陳的，舒正玉，薛龍吟，林瑞鳳，吳繼光，蔣詠梅，李欣，林躍鑫,2，黃建忠

1 福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心 福建省現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)工程研究中心 福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350108

2 寧德師范學(xué)院，寧德 352100

脂肪酶 (Lipase，EC3.1.1.3) 又稱(chēng)為甘油三酰酯水解酶，能有效地催化三?；视王ニ鉃楦视秃陀坞x的脂肪酸。脂肪酶活性中心的催化部位通常是由天冬氨酸或谷氨酸、絲氨酸和組氨酸組成的催化三聯(lián)體[1]。通常情況下，大多數(shù)脂肪酶的活性中心都被一種稱(chēng)為“蓋子”的結(jié)構(gòu)所覆蓋，阻止了底物與活性中心的直接結(jié)合。蓋子結(jié)構(gòu)具有多樣性，有的僅由1個(gè)單一的α-螺旋構(gòu)成，有的由2個(gè)α-螺旋構(gòu)成，還有的僅由1個(gè)Loop環(huán)構(gòu)成，少數(shù)脂肪酶無(wú)蓋子結(jié)構(gòu)[2-3]。在油-水界面，脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)域構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出脂肪酶的活性中心，底物進(jìn)入活性中心，脂肪酶的催化活性被激活。脂肪酶的催化活性在油水界面大幅度提高的現(xiàn)象稱(chēng)為界面激活[4-5]。受界面激活催化特性的影響，底物的團(tuán)聚狀態(tài)一定程度上影響脂肪酶的催化效率。為了獲得不依賴(lài)界面激活的脂肪酶突變體，科研人員設(shè)計(jì)和構(gòu)建了一系列“無(wú)蓋型”或“開(kāi)蓋型”脂肪酶突變體。

根據(jù)已解析的枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis脂肪酶A和南極假絲酵母Candida antarctica脂肪酶B的 3D結(jié)構(gòu)，結(jié)合其催化特性[6-7]，可以推測(cè)：具有“蓋子”結(jié)構(gòu)域和界面激活特性并不是鑒別脂肪酶和酯酶的恰當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)[8]，脂肪酶在沒(méi)有蓋子結(jié)構(gòu)域的情況下依然可以表現(xiàn)出催化活性。Miled等利用基因工程手段缺失人胃脂肪酶 (Human pancreatic lipase，HPL) 的“蓋子”結(jié)構(gòu)域后獲得的脂肪酶突變體，其催化活性較野生型人胃脂肪酶顯著降低[9]。此外，蓋子結(jié)構(gòu)域還與脂肪酶的其他酶學(xué)性質(zhì)相關(guān)，如對(duì)映體選擇性、鏈長(zhǎng)特異性和熱穩(wěn)定性等[10-12]。

正因?yàn)橹久干w子結(jié)構(gòu)域?qū)τ诰S持其正常功能非常重要，因此利用基因工程手段構(gòu)建“開(kāi)蓋型”脂肪酶突變體是十分必要的。Carrièr等利用人胃脂肪酶的蓋子結(jié)構(gòu)域置換豬胰脂肪酶 (Guinea pig pancreatic lipase related protein 2，GPLRP2) 對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)域后獲得的豬胰脂肪酶突變體，其蓋子結(jié)構(gòu)具有永久開(kāi)蓋型構(gòu)型，同時(shí)該突變體不再依賴(lài)油水界面激活[13]。這一結(jié)果表明，脂肪酶具有的界面激活特性不僅與蓋子結(jié)構(gòu)域的存在有關(guān)，其他結(jié)構(gòu)因子(如：蓋子結(jié)構(gòu)兩側(cè)鉸鏈區(qū)的氨基酸殘基等) 對(duì)于穩(wěn)定蓋子構(gòu)型的開(kāi)或關(guān)有著重要的作用。Brzozowski等報(bào)道疏棉狀嗜熱絲孢菌Thermomyces lanuginosa脂肪酶中位于蓋子結(jié)構(gòu)域第一個(gè)鉸鏈區(qū)的 Arg84對(duì)于觸發(fā)脂肪酶界面活性具有重要的作用[14]。類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在米黑根毛霉Rhizomucor miehei脂肪酶中也得到了證實(shí)：位于該脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)域第一個(gè)鉸鏈區(qū)的Ser84對(duì)觸發(fā)該脂肪酶界面活性也具有重要的作用[15]。

微生物脂肪酶和酯酶均屬于 α/β水解酶折疊家族，均能催化酯鍵的斷裂，二者的三級(jí)結(jié)構(gòu)具有高度的相似性，但僅脂肪酶表現(xiàn)出界面激活的催化特性。在先前的工作中，我們對(duì)比了黑曲霉脂肪酶(Aspergillus niger lipase，ANL) 和黑曲霉阿魏酸酯酶一級(jí)結(jié)構(gòu)和3D結(jié)構(gòu)的異同。在一級(jí)結(jié)構(gòu)上，二者的氨基酸殘基序列相似性達(dá)36%；在3D結(jié)構(gòu)上，二者的蓋子結(jié)構(gòu)域存在顯著差異。在活性中心的上方，黑曲霉脂肪酶和黑曲霉阿魏酸酯酶均可形成一段α-螺旋，但黑曲霉阿魏酸酯酶該α-螺旋的位置較黑曲霉脂肪酶對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的位置而言，更遠(yuǎn)離活性中心。我們預(yù)測(cè)這一結(jié)構(gòu)差異可能與二者的催化特性差異之間存在一定的關(guān)聯(lián)性。進(jìn)一步分析該 α-螺旋兩側(cè)鉸鏈區(qū)的氨基酸殘基序列，我們預(yù)測(cè)位于ANL蓋子結(jié)構(gòu)域第一鉸鏈區(qū)的 Ser84和第二鉸鏈區(qū)的Asp99對(duì)于蓋子結(jié)構(gòu)域的開(kāi)或閉構(gòu)型可能發(fā)揮了決定性的作用[16]。本實(shí)驗(yàn)分別用黑曲霉阿魏酸酯酶多肽鏈中與黑曲霉脂肪酶的Ser84和Asp99相對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基置換Ser84和Asp99，構(gòu)建2個(gè)黑曲霉脂肪酶突變體：ANL-Ser84Gly和ANL-Asp99Pro，并測(cè)定了這2個(gè)突變體的部分酶學(xué)性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

克隆宿主 Escherichia coli DH5α，表達(dá)宿主Pichia pastoris GS115及質(zhì)粒pPIC9K-lipanl均為本實(shí)驗(yàn)室保存 (lipanl為黑曲霉脂肪酶成熟肽的編碼基因序列)[16]。

1.1.2 酶和試劑

高保真Pfu DNA聚合酶購(gòu)自Sangon生工生物工程 (上海) 有限公司；各種限制性?xún)?nèi)切酶和 T4 DNA連接酶均購(gòu)自 TaKaRa寶生物工程 (大連) 有限公司；系列4-硝基苯羧酸酯均購(gòu)自Sigma公司；甲醇和甘油酯為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 黑曲霉脂肪酶基因引入突變位點(diǎn)

通過(guò)重疊延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)黑曲霉脂肪酶基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，引入突變位點(diǎn)。基于畢赤酵母密碼子偏愛(ài)性設(shè)計(jì)的用于 DNA定點(diǎn)突變的引物見(jiàn)表1。重疊延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中使用的PCR引物、模板、PCR擴(kuò)增條件及產(chǎn)物大小見(jiàn)表2。用EcoRⅠ和 NotⅠ酶切 PCR擴(kuò)增獲得的引入突變位點(diǎn)后的lipanl全長(zhǎng)基因，然后將其連接到經(jīng)同樣酶切后的pPIC9K上。重組 pPIC9K-lipanl-S84G和 pPIC9K-lipanl-D99P轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，DNA測(cè)序檢驗(yàn)引入突變位點(diǎn)的正確性。

表1 本實(shí)驗(yàn)中使用的PCR系列引物Table 1 PCR primers used in this study

表2 重疊延伸PCR反應(yīng)中使用的引物、模板、PCR擴(kuò)增條件及產(chǎn)物大小Table 2 Primer pairs, templates and PCR programs used for lipanl mutagenesis and the resulting PCR products

1.2.2 P. pastoris GS115的轉(zhuǎn)化、脂肪酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)和脂肪酶的純化

P. pastoris GS115的轉(zhuǎn)化、脂肪酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)和脂肪酶的純化均參照文獻(xiàn)[16]。重組脂肪酶經(jīng)Endoglucosidase H處理、Sephadex G-75凝膠柱純化及凍干。重組黑曲霉脂肪酶蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定參照Bradford法[17]。

1.2.3 脂肪酶活性的測(cè)定

脂肪酶活性的平板定性檢測(cè)方法參照Hiol等的平板檢測(cè)方法[18]，本實(shí)驗(yàn)以三丁酸甘油酯作為脂肪酶活性的定性檢測(cè)底物。

脂肪酶活性的分光光度計(jì)檢測(cè)法參照Kordel等的檢測(cè)方法[19]，使用的緩沖液為0.05 mol/L His-HCl (pH 6.5)，45 ℃進(jìn)行測(cè)定。在該反應(yīng)條件下，每1 min從對(duì)應(yīng)4-硝基苯羧酸酯上釋放出1 μmol對(duì)硝基苯酚作為1個(gè)脂肪酶活力單位 (U)。

為檢測(cè)黑曲霉脂肪酶及其突變體界面激活效應(yīng)，參照 Martinelle等所報(bào)道的方法[20]，測(cè)定黑曲霉脂肪酶及其突變體水解不同濃度的 4-硝基苯丁酸酯的催化活力曲線。水解溫度為25 ℃，使用的緩沖液為0.05 mol/L His-HCl (pH 6.5)。

1.2.4 溫度對(duì)黑曲霉脂肪酶及其突變體穩(wěn)定性的影響

55 ℃下溫育黑曲霉脂肪酶及其突變體，在0~60 min的不同時(shí)間間隔內(nèi)，分別檢測(cè)殘余脂肪酶酶活。將初始脂肪酶酶活定義為100%。

2 結(jié)果

2.1 脂肪酶編碼基因的定點(diǎn)突變

微生物脂肪酶和酯酶具有相似的 α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)，活性中心的催化位點(diǎn)均由 Ser-His-Asp/Glu三聯(lián)體構(gòu)成[21]。盡管脂肪酶和酯酶均能催化三酰甘油酯水解為脂肪酸和甘油，或是此反應(yīng)的逆向合成，但只有脂肪酶具有獨(dú)特的界面激活特性，而酯酶不具有此特性。在先前的研究中，我們對(duì)比了黑曲霉脂肪酶和黑曲霉阿魏酸酯酶的3D結(jié)構(gòu)，并且預(yù)測(cè)黑曲霉脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)域兩側(cè)的鉸鏈區(qū)影響脂肪酶蓋子的構(gòu)型。進(jìn)一步分析黑曲霉脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)域兩側(cè)的氨基酸殘基序列和黑曲霉阿魏酸酯酶對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基序列，篩選出黑曲霉脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)域兩側(cè)的2個(gè)氨基酸殘基：Ser84和Asp99，對(duì)脂肪酶蓋子的構(gòu)型可能具有決定性的作用[16]。為了驗(yàn)證該預(yù)測(cè)，將黑曲霉脂肪酶中的Ser84和Asp99分別用黑曲霉阿魏酸酯酶中對(duì)應(yīng)的Gly和Pro殘基置換，構(gòu)建黑曲霉脂肪酶突變體ANL-S84G和ANL-D99P。

利用表1中的引物對(duì)表2中的PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶酶切后插入表達(dá)質(zhì)粒 pPIC9K。重組質(zhì)粒pPIC9K-lipanl-S84G和 pPIC9K-lipanl-D99P經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證閱讀框的正確性及突變位點(diǎn)氨基酸殘基的正確引入。突變氨基酸殘基引入位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的堿基序列見(jiàn)圖 1，測(cè)序結(jié)果表明在突變位點(diǎn)已成功引入置換的氨基酸殘基。

2.2 黑曲霉脂肪酶及其突變體的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將 pPIC9K-lipanl、 pPIC9K-lipanl-S84G 和pPIC9K-lipanl-D99P三個(gè)基因，分別導(dǎo)入到P. Pastoris GS115表達(dá)菌株中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得的重組脂肪酶具有相同的相對(duì)分子量，大約為35 kDa (圖2A)。將20 μL重組脂肪酶用三丁酸甘油酯平板定性檢測(cè)，在ANL、ANL-S84G和ANL-D99點(diǎn)樣區(qū)周?chē)?，形成了清晰的水解?(圖2B)。

2.3 黑曲霉脂肪酶及其突變體的底物特異性及熱穩(wěn)定性檢測(cè)

圖1 lipanl, lipanl-S84G和lipanl-D99P的序列比對(duì)Fig. 1 Sequence alignment of lipanl, lipanl-S84G and lipanl-D99P.

圖2 黑曲霉脂肪酶及其突變體的純化和平板定性檢測(cè)Fig. 2 Purification and qualitative activity detection of A. niger lipase and A. niger lipase mutants. (A) SDS-PAGE analysis of the purified A. niger lipase and A. niger lipase mutants, M: protein markers. (B) Qualitative activity detection of A. niger lipase and A. niger lipase mutants on tributyrin-agar plate.

表3 黑曲霉脂肪酶及其突變體對(duì)系列4-硝基苯羧酸酯的水解活性Table 3 Specific activity of A. niger lipase and A. niger lipase mutants towards series of p-nitrophenyl esters

ANL-S84G 和ANL-D99P表現(xiàn)出了和ANL明顯不同的底物特異性和熱穩(wěn)定性。水解系列 4-硝基苯羧酸酯實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：較ANL而言，ANL-S84G的比活力顯著降低，降低幅度從29.8%到76.5%不等；而ANL-D99P水解4-硝基苯棕櫚酸酯的比活力上升了2.2倍 (表3)。ANL-S84G的比活力顯著降低可能是由于該突變導(dǎo)致重組脂肪酶 ANL-S84G形成了相對(duì)穩(wěn)定的閉蓋構(gòu)型。Brzozowski等認(rèn)為T(mén). lanuginosa脂肪酶在閉蓋構(gòu)型狀態(tài)下，Arg84與 Asp57可形成氫鍵。在油水界面，Arg84與結(jié)構(gòu)重排后的 Cys268之間形成新的氫鍵，這一變化誘發(fā)了脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)的開(kāi)啟，并激活了脂肪酶的活性[14]。根據(jù)該假說(shuō)可以推測(cè)，黑曲霉脂肪酶的 Ser84與T. lanuginosa脂肪酶上的Arg84在脂肪酶分子中所處的位置相同，因此，在誘導(dǎo)脂肪酶構(gòu)型轉(zhuǎn)變過(guò)程中，發(fā)揮了類(lèi)似的功能。黑曲霉脂肪酶上的Ser84被Gly置換后，這一過(guò)程破壞了氫鍵的形成并將導(dǎo)致ANL-S84G突變體形成相對(duì)穩(wěn)定的閉蓋構(gòu)型，在油水界面，ANL-S84G能形成有效激活構(gòu)型分子的比率將降低，ANL-S84G的比活力也因此降低。較ANL而言，ANL-D99P催化4-硝基苯棕櫚酸酯的比活力提高了2.2倍，而對(duì)4-硝基苯月桂酸酯和4-硝基苯肉豆蔻酸酯的比活力基本保持不變 (表 3)。黑曲霉脂肪酶上位于蓋子結(jié)構(gòu)域第二鉸鏈區(qū)的Asp99被Pro置換后形成的脂肪酶突變體，擴(kuò)大了蓋子結(jié)構(gòu)的伸展空間，使其活性中心能容納更大的底物分子，因此，對(duì)長(zhǎng)鏈脂肪酸酯的比活力有所提高。

上述分析，理論上解釋了 S84G 和D99P的突變，增加了ANL-S84G與ANL-D99P蓋子結(jié)構(gòu)域及其兩側(cè)鉸鏈區(qū)的柔韌性，導(dǎo)致其催化活性的降低或提高。此外，S84G和D99P的突變，可能會(huì)破壞突變體ANL-S84G與ANL-D99P的二級(jí)結(jié)構(gòu)作用力，使突變體分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)域更趨不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致了其熱穩(wěn)定性的顯著降低 (圖3)。55 ℃下溫育15 min，ANL-S84G和 ANL-D99P分別失去了 85.1%和94.0%的初始酶性，而 ANL在相同情況下僅失去15.6%的初始酶活。S84G和D99P的突變，對(duì)脂肪酶活性和熱穩(wěn)定性影響的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

圖3 黑曲霉脂肪酶及其突變體的熱穩(wěn)定性檢測(cè)Fig. 3 Effect of temperature on the stability of A. niger lipase and A. niger lipase mutants.

2.4 4-苯硝基丁酸酯濃度對(duì)于黑曲霉脂肪酶和黑曲霉脂肪酶突變體的影響

4-硝基苯丁酸酯 (p-nitrophenyl butyrate，pNPB)在水溶液中是部分可溶的，因此常用其作為研究脂肪酶界面激活的底物。為了將 pNPB的自身水解控制在最小程度內(nèi)，本實(shí)驗(yàn)中使用的緩沖溶液為His-HCl (pH 6.5)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ANL和ANL-S84G表現(xiàn)出了明顯的界面激活效應(yīng) (圖 4A和 4B)，而ANL-D99P沒(méi)有表現(xiàn)出界面激活效應(yīng) (圖4C)。盡管ANL-S84G表現(xiàn)出界面激活效應(yīng)，但其水解的動(dòng)力學(xué)曲線和ANL相比，存在明顯不同。正如上文所提到的，按照Brzozowski假說(shuō)，ANL-S84G突變體的蓋子結(jié)構(gòu)應(yīng)該保持相對(duì)穩(wěn)定的“閉蓋”構(gòu)型，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果依然具有界面激活特性。因此，除了 Arg84機(jī)制，ANL-S84G應(yīng)該還存在其他機(jī)制觸發(fā)蓋子結(jié)構(gòu)的開(kāi)蓋。D99P位點(diǎn)的突變可能改變了ANL-D99P蓋子結(jié)構(gòu)域第二鉸鏈區(qū)的β折疊的相對(duì)位置，從而產(chǎn)生了不依賴(lài)于油水界面激活的催化特性。

圖4 pNPB濃度對(duì)黑曲霉脂肪酶及其突變體水解活性的影響. (A) ANL. (B) ANL-S84G. (C) ANL-D99PFig. 4 Influence of pNPB concentration on the specific hydrolytic activity of A. niger lipase and A. niger lipase mutants. The arrow indicates the solubility limit of pNPB. (A) ANL. (B) ANL-S84G. (C) ANL-D99P.

3 討論

為了獲得不依賴(lài)界面激活的脂肪酶突變體，先前開(kāi)展了大量探索性工作，基本都集中在對(duì)組成蓋子結(jié)構(gòu)本身的氨基酸殘基進(jìn)行突變。Miled等通過(guò)缺失蓋子結(jié)構(gòu)域的方法獲得的人胃脂肪酶突變體，其催化動(dòng)力學(xué)雖然較天然脂肪酶分子表現(xiàn)出明顯的差異，但并沒(méi)有獲得預(yù)期的開(kāi)蓋型突變體分子[9]。Carrièr等則通過(guò)脂肪酶分子之間相互置換蓋子結(jié)構(gòu)域，獲得永久開(kāi)蓋的豬胰脂肪酶突變體[13]。本實(shí)驗(yàn)則通過(guò)蛋白質(zhì)大分子結(jié)構(gòu)與功能之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，建立起脂肪酶與酯酶催化特性的差異性與對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的差異性之間的聯(lián)系，結(jié)合生物信息學(xué)分析結(jié)果，對(duì)黑曲霉脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)兩側(cè)鉸鏈區(qū)的氨基酸殘基進(jìn)行突變，獲得了一個(gè)不依賴(lài)油水界面激活的黑曲霉脂肪酶突變體 (ANL-D99P)。ANL-S84G雖然依然保持界面激活的催化特性，但其催化動(dòng)力學(xué)曲線與野生型ANL已發(fā)生顯著性改變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，脂肪酶的界面激活除了與脂肪酶的蓋子結(jié)構(gòu)本身有關(guān)外，蓋子結(jié)構(gòu)域之外的其他結(jié)構(gòu)成分 (如蓋子結(jié)構(gòu)兩側(cè)鉸鏈區(qū)的氨基酸殘基) 也參與了油水界面脂肪酶構(gòu)型的改變。進(jìn)一步對(duì)脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)域更多的氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變和疊加突變，篩選更多的脂肪酶突變體，有可能獲得性能更優(yōu)良的脂肪酶突變體。同時(shí)，不依賴(lài)油水界面激活的脂肪酶突變體的構(gòu)建，有利于進(jìn)一步深入闡明脂肪酶界面激活的分子機(jī)制。

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