(nèi)外應(yīng)用于誘導(dǎo)母犬發(fā)情的外源性激素大致分為以下幾類：促性腺激素釋放激素(GnRH)，促性腺激素、促乳素抑制因子(PIF)、雌激素(E2)、前列腺素(PGF2α)、多巴胺激動(dòng)劑等。國(guó)外對(duì)激素類藥物誘導(dǎo)犬發(fā)情的研究較早，從1939年開始以來，已經(jīng)有超過40種的激素類處理組方用于誘導(dǎo)犬的發(fā)情［4］。Ithaca［5］指出，只有當(dāng)母犬卵巢上的卵泡發(fā)育到一定的水平時(shí)，對(duì)母犬給予GnRH才會(huì)有效，GnRH并不能增加生長(zhǎng)卵泡的數(shù)目，只能促使其成熟的卵泡排卵。GnRH的脈沖釋放和閾值對(duì)于卵泡的持續(xù)生長(zhǎng)和發(fā)育具有很重要的意義。因此應(yīng)用GnRH及其類似物誘導(dǎo)發(fā)情時(shí)，必須要有連續(xù)滴注藥或規(guī)律頻繁給或?qū)⑵渲谱鞒删忈屩苿┻M(jìn)行皮下埋植。利用GnRH來誘導(dǎo)乏情母犬發(fā)情，其處理時(shí)間一定要超過 8 d 才會(huì)出現(xiàn)效果［6］。

國(guó)內(nèi)，余道倫等［7］等實(shí)驗(yàn)表明，小劑量的妊娠馬血清促性腺激素(PMSG)(150～300)IU單獨(dú)使用時(shí)不能有效地誘導(dǎo)發(fā)情母犬的發(fā)情排卵，大劑量(500)IU應(yīng)用時(shí)雖可有效地誘導(dǎo)發(fā)情排卵，但受胎率較低，因此提高單獨(dú)應(yīng)用PMSG的誘導(dǎo)發(fā)情效果尚需進(jìn)一步研究。王祿華等［8］將6只試驗(yàn)犬在第1天皮下注射 PGF2α0.5 mg，分上、下午兩次注射，24 h后皮下注射 PMSG 20 IU/kg體重，每天1次，連用10 d，交配后肌內(nèi)或皮下注射促排3號(hào)，24 h后復(fù)配1次。結(jié)果表明試驗(yàn)犬都出現(xiàn)了發(fā)情癥狀，發(fā)情率為100%，但受配率較低。在生產(chǎn)中，經(jīng)常用hCG與PMSG結(jié)合使用，誘導(dǎo)處于乏情期的母犬發(fā)情，且上述兩種激素聯(lián)合使用要比單獨(dú)使用PMSG誘導(dǎo)發(fā)情的效果好的多［9］。張玉西等［10］研究，用相同 PMSG和hCG配合處理母犬，發(fā)現(xiàn)在發(fā)情率、受胎率方面經(jīng)產(chǎn)母犬顯著優(yōu)于未經(jīng)產(chǎn)犬。譚建華等［11］用PGF2α、eCG及hCG聯(lián)合使用具有促進(jìn)發(fā)情、卵泡發(fā)育和超數(shù)排卵的功能，并能維持早期胚胎的著床。孫兆增等［12］將40只處于乏情期的比格犬乙烯雌酚隔天給藥且藥量逐漸加大的方法誘導(dǎo)發(fā)情的效果較好。李小慧等［13］利用溴隱亭誘導(dǎo)母犬發(fā)情，將所有的試驗(yàn)犬每天口服溴隱亭1次，結(jié)果表明在試驗(yàn)所用的9只犬中，有3只蘇北紅犬出現(xiàn)發(fā)情癥狀，而另外6只羅維納犬中，只有1只在處理后出現(xiàn)發(fā)情癥狀，經(jīng)分析，出現(xiàn)差異的原因可能與犬的種類和繁殖史有關(guān)系。

目前對(duì)于激素誘導(dǎo)犬發(fā)情的效果不一致，還沒有可用于生產(chǎn)及臨床上的合適組方，存在一定的問題。使用PMSG組合對(duì)乏情母犬進(jìn)行人工誘導(dǎo)發(fā)情是最有效的方法，但用PMSG誘導(dǎo)發(fā)情的最大缺點(diǎn)是容易使卵巢產(chǎn)生不排卵的大卵泡并且由于PMSG半衰期長(zhǎng)，誘情失敗后會(huì)導(dǎo)致母犬長(zhǎng)時(shí)間不發(fā)情，甚至喪失繁殖力。使用雌激素的方法，由于注射雌激素對(duì)于卵泡發(fā)育的促進(jìn)作用較小，容易導(dǎo)致母犬出現(xiàn)假發(fā)情，并且雌激素的副作用常會(huì)影響母犬的正常性周期。使用前列腺素類藥物時(shí)會(huì)產(chǎn)生一些副作用，如口水增多、嘔吐、腹瀉、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、不安、尿頻等。

2 精液保存

1959年Seager首次報(bào)道了犬的凍精人工授精獲得成功。之后，犬精液冷凍已成為犬生殖生理學(xué)研究的一部分，相繼建立了采精、精液品質(zhì)評(píng)價(jià)、稀釋及人工授精的有關(guān)參數(shù)，最高受孕率可達(dá)92%。國(guó)外一些大學(xué)和養(yǎng)犬俱樂部建立了犬精子庫，提供繁殖配種服務(wù)。我國(guó)在這方面的研究起步較晚，目前尚處于試驗(yàn)研究階段。

Rota等通過添加 Equex STM到常用的 Tris卵黃液中，提高了在38℃解凍后犬精子的存活率，經(jīng)陰道或子宮內(nèi)輸精，妊娠率達(dá)到了 84%［14］。Abe等［15］用脫脂牛奶、葡萄糖和甘油代替卵黃液，結(jié)果表明解凍后精子的活力及各參數(shù)與傳統(tǒng)的卵黃液方法無明顯差別，且對(duì)2只受體犬進(jìn)行人工受精后，產(chǎn)下6只幼犬。Bencharif等［16］研究用含有6%卵黃的低密度脂蛋白冷凍液與傳統(tǒng)的含有20%卵黃的冷凍液進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)在低密度脂蛋白冷凍液中精子的活力以及在冷凍與解凍的過程中對(duì)精子的保護(hù)力都比傳統(tǒng)的冷凍液好。用此精液對(duì)6只受體犬進(jìn)行子宮內(nèi)人工受精獲得100%懷孕率。

3 人工受精

開展犬的人工授精對(duì)于充分發(fā)揮優(yōu)秀種公犬的作用，提高繁殖效率具有重要意義。早在1880年，意大利生理學(xué)家Spallanzani首次用犬進(jìn)行AI試驗(yàn)取得成功并產(chǎn)下3只小狗。

犬宮腔內(nèi)進(jìn)行冷凍精液人工受精比陰道內(nèi)人工授精產(chǎn)仔率高，犬在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間進(jìn)行人工受精的產(chǎn)仔率為78%(n=559;P＜0.01)，同胎產(chǎn)仔數(shù)約為5.8+/-0.2(P＜0.05);進(jìn)行兩次人工授精的產(chǎn)仔數(shù)和平均同胎產(chǎn)仔數(shù)均大于只授精一次;受體犬大于6歲比年輕犬產(chǎn)仔率低;另外精液的品質(zhì)也影響產(chǎn)仔率［17］。Pretzer［18］采用冷凍精液進(jìn)行子宮頸內(nèi)人工授精，懷孕率為89.4%、產(chǎn)仔率為87.5%及同胎產(chǎn)仔數(shù)為6.9+/-2.7，均好于之前的研究結(jié)果。Kim［19］等采用冷凍精液對(duì)犬分別進(jìn)行子宮腔內(nèi)人工授精及陰道內(nèi)授精，結(jié)果表明，子宮腔內(nèi)人工授精懷孕率為100%而陰道內(nèi)僅為20%。上述報(bào)道表明目前子宮腔內(nèi)人工授精效果較陰道內(nèi)效果好。

選擇最適時(shí)間進(jìn)行人工授精對(duì)受精效率有重要影響。犬在促黃體素峰值之后24～28 h卵巢排卵，此時(shí)孕酮濃度為2.12～4.06 ng/mL，平均濃度：2.78 ng/mL;孕酮在排卵前濃度為0.8～1.56 ng/mL，平均 1.12 ng/mL;在排卵后濃度 1.88～2.81 ng/mL，平均2.34 ng/mL;在孕酮濃度為2.5～10 nmol/L即LH高峰之后第3天進(jìn)行第1次冷凍精液人工受精，第5天進(jìn)行第2次冷凍精液人工受精效果較好［20］。Shimatsu 等［21］研究發(fā)現(xiàn)在 LH 峰值之后的3～7 d進(jìn)行自然交配可以得到較滿意的產(chǎn)仔率及同胎產(chǎn)仔數(shù)，但是在LH之后第7天進(jìn)行交配的母犬妊娠時(shí)間明顯長(zhǎng)于在LH之后第3天和第5天進(jìn)行交配的妊娠時(shí)間。Tsutsui［22］在研究自然交配的母犬時(shí)發(fā)現(xiàn)，子宮頸在排卵后的平均第5天關(guān)閉，在開始排卵之后的第6、7、8、9天進(jìn)行子宮頸內(nèi)鮮精人工授精，懷孕率分別為 100%，71.4%，37.5%和0%。此結(jié)果證實(shí)卵母細(xì)胞在成熟之后的4～5 d進(jìn)行子宮內(nèi)人工受精效果最好。

4 胚胎移植

犬的胚胎移植技術(shù)目前僅在實(shí)驗(yàn)室研究階段，還沒有可用于生產(chǎn)上的成熟技術(shù)。這主要是由于誘導(dǎo)犬的同期發(fā)情、胚胎體外培養(yǎng)及胚胎移植技術(shù)等還不成熟，但是相關(guān)的研究一直在進(jìn)行，目前已經(jīng)取得了一定進(jìn)展［23］。Kinney等報(bào)道將8個(gè)桑棋胚植入受體犬的子宮后產(chǎn)下2只幼仔。Tsutsui等報(bào)道手術(shù)采集發(fā)情后14～15 d的5只供體犬28枚胚胎，將這些胚胎再分別植入5只自然發(fā)情母犬子宮內(nèi)，其中有2只受體犬受孕，各自產(chǎn)下2只幼仔。

Tsutsui等［24］認(rèn)為犬的胚胎移植受超數(shù)排卵和同期發(fā)情的限制成功率較低，并且比較了子宮切除法與手術(shù)沖卵法這兩種沖胚方式的胚胎回收率，前一種方法顯著高于后一種(97.1%和42.5%)且用于早期胚胎移植的胚胎應(yīng)從輸卵管中沖卵獲得，輸卵管切除術(shù)比輸卵管沖卵獲得率高(95%和28.2%)。Tsutsui等［25］將犬原核期至8細(xì)胞期的早期胚胎移入輸卵管下游獲得成功，表明犬的輸卵管胚胎移植是可以實(shí)現(xiàn)的。采用自然同期發(fā)情的10只供體犬及13只受體犬進(jìn)行子宮內(nèi)早期胚胎移植，供體犬在交配后1～4 d(排卵后5～7 d)輸卵管切除回收早期胚胎;在排卵之后的第5天(交配后的1～2 d)收集到的是原核期和2細(xì)胞期胚胎;第6天(交配后的1～4 d)收集到的是4細(xì)胞期及8細(xì)胞期胚胎;排卵之后的第7天收集到8細(xì)胞期胚胎。在受體中有一只接受了2個(gè)原核期胚胎及一個(gè)2-細(xì)胞期胚胎的犬產(chǎn)下倆只幼犬［26］，結(jié)果顯示雖然子宮內(nèi)移入早期胚胎可以得到幼犬但成功率較低，早期胚胎移植輸卵管中較適合。Jang等［27］報(bào)道通過耳皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植，采用排卵后72 h體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞，重組后的克隆胚胎移入自然同步發(fā)情(排卵后72 h)受體母犬輸卵管中，最后獲得了雌性幼犬。董君艷等［28］也報(bào)道將供體胚胎沖出后移植給2只自然發(fā)情受體犬成功受孕，并產(chǎn)下3只幼仔。余道倫等［29］對(duì)自然發(fā)情同步配種的供體畢格犬輸卵管沖卵，受體畢格犬輸卵管鮮胚移植，結(jié)果表明，在8頭受體犬中有1頭犬于手術(shù)后成功懷孕并順利產(chǎn)下1頭雄性幼犬，這是國(guó)內(nèi)首次獲得輸卵管胚胎移植成活幼犬。孫秀青等［30］進(jìn)行了犬的輸卵管和子宮角胚胎移植，結(jié)果在8只輸卵管胚胎受體犬移植中有1只犬于手術(shù)后成功懷孕并順利產(chǎn)下1頭雄性幼犬，子宮角回收法的胚胎回收率稍低于輸卵管回收法。

測(cè)定母犬的排卵時(shí)間是解決和提高受精率的一個(gè)重大問題。它包括了測(cè)定正常交配時(shí)間和實(shí)施AI的準(zhǔn)確時(shí)間，也包括了何時(shí)可以收獲犬的卵子，以便進(jìn)行體外受精或是直接收獲胚胎進(jìn)行胚胎移植等。Abe等［31］對(duì)拉布拉多犬研究發(fā)現(xiàn)，在 LH峰值后的11 d發(fā)育的胚胎開始從輸卵管向子宮內(nèi)移動(dòng)，并且在24 h內(nèi)完成，在LH峰值后的13 d所有胚胎都進(jìn)入子宮內(nèi)并且開始著床，在11～13 d中發(fā)育成桑葚胚，在14 d內(nèi)發(fā)育成囊胚。

5 克隆

犬的克隆技術(shù)一直面臨著兩大難題，一是體外獲得成熟卵母細(xì)胞難度很大，犬的卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)率很低，這是因?yàn)槿呐怕寻l(fā)生在第一次減數(shù)分裂開始時(shí)，卵子要在輸卵管經(jīng)1～3 d發(fā)育才至成熟。二是犬的誘導(dǎo)發(fā)情技術(shù)還不完善，獲得同期發(fā)情的供受體難度較大。因此直到2005年才獲得世界上首例克隆犬，科學(xué)家們采用的是獲得體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞及選擇自然發(fā)情的代孕母犬，將1095個(gè)胚胎植入123頭犬體內(nèi)，有3個(gè)成功受孕，其中一個(gè)流產(chǎn)，另1頭小犬出生22 d后因肺炎死亡，最終一只代孕的拉布拉多獵犬于60 d后產(chǎn)下一頭小獵犬［32］。Hong等［33］采用犬胎兒成纖維細(xì)胞作為核供體進(jìn)行體細(xì)胞核移植，將50個(gè)重組胚移入自然發(fā)情的供體母犬體內(nèi)，最終獲得2只體細(xì)胞克隆幼犬。Hossein等［34］研究受體犬獲得重組胚胎數(shù)對(duì)克隆犬出生率的影響發(fā)現(xiàn)，移入4～10個(gè)胚胎及26～40個(gè)胚胎的7只和12只犬無懷孕現(xiàn)象;移入11～25個(gè)胚胎的17只犬懷孕率為23.53%，最終5只犬誕生。結(jié)果顯示對(duì)于供體犬移入的重構(gòu)胚胎數(shù)量影響其懷孕及產(chǎn)仔率。Jang等［35］研究顯示將小品種犬(貴賓犬)的體細(xì)胞移入大品種犬的去核卵母細(xì)胞中也可以獲得克隆犬。說明犬的克隆可在犬的不同品種間實(shí)現(xiàn)。Hong等［36］采用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染法及胎兒成纖維細(xì)胞體細(xì)胞核移植，首次獲得了表達(dá)紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因犬。

目前所獲得的克隆犬采用的都是體內(nèi)成熟犬卵母細(xì)胞及自然同期發(fā)情的供受體，所以犬的克隆技術(shù)還很不完善，有賴于提高犬的卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟率及誘導(dǎo)同期發(fā)情技術(shù)。

6 結(jié)語

犬繁殖調(diào)控技術(shù)的發(fā)展比較緩慢，主要是由于目前對(duì)犬的特殊生殖生理的研究比較匱乏。近幾年來對(duì)犬繁殖調(diào)控技術(shù)的研究逐漸增多，并成功獲得克隆犬和轉(zhuǎn)基因犬。但目前犬體外胚胎生產(chǎn)以及克隆等技術(shù)由于受到卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)率低的影響而受到限制。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展完善，對(duì)犬及犬科動(dòng)物特有的生殖生理現(xiàn)象的研究將會(huì)更加深入，從而將會(huì)更好的促進(jìn)犬繁殖調(diào)控技術(shù)的研究。

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Current Status and Progress in Canine Reproductive Regulation Technology

DONG Jia-han1，ZHU Shu-wen2
(1.School of Agriculture and Biology，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240，China;2.Shanghai Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Shanghai 200240)

Currently，studies on canine reproductive regulation technology are far less developed than that in other mammals.Compared with other mammals，canine reproductive physiology has unique characteristics which make canine reproductive biotechnology faced with some difficulties.This review summaries the following aspects，including induction of estrus in dogs，preservation of semen and artificial insemination(AI)，embryo transfer(ET)and clone，and discusses its current progress and prospect.

Canine;Induction，estrus;Preservation，semen;Artificial insemination;Embryo transfer;Clone

R332

A

1671-7856(2011)02-0074-05

2010-09-30

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.02.17

董佳涵(1986-)，女，碩士在讀，研究方向：動(dòng)物繁殖生物技術(shù)。E-mail：dongjiahan@126.com。

朱淑文(1960-)，女，副教授，研究方向：動(dòng)物繁殖生物技術(shù)。E-mail：swzhu@sjtu.edu.cn。