陳穎 王瑋,2

(1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院 北京 100123;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院)

1 前言

食物過(guò)敏是一種人體對(duì)食物中抗原物質(zhì)產(chǎn)生的由免疫介導(dǎo)的不良反應(yīng),嚴(yán)重時(shí)可能產(chǎn)生過(guò)敏性休克,甚至危及生命,目前已成為全世界關(guān)注的公共衛(wèi)生熱點(diǎn)問(wèn)題[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),全世界約有 2%-3%的成年人和 5-8%的兒童患有食物過(guò)敏癥,其中90%以上的食品過(guò)敏來(lái)自小麥、花生、大豆、堅(jiān)果類(lèi)、牛奶、雞蛋、魚(yú)和甲殼類(lèi)食物[2]。隨著食品工業(yè)的迅速發(fā)展,人們的飲食習(xí)慣和食品種類(lèi)發(fā)生了很大變化,因食品致敏的患者數(shù)量也日益增多,越來(lái)越影響到人類(lèi)的生活質(zhì)量和生命安全。為保障公眾健康,很多國(guó)家和地區(qū)先后出臺(tái)了相關(guān)的法律法規(guī),要求明確標(biāo)簽、標(biāo)識(shí)食品中的過(guò)敏原成分。食品法典委員會(huì) (CAC)關(guān)于食物過(guò)敏標(biāo)識(shí)的問(wèn)題,在《預(yù)包裝食品標(biāo)識(shí)法典通用標(biāo)準(zhǔn)》中要求,對(duì)于所有已知可導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)的食品和配料都應(yīng)加以說(shuō)明。歐盟公布第 2003/89/EC號(hào)指令規(guī)定食品標(biāo)簽必須列明多類(lèi)致敏成分,要求成員國(guó)從 2005年 11月 25日起禁止銷(xiāo)售不符合標(biāo)簽規(guī)定的產(chǎn)品。美國(guó)自2006年 1月 1日起已開(kāi)始實(shí)施新的強(qiáng)制性的《食品過(guò)敏原標(biāo)識(shí)和消費(fèi)者保護(hù)法規(guī)》(FALCPA),要求食品標(biāo)簽上必須標(biāo)識(shí)致敏原成分種類(lèi),并規(guī)定了標(biāo)識(shí)方式;對(duì)于含有未聲明過(guò)敏原的食品,美國(guó) FDA要求召回。日本厚生省《食品衛(wèi)生法》規(guī)定必須清楚標(biāo)示蛋、牛乳、小麥、蕎麥及花生等 5種主要致敏原成分。香港地區(qū)從 2007年 7月 9日開(kāi)始執(zhí)行過(guò)敏原標(biāo)識(shí)制度《食品及藥物 (成分組合及標(biāo)簽)規(guī)例》,強(qiáng)調(diào)了對(duì)于甲殼類(lèi)魚(yú)類(lèi)等水產(chǎn)品、花生和堅(jiān)果的過(guò)敏原標(biāo)識(shí)。我國(guó)在 2008年奧運(yùn)會(huì)期間編制了《奧運(yùn)會(huì)食品安全食品過(guò)敏原標(biāo)識(shí)標(biāo)注》,首次出現(xiàn)了對(duì)過(guò)敏原標(biāo)識(shí)的要求,但該標(biāo)準(zhǔn)卻隨奧運(yùn)會(huì)的結(jié)束而終止。2010年我國(guó)根據(jù)《食品安全法》規(guī)定和國(guó)務(wù)院有關(guān)部門(mén)建議,借鑒國(guó)外發(fā)達(dá)國(guó)家的對(duì)過(guò)敏原標(biāo)識(shí)的管理辦法,修訂現(xiàn)行 GB/T23779-2009預(yù)包裝食品中的致敏原成分,增加食物過(guò)敏原標(biāo)示要求。

由于由于發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)進(jìn)口食品過(guò)敏原標(biāo)識(shí)越來(lái)越嚴(yán)格的要求,食物過(guò)敏原甚至成為國(guó)際食品進(jìn)出口貿(mào)易壁壘的新手段。為保證過(guò)敏原標(biāo)簽、標(biāo)識(shí)制度的實(shí)施,各國(guó)研究者紛紛開(kāi)展了針對(duì)過(guò)敏原檢測(cè)方法的研究。本文針對(duì)目前常見(jiàn)的兩類(lèi)檢測(cè)方法——免疫學(xué)檢測(cè)方法和核酸檢測(cè)方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述和分析。

2 針對(duì)過(guò)敏蛋白的免疫學(xué)檢測(cè)方法

引起食物過(guò)敏的主要成分是分子量介于 10000-70000之間的蛋白或糖蛋白,針對(duì)這類(lèi)蛋白的檢測(cè)主要采用免疫學(xué)檢測(cè)方法,包括放射過(guò)敏原吸附抑制實(shí)驗(yàn) (RAST)、酶標(biāo)記過(guò)敏原吸附抑制實(shí)驗(yàn)(EAST)、火箭免疫電泳 (R IE)、免疫印跡法 (I B)和酶聯(lián)免疫法 (EL ISA)等。

2.1 RAST或 EAST

RAST或 EAST主要應(yīng)用于食物過(guò)敏的臨床診斷,同時(shí)也應(yīng)用于食物過(guò)敏原的定性檢測(cè)及多種食物中潛在致敏性的評(píng)價(jià)。RAST/EAST的檢測(cè)原理是抗原在固相載體上與特定人群血清中的 IgE結(jié)合,樣品中的抗原與固定相上的抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 IgE,加入一種抗 IgE的同位素或酶標(biāo)記抗體,并加入可改變顏色或者能發(fā)光的底物用于檢測(cè)結(jié)合 IgE的抗體。此兩種方法的弊端主要在于無(wú)法獲取過(guò)敏人群的血清,評(píng)價(jià)方法的標(biāo)準(zhǔn)化較為困難。

2.2 RIE

R IE使用含有抗體的凝膠,被檢測(cè)分析的抗原根據(jù)自身的電泳能力在凝膠中遷移直至抗體與抗原結(jié)合,所形成的電泳峰高與待檢抗原含量成正比例。該法的局限在于凝膠的制備及免疫環(huán)節(jié)的操作步驟比較繁瑣。

2.3 IB

IB主要用于半定量檢測(cè)食物樣品中的過(guò)敏蛋白,首先提取樣品蛋白噴灑于硝酸纖維素膜或 PVPF膜上,用酶標(biāo)記抗體與目標(biāo)抗原進(jìn)行結(jié)合反應(yīng),酶與底物反應(yīng)顯現(xiàn)出有顏色的斑點(diǎn),斑點(diǎn)的深淺與抗原的含量成比例。

2.4 EL ISA

EL ISA法是用特定的蛋白或者抗原與特定的酶標(biāo)記抗體結(jié)合后用顯色反應(yīng)來(lái)定性和定量,與前述方法相比 (R IE和 I B方法是定性和半定量方法,RAST和 EAST是定量分析方法),它因其準(zhǔn)確性高、操作簡(jiǎn)便及標(biāo)準(zhǔn)化的可能性,常用于食品安全和臨床檢驗(yàn)等領(lǐng)域。EL ISA方法檢測(cè)食物過(guò)敏原的方式主要有競(jìng)爭(zhēng) EL ISA和夾心 EL ISA方法兩種。例如,國(guó)外研究者利用固相載體上的抗體捕捉過(guò)敏原,然后用酶標(biāo)記的二抗形成夾心抗,檢測(cè)腰果特異性蛋白,檢測(cè)靈敏度可達(dá) 1.0μg/g,但其他堅(jiān)果類(lèi)如美洲山核桃、胡桃、開(kāi)心果和葵花籽之間卻存在著交叉反應(yīng),限制了 EL ISA法的應(yīng)用范圍[3]。EL ISA方法在檢測(cè)蝦過(guò)敏原時(shí),利用原肌球蛋白特異性抗體,檢測(cè)限為 2.5μg/g,但蝦與龍蝦、蟹等其他甲殼類(lèi)之間卻存在著顯著的交叉反應(yīng)[4]。脊椎動(dòng)物原肌球蛋白雖與蝦原肌球蛋白幾乎存在 55%的同源性,但蝦與含有原肌球蛋白的雞和豬等脊椎動(dòng)物卻無(wú)交叉反應(yīng)[5]。近年國(guó)內(nèi)研究者建立了檢測(cè)牛乳中β-乳球蛋白的間接競(jìng)爭(zhēng) EL ISA法,檢測(cè)限范圍在 0.05-1.00μg/mL之間[6]。還有些研究者利用雙抗體夾心 EL ISA法分別檢測(cè)食物中大豆、牛奶、蝦及花生過(guò)敏原蛋白成分,其最低檢測(cè)限分別為 100 ng/mL[7]、25 ng/mL[8]、40 ng/mL[9]和 8 ng/mL[10]。

隨著試劑生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展和標(biāo)記物的應(yīng)用,檢測(cè)食物過(guò)敏原的商業(yè)化試劑盒也應(yīng)運(yùn)而生,EL ISA試劑盒可檢測(cè)和定量食物中過(guò)敏原成分,如花生蛋白 (0.1-5μg/g)、榛子蛋白 (1-10μg/g)、小麥蛋白(1.5-10μg/g)和大豆蛋白 (1-5000μg/g)等。然而 EL ISA試劑盒在檢測(cè)魚(yú)過(guò)敏原時(shí),雖可檢測(cè)出魚(yú)釋放的組胺成分,但并不適用于魚(yú)過(guò)敏原蛋白的檢測(cè)[11]。

EL ISA方法的特異性和靈敏性主要依賴(lài)于抗體識(shí)別食物過(guò)敏原,但食品工業(yè)常利用熱處理、焙烤和酶解等深加工技術(shù),這些技術(shù)可使過(guò)敏原蛋白發(fā)生變性和降解,而蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變又可干擾蛋白提取物或抗體結(jié)合部位,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。此外,對(duì)于某些過(guò)敏原,由于缺少特異性的單克隆抗體,無(wú)法利用 EL ISA法進(jìn)行檢測(cè)。

3 針對(duì)致敏食品的核酸檢測(cè)方法

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)技術(shù)起始于 20世紀(jì) 90年代中期,但食物過(guò)敏原的 PCR檢測(cè)法憑借自身顯著的優(yōu)勢(shì),已逐漸取代 EL ISA法成為官方的食品安全檢測(cè)機(jī)構(gòu)或?qū)嶒?yàn)室的主流檢測(cè)方法[11]。PCR法主要又可分為普通凝膠 PCR和熒光定量 PCR兩種。普通凝膠 PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果只是定性方法,但可利用合適的內(nèi)標(biāo)物,進(jìn)行半定量檢測(cè)分析;而熒光定量 PCR法因其整個(gè)反應(yīng)過(guò)程在密閉管中進(jìn)行,無(wú)需反應(yīng)結(jié)束后的電泳分析,因此可降低反應(yīng)的污染率,這樣利用熒光定量 PCR法代替普通 PCR法進(jìn)行多種基因的檢測(cè)越來(lái)越普遍。

與免疫學(xué)方法相比,PCR技術(shù)可通過(guò)引物優(yōu)化和基因靶序列的合理選擇來(lái)克服交叉反應(yīng)的影響。對(duì)于缺乏特異性單抗的過(guò)敏原,PCR法可利用已知過(guò)敏原的基因序列實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。例如,Christine Hupfer等基于芹菜管家基因 Mtd,建立實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)食物中的芹菜成分,檢測(cè)限可達(dá) 5-10μg/g[12]。 I.Lo′pez-Calleja等利用 PCR技術(shù)擴(kuò)增線粒體 12S rRNA基因,從綿羊和山羊奶酪中檢測(cè)出了牛奶成分,檢測(cè)靈敏度為 1.0%[13];還從水牛奶 (water buffalo milk)和意大利干酪中檢測(cè)出了牛奶 (cows′milk)成分 ,檢測(cè)靈敏度為 0.1%[14]。Rene′Ko¨ppel等利用榛果過(guò)敏原 Cor a 1基因、花生過(guò)敏原 Ara h 2基因、大豆內(nèi)源基因 Lectin、牛線粒體 tRNA-Lys基因、雞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-3基因等,建立多重實(shí)時(shí)熒光 PCR方法,從食物中檢測(cè)出致敏性食物榛果、花生、大豆、牛和雞等成分,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出較好的特異性和靈敏性 (0.01%)[15]。此外,Fran?oise Nau等利用線粒體細(xì)胞色素 b基因設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,從雞蛋制品中可分辨出火雞蛋、鴨蛋和珍珠雞蛋成分[16]。而鑒定魚(yú)種類(lèi)的 PCR方法主要是利用線粒體 DNA,盡管 5S r DNA、12S rRNA、16S rRNA及運(yùn)鐵蛋白等基因也能達(dá)到鑒定效果,但現(xiàn)普遍采用線粒體細(xì)胞色素 b基因進(jìn)行魚(yú)類(lèi)物種鑒定[17]。

針對(duì)含麩質(zhì)的谷類(lèi)成分,R′emiAlary等運(yùn)用定量 PCR方法,通過(guò)擴(kuò)增普通小麥嘌呤吲哚蛋白 (puroindoline-a)基因和硬粒小麥脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白 (Lipid transfer protein)基因,從栗子粉中檢測(cè)出谷類(lèi)作物;Daniela Zeltner利用小麥高分子量麥谷蛋白 (HMW Glutenin B1-1)基因、黑麥 HMW Glutenin R-1基因和大麥醇溶蛋白(Hor 3)基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針,建立了實(shí)時(shí)熒光 PCR法檢測(cè)食物中的麩質(zhì)谷物方法[18]。國(guó)內(nèi)研究者欒鳳俠等利用小麥過(guò)敏原基因 (γ-醇溶蛋白基因)設(shè)計(jì)特異引物和探針,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光 PCR法從食品中檢測(cè)出小麥成分[19]。曹際娟等選擇大麥管家基因 Hordein、小麥管家基因Glmdin、黑麥管家基因 Secl和燕麥管家基因 Avenin作為物種鑒定的特異性標(biāo)記基因,利用實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)出食品中含麩質(zhì)的谷類(lèi)大麥、小麥、黑麥和燕麥成分[20]。

此外,PCR方法還可減少生物學(xué)相近物種間的交叉反應(yīng)和假陽(yáng)性結(jié)果,研究者常利用大豆內(nèi)源基因 Lectin、大豆主要過(guò)敏原 Glym Bd 30K基因和 Gly m Bd 28K基因進(jìn)行 PCR擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)大豆過(guò)敏原。研究還表明,選用 Gly m Bd 30K基因可增強(qiáng)大豆與其他豆科植物的鑒別能力[21]。還有研究者建立一種實(shí)時(shí)熒光 PCR法,通過(guò)擴(kuò)增花生過(guò)敏原特征基因序列如 Ara h 2基因、Ara h 3基因和 Ara h 4基因,用于檢測(cè)花生過(guò)敏原,且Ara h 3基因較其他兩類(lèi)過(guò)敏原基因,檢測(cè)靈敏度更高[22]。Alexandra Ehlert等利用實(shí)時(shí)熒光 PCR方法擴(kuò)增腰果主要過(guò)敏原 Ana o3基因,可特異靈敏地檢測(cè)出食物中腰果成分,檢測(cè)限可達(dá) 2.0μg/g[23]。

PCR法在食物過(guò)敏原檢測(cè)方面雖具有特異性和靈敏性等優(yōu)勢(shì),但 PCR法無(wú)法檢測(cè)出過(guò)敏原蛋白,因此檢測(cè)結(jié)果不能與食物的真正致敏性相關(guān)。并且食品在加工處理后對(duì)蛋白和 DNA的影響也存在著差異,某些加工程序可能致使蛋白和 DNA被分離,無(wú)法驗(yàn)證食物中是否真正存在過(guò)敏原蛋白。但PCR方法對(duì)于進(jìn)出口食品中潛在過(guò)敏原可起到預(yù)警和快速檢測(cè)作用,為進(jìn)一步確認(rèn)食物中是否存在過(guò)敏原提供參考。

4 EL ISA與 PCR方法的比較

目前,EL ISA和 PCR方法皆適用于小麥、大豆、榛子、谷物和花生等食物的檢測(cè),兩者實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間存在較好的相關(guān)性,并且有不同的適用檢測(cè)對(duì)象[24]。

但 EL ISA方法因自身具有較低復(fù)雜度的特異蛋白識(shí)別位點(diǎn),易受到食物基質(zhì)中所含糖、醛等物質(zhì)的影響,改變其免疫原性。如果標(biāo)記蛋白或標(biāo)記的抗原決定簇在食品加工后受到破壞,這可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陰性,而且用動(dòng)物抗體檢測(cè)的抗原決定簇?zé)o法真正地反映出過(guò)敏患者識(shí)別的過(guò)敏原決定簇。

PCR方法對(duì)于檢測(cè)具有較低DNA含量的食物,如牛奶、雞蛋蛋白、植物油或動(dòng)物脂肪,尚存在一些問(wèn)題。對(duì)于這些樣品的檢測(cè),基于蛋白的 EL ISA也許比 PCR更為適用,同時(shí)又因 DNA不具有組織的特異性,PCR技術(shù)無(wú)法分辨雞蛋和雞肉、牛奶和牛肉之間的差異,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陰性或假陽(yáng)性。但 PCR法在復(fù)雜食品中過(guò)敏原的定量分析及物種鑒定方面,卻具有其他方法無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn),這使PCR方法在動(dòng)植物源性食物過(guò)敏原檢測(cè)方面,存在極大的優(yōu)勢(shì),適合國(guó)際法規(guī)所要求的食品中痕量過(guò)敏原的檢測(cè)原則。

5 展望

隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化和食品貿(mào)易國(guó)際化,食物過(guò)敏癥問(wèn)題逐漸受到各國(guó)的關(guān)注,食物過(guò)敏原檢測(cè)迫切需要一種快速、準(zhǔn)確、高通量的體外檢測(cè)方法。目前針對(duì)致敏原的檢測(cè)方法主要還是以蛋白和DNA為檢測(cè)目標(biāo),然而,EL ISA方法檢測(cè)食物過(guò)敏原依賴(lài)于過(guò)敏原蛋白和眾多質(zhì)量穩(wěn)定的動(dòng)物抗體;PCR方法以簡(jiǎn)單、確定的 DNA序列為基礎(chǔ),適用于復(fù)雜食品中過(guò)敏原的定量分析。但兩種方法在處理較多樣品時(shí)操作繁雜,無(wú)法解決多種過(guò)敏原的同時(shí)檢測(cè)。

由于現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,新型的檢測(cè)技術(shù)層出不窮,其中普通基因芯片技術(shù)以其高準(zhǔn)確性、高靈敏度、高通量的優(yōu)勢(shì)逐漸成為食物過(guò)敏原研究的熱點(diǎn)。但是,基因芯片技術(shù)在核苷酸雜交反應(yīng)之后還需通過(guò)專(zhuān)業(yè)的熒光掃描系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析,這往往給僅配備簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)儀器的一線實(shí)驗(yàn)室在使用上帶來(lái)很多不便之處?？梢曅酒夹g(shù)作為一種利用特異探針雜交產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)信號(hào)的基因芯片技術(shù),現(xiàn)已成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物[25]和食源性致病菌[26]等方面的檢測(cè)。該技術(shù)可對(duì)多種靶基因同時(shí)檢測(cè)和鑒定,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以直接通過(guò)肉眼進(jìn)行判定,無(wú)需昂貴的信號(hào)分析系統(tǒng),同時(shí)還可滿(mǎn)足檢測(cè)精確度和靈敏度的要求,而且響應(yīng)迅速,操作簡(jiǎn)便,成本低廉并能解決現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和在線檢測(cè)問(wèn)題[27]。因此,可視芯片技術(shù)的出現(xiàn)為食物過(guò)敏原的研究、分析及檢測(cè)開(kāi)辟了一個(gè)嶄新的空間。

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