董 秀 韓兆峰 王曉波

遼寧中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，遼寧 沈陽 110032

斑蝥素，是從中藥斑蝥中提取的一種抗腫瘤活性成分，因其毒性大，影響臨床應(yīng)用。因此目前多采用去除1，2位甲基的方法合成去甲斑蝥素 (Norcantharidin，NCTD)。研究表明，去甲斑蝥素具有良好的抗腫瘤作用，能抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡［1－3］。作者之前的實驗結(jié)果表明，去甲斑蝥素能抑制人肝癌細胞HepG2增殖，本文進一步考察了其對HepG2細胞凋亡的影響，為去甲斑蝥素的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

人肝癌細胞HepG2購自上海細胞生物學研究所，去甲斑蝥素由遼寧中醫(yī)藥大學藥學院惠贈。RPMI－1640培養(yǎng)液，碘化丙啶 (PI)，Sigma;二氧化碳培養(yǎng)箱 (NuAir，Plymouth，USA)，倒置顯微鏡等。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) 將HepG2細胞接種在含10%胎牛血清和2mmol·L－1谷氨酰胺的RPMI－1640培養(yǎng)液中，在飽和濕度，溫度為37℃，濃度為5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 細胞形態(tài)學變化觀察 將HepG2細胞接種在含有10%胎牛血清RPMI－1640培養(yǎng)液的六孔板中 (密度每孔1．2×104)，培養(yǎng)24小時后，加入50M的去甲斑蝥素，作用24小時后，相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

2.3 流式細胞儀檢測凋亡率 收集藥物作用后的HepG2細胞，用PBS和預冷的70%乙醇于4°C固定至少12h。固定后，用PBS漂洗離心后的細胞餅，再用含50mg/L PI，1g/L RNAase的染料避光冰浴30min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2.4 統(tǒng)計分析 所有實驗結(jié)果均得自三次獨立實驗，用SPSS 13．0軟件中的ANOVA進行統(tǒng)計比較，P值小于0．05視為具有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化 相差顯微鏡下觀察到，50M去甲斑蝥素作用24小時后，細胞出現(xiàn)凋亡形態(tài) (包括細胞膜皺縮、變圓，核碎裂和凋亡小體的形成)，而對照組的細胞正常生長，未見明顯凋亡形態(tài)。

3.2 流式細胞術(shù)測定凋亡的比率 去甲斑蝥素作用24小時后，凋亡細胞所占比例增加 (28.62%)，而對照組細胞凋亡率無明顯改變 (2.26%)。經(jīng)統(tǒng)計學檢驗有顯著性差異。

4 討論

惡性腫瘤嚴重威脅人類健康，多數(shù)患者需面對生存率低，生活質(zhì)量差，醫(yī)療費用昂貴的問題。尋找高效、低毒、廉價的化療藥物，是醫(yī)藥工作者的重要任務(wù)。抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡成為治療腫瘤的重要方法。實驗結(jié)果表明，去甲斑蝥素能抑制HepG2細胞增殖并誘導細胞凋亡，提示了去甲斑蝥素在肝癌治療中的應(yīng)用價值。

［1］李柏，凌昌全．去甲斑蝥素基礎(chǔ)及臨床研究進展［J］．中草藥．2002，33(2):184－185．

［2］原江亮．去甲斑蝥素對不同腫瘤細胞系作用的研究現(xiàn)狀［J］．長治醫(yī)學院學報，2008，22(4):305－307．

［3］ Yang P Y，Chen M F，Tsai C H，et al．Involvement of caspase and MAPK activities in Norcantharidin induced colorectal cancer cell apoptosis［J］．Toxicol In Vitro，2010，24(3):7660 －775．