李曉君，蔡文偉，張樹珍，許莉萍，陳萍，王俊剛

1 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所甘蔗研究中心，?？?571101

2 福建農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)部甘蔗遺傳改良重點開放實驗室，福州 350002

3 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，儋州 571737

在動物中，具有A20/AN1鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白已被廣泛研究，該類蛋白作為免疫性炎癥和細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)因子，在免疫應(yīng)答中具有重要的調(diào)控作用[1-3]。植物中，具有 A20/AN1鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白與逆境應(yīng)答密切相關(guān)，研究者將其定義為 SAP (Stress associated protein) 家族[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，水稻所有SAP家族成員的表達(dá)能被干旱、高鹽和冷凍中的一種或多種脅迫誘導(dǎo)增強(qiáng)[6]。對番茄進(jìn)行冷凍、熱激、鹽脅迫、干旱、機(jī)械傷害、ABA、氧脅迫和細(xì)胞膜傷害處理，利用real-time PCR分析其13個SAP家族成員在進(jìn)行處理前后的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，所有SAP成員都與一種或多種逆境應(yīng)答相關(guān)[7]。

甘蔗Saccharum officinarum是一種重要的糖料作物，也是重要的能源作物。非生物脅迫，尤其是高鹽與干旱，是全球作物減產(chǎn)的主要原因[8]。2010年中國南方干旱造成云南、廣西、廣東、海南等地甘蔗大規(guī)模減產(chǎn)。研究甘蔗自身的抗逆基因功能，對研究甘蔗的抗逆機(jī)制及抗逆分子育種具有重要意義。本研究于甘蔗熱帶種Badila莖稈成熟與未成熟抑制差減文庫中篩選到一個具有完整閱讀框的EST，其推導(dǎo)蛋白具有A20/AN1鋅指結(jié)構(gòu)域，通過Smart Race法獲得了基因全長，命名為 ShSAP1 (Saccharum stress-associated protein 1)。通過甘蔗基因組DNA擴(kuò)增ShSAP1基因以確定基因內(nèi)是否具有內(nèi)含子，并通過Southern blotting分析了ShSAP1在Badila內(nèi)的拷貝數(shù)，從而對ShSAP1基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；通過半定量 RT-PCR對 ShSAP1基因在甘蔗Badila不同部位、不同莖節(jié)及高鹽脅迫、模擬干旱、脫落酸 (ABA)、赤霉素 (GA3)、乙烯利 (ET) 處理下的mRNA表達(dá)量進(jìn)行了分析，以期對ShSAP1在甘蔗成熟與逆境應(yīng)答中的功能進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

甘蔗熱帶種拔地拉 (Badila)，為本實驗室基地種植。

1.2 主要試劑

RNA plant kit、DNA消化酶購自Biomega公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas；Southern blotting試劑盒為Roche公司的DIG DNA Labeling and Detection KitⅠ；Taq DNA聚合酶、PMD18-Vector及限制性核酸內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；氨芐青霉素 (Amp)、瓊脂糖購自Sigma公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自Biomega公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)購自天根生物；ABA、ET、GA3購自上海生工；常用的化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。本研究所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

1.3 表達(dá)分析材料及處理方法

甘蔗不同部位表達(dá)分析材料：Badila成熟植株。不同脅迫和激素處理組的表達(dá)分析材料：四葉期甘蔗無菌組培苗，MS培養(yǎng)基培養(yǎng)。24 h處理組：高鹽脅迫和模擬干旱處理，將幼苗接入中含有200 mmol/L NaCl，10% (W/V) PEG6000的MS培養(yǎng)基中；激素處理，分別用100 μmol/L ABA，200 mg/L GA3，1 mmol/L ET噴施幼苗葉片；CK不做任何處理，處理后將幼苗于人工培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)，16 h光照28 ℃/8 h黑暗24 ℃，24 h后提取葉片RNA。激素時間梯度處理組：選取大小一致的幼苗，用100 μmol/L ABA、200 mg/L GA3、1 mmol/L ET進(jìn)行噴施處理，處理時間分別為3 h、6 h、12 h，處理開始于12 h處理組，同時對CK噴施同體積的無菌水，隔6 h進(jìn)行第2批處理，隔9 h進(jìn)行第3批處理，處理期間全程光照培養(yǎng)，12 h后同時提取葉片RNA。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.4 核酸提取及反轉(zhuǎn)錄

RNA提取參照Biomega RNA Plant kit說明書，取5 μg RNA按照Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，DNA提取依照CTAB法。

1.5 ShSAP1的克隆

由本實驗室莖稈成熟相關(guān) cDNA文庫中獲得ShSAP1的EST序列 (716 bp)，具有完整的ORF，經(jīng)同源序列的分析比對確定 5'端完整，以獲得的ShSAP1 5'端設(shè)計引物ShSAPP3，全長cDNA文庫噬菌體臂上的序列設(shè)計引物 PTR3，以本實驗室全長cDNA文庫庫液為模板擴(kuò)增ShSAP1 3'端cDNA序列。 PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min ；94 ℃ 30 s，59 ℃45 s，72 ℃ 1 min，4個循環(huán)；94 ℃ 30 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min ，8個循環(huán)；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，25個循環(huán)；72 ℃ 10 min 。

1.6 ShSAP1基因組全長的獲得及ShSAP1的拷貝數(shù)確定

于ShSAP1拼接序列5′末端和3′末端設(shè)計引物P1和P2，以Badila cDNA及DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 30 s，57 ℃1 min，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。以ShSAP1 cDNA 全序列為模板，依照 DIG DNA Labeling and Detection Kit Ⅰ合成探針，DNA提取如前介紹，DNA酶切電泳和轉(zhuǎn)膜方法參照文獻(xiàn)[9]，雜交及顯色參照 Roche DIG DNA Labeling and Detection Kit Ⅰ試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 半定量RT-PCR分析ShSAP1的表達(dá)模式

半定量RT-PCR反應(yīng)中的內(nèi)參基因GAPDH引物為GADPH1和GADPH2，ShSAP1的擴(kuò)增引物：ZP1和ZP2。先用內(nèi)參基因GADPH將模板調(diào)整至基本一致，選取平臺期之前的循環(huán)作為半定量RT-PCR的循環(huán)數(shù)，內(nèi)參基因和目的基因的PCR反應(yīng)條件均為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，X個循環(huán)；72 ℃ 10 min 。X表示循環(huán)數(shù)，不同部位和24 h處理組的為27個循環(huán)，12 h處理組中ABA小組為27個循環(huán)，ET和GA3小組為30個循環(huán)。每組PCR重復(fù)3次。

1.8 生物信息學(xué)分析

ShSAP1氨基酸序列經(jīng) NCBI PSI-BLAST (Position-specific iterated BLAST)，選擇有研究報道的相近序列進(jìn)行同源性分析，使用 DNAMAN和MEGA4進(jìn)行 A20/AN1結(jié)構(gòu)域比較和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗ShSAP1基因的的克隆

以本實驗室全長 cDNA文庫庫液為模板，用ShSAP-P3和 PTR3兩條引物采用降落 PCR擴(kuò)增ShSAP1的3′端，得到900 bp左右的條帶，結(jié)果如圖1所示，經(jīng)測序，該片段核苷酸序列長度為872 bp，含有25個PolyA尾，將3'端獲得序列與差減文庫中得到的5'端716 bp序列進(jìn)行拼接，得到cDNA全長1 008 bp，命名為 ShSAP1，GenBank登錄號為：HM991960，ShSAP1基因起始密碼子 ATG位于127 bp處，終止密碼TAG位于642 bp處，閱讀框為516 bp，推導(dǎo)171個氨基酸，具有A20/AN1鋅指結(jié)構(gòu)域。

圖1 Smart Race PCR擴(kuò)增ShSAP1 3′序列Fig. 1 Amplification of the 3′ sequence of ShSAP1 gene by Smart Race PCR. M: DNA maker DL2000; 1: 3′ PCR products of ShSAP1.

2.2 ShSAP1與其他植物SAP家族基因的鋅指結(jié)構(gòu)域比較與系統(tǒng)進(jìn)化分析

SAP蛋白家族具有A20/AN1鋅指結(jié)構(gòu)域特征，A20結(jié)構(gòu)位于蛋白的N端，具有Cys2/Cys2鋅指結(jié)構(gòu)，首次發(fā)現(xiàn)于人類血管內(nèi)皮細(xì)胞中的一個 TNFα-誘導(dǎo)蛋白中[10]，Linnen等在爪蟾的受精卵動物半球母系來源RNA編碼蛋白中首次鑒定AN1鋅指結(jié)構(gòu)域[11]，經(jīng)典的 AN1結(jié)構(gòu)模式為 CX(2)CX(9-12) CX(1-2)CX(4)CX(2)HX(5)HXC，X為任意氨基酸，后來的研究中把CX(4)CX(9-12)CX(1-2)CX(4)CX(2) HX(5)HXC也定義為AN1鋅指。AN1和A20結(jié)構(gòu)都參與了免疫反應(yīng)，AN1與A20鋅指常常相互連接[1,12]。OSiSAP1是植物中首次發(fā)現(xiàn)同時具有 AN1和A20鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白，研究表明OSiSAP1與逆境應(yīng)答相關(guān)，并能增強(qiáng)轉(zhuǎn)化煙草的抗逆性[13]，隨后水稻、擬南芥和番茄等植物的A20/AN1鋅指蛋白也被研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A20/AN1鋅指蛋白與植物的逆境應(yīng)答相關(guān)[6-7]。

ShSAP1編碼蛋白 N端具有一個 Cys2/Cys2鋅指，位于14~40個氨基酸之間，C端112~149氨基酸序列間具有AN1鋅指結(jié)構(gòu)域，其鋅指序列模式為CX(2)CX(10)CX(1)CX(4)CX(2)HX(5)HXC，具有相同結(jié)構(gòu)的蛋白往往行使相似的功能，為此，我們將甘蔗的ShSAP1同目前研究較清楚的其他植物SAP家族基因進(jìn)行了氨基酸序列比較及同源進(jìn)化樹分析，結(jié)果見圖2。ShSAP1具有SAP家族基因的保守鋅指結(jié)構(gòu)，與甘蔗的Sc-zf和水稻的OSiSAP8親緣關(guān)系最近。ShSAP1推導(dǎo)氨基酸序列與劉金仙等[14]于福農(nóng)22中分離得到的甘蔗鋅指蛋白基因Sc-zf氨基酸序列基本一致，而兩端非編碼區(qū)核酸序列卻有明顯差異，經(jīng) DNAMAN分析ShSAP1與Sc-zf的cDNA序列相似性為81.57%，推測ShSAP1與Sc-zf為同源基因。

2.3 ShSAP1基因結(jié)構(gòu)

以引物P1、P2從Badila cDNA與基因組DNA中擴(kuò)增ShSAP1，以驗證拼接結(jié)果的正確性，并分析ShSAP1的基因結(jié)構(gòu)。由cDNA擴(kuò)增得到1 000 bp左右的片段 (圖3A)，而從基因組DNA中可以擴(kuò)增得到2 300 bp左右的片段 (圖3B)，片段測序結(jié)果經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)由 cDNA擴(kuò)增得到的序列與之前的拼接結(jié)果吻合，由基因組DNA擴(kuò)增片段的大小為2 241 bp，為ShSAP1的基因組序列，經(jīng)GSDS網(wǎng)站(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/) 分析發(fā)現(xiàn) ShSAP1有兩段大小分別為 202 bp和 1 052 bp的內(nèi)含子位于5'UTR區(qū)，而其閱讀框則是連續(xù)的 (圖3C)。為了確定ShSAP1的拷貝數(shù)，我們以ShSAP1的cDNA序列合成探針對 Badila基因組進(jìn)行了 Southern blotting分析，結(jié)果如圖3D所示，ShSAP1的拷貝數(shù)為1~2個，為低拷貝基因。

2.4 ShSAP1的表達(dá)分析

圖2 ShSAP1推導(dǎo)蛋白與其他A20/AN1型鋅指蛋白的氨基酸序列比較及系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig. 2 Comparison of ShSAP1 A20 and AN1 zinc finger domain with other zinc-finger protein and phylogenetic tree analysis. Conserved cysteine and histidine are indicated in box. (A) Putative functional domains of ShSAP1. (B) N-terminal A20 type zinc-finger. (C) C-terminal AN1-type zinc-finger. (D) phylogenetic tree of the related zinc finger proteins. proteins used in this analysis have been studied and have A20 and AN1 zinc finger domains. Protein accession number are showed in the bracket.

圖3 ShSAP1的基因結(jié)構(gòu) (A、B、C) 與甘蔗基因組Southern blotting分析Fig. 3 Gene structure (A, B, C) and genome Southern blotting (D) of ShSAP1. (A) M: DL5000 DNA marker; 1: PCR product of ShSAP1 from cDNA. (B) M: DL5000 DNA maker; 2: PCR product of ShSAP1 from genomic DNA. (C) Two introns (indicated by line ) located in the 5′ UTR region of ShSAP1 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/). (D) Results of genome Southern blotting. Total genomic DNA was digested by Hind III (H), Xba I (X), BamH I (B).

劉金仙等對甘蔗Funong 22中克隆得到的Sc-zf進(jìn)行了表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn) Sc-zf在黑穗病菌 Ustilago scitaminea、水楊酸 (SA)、H2O2、NaCl和 PEG 脅迫下表達(dá)特性不同，受到黑穗病菌和NaCl的誘導(dǎo)，PEG的抑制，但也受SA和H2O2的影響[14]，這與前人所做的SAP家族基因在逆境下的表達(dá)特性存在差異。ShSAP1由甘蔗Badila成熟與未成熟莖稈抑制差減文庫中篩選而出，為了分析ShSAP1與Badila成熟的關(guān)系，我們選取Badila成熟植株不同部位和不同莖節(jié)進(jìn)行了表達(dá)分析，結(jié)果如圖4-A所示，ShSAP1在Badila葉片、莖及根部均有表達(dá)，隨著莖稈成熟度增加，ShSAP1的表達(dá)量也隨之升高。甘蔗3~4節(jié)為快速生長部位，同時有少量蔗糖的積累，7~8節(jié)為正在成熟的莖節(jié)，13~14節(jié)為成熟莖節(jié)，糖分趨于飽和，21~22莖節(jié)的糖分已經(jīng)飽和[15]，甘蔗在成熟過程中，糖分不斷累積，滲透物質(zhì)不斷增加，抗逆性不斷增強(qiáng)，我們推測ShSAP1基因與甘蔗的成熟和糖分累積存在一定的關(guān)系。

在無菌條件下對Badila組培苗進(jìn)行不同激素、干旱及鹽脅迫下ShSAP1的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，Badila幼苗ShSAP1的表達(dá)能被ABA、ET、GA3、模擬干旱及鹽脅迫誘導(dǎo)增強(qiáng) (圖 4B)。在 ABA、ET和 GA3處理下，ShSAP1的表達(dá)水平隨著處理時間延長持續(xù)增加，12 h內(nèi)基本達(dá)到較高水平 (圖4C)。ET和GA3是植物成熟和莖節(jié)伸長的2種重要激素，ShSAP1可能與甘蔗成熟與莖節(jié)生長有關(guān)。根據(jù)ShSAP1在模擬干旱、鹽脅迫及ABA處理下的表達(dá)模式，我們推測ShSAP1可能參與了甘蔗依賴于ABA的早期逆境應(yīng)答過程。

圖4 ShSAP1的表達(dá)模式分析Fig. 4 Expression analysis of ShSAP1. GADPH was used as internal control. (A) The expression level of different part and stalks in sugarcane. (B) Expression of ShSAP1 in sugarcane seedlings under salt (200 mmol/L), drought (10% PEG6000), GA3 (200 mg/L), ABA (100 μmol/L) and ET (1 mmol/L) after 24 h treatment. (C) Changes of ShSAP1 expression level in sugarcane seedlings under ABA (100 μmol/L), ET (1 mmol/L) and GA3 (200 mg/L) treatment within 12 h.

3 討論

A20/AN1鋅指蛋白因在動物免疫應(yīng)答中具有重要作用而被廣泛研究，轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB (Nuclear factor kappa enhancer binding protein) 在細(xì)胞凋亡、免疫和炎癥反應(yīng)中起著相當(dāng)作用[16]。A20鋅指N端具有去泛素化酶活性，C端具有泛素連接酶活性，IκB是核因子NF-κB的抑制子。A20鋅指一方面通過泛素連接酶與IκB激酶IKK作用使其降解，阻止IκB磷酸化；另一方面通過去泛素化IκB-26S蛋白酶復(fù)合體，阻止IκB降解，從而抑制NF-κB的活性，降低過敏性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡[2,10-12,17]。植物中的 SAP家族，目前研究較為深入的有水稻的 OsiSAP1、ZFP177、OsiSAP8、擬南芥的 AtSAP12、獐毛的AlSAP[13,18-21]，上述水稻的 SAP基因均參與了水稻逆境應(yīng)答，應(yīng)答模式有所差異，SAP1和SAP8與干旱和鹽脅迫密切相關(guān)，在煙草和水稻中過表達(dá)OsiSAP1和 OsiSAP8能顯著提高轉(zhuǎn)化植株的抗鹽抗旱性，OsiSAP8定位于細(xì)胞質(zhì)，酵母雙雜交表明OsiSAP8的 A20與自身和 AN1具有相互作用[18]；ZFP177則在高溫和凍害應(yīng)答中起作用，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)，過表達(dá)ZFP177能提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗凍抗高溫能力[19]。研究者推測水稻SAP家族可能通過泛素蛋白酶途徑降低逆境對植物造成傷害，如通過降解細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵因子來增強(qiáng)植物抗逆性[18]。AtSAP12具有2個AN1結(jié)構(gòu)域，在凍害和鹽脅迫下表達(dá)增強(qiáng)，其蛋白構(gòu)象能被氧化還原劑改變，研究者推測SAP12是一個氧化還原劑感應(yīng)器，通過構(gòu)象變化與蛋白結(jié)合，作為激活子或抑制子來調(diào)控信號傳遞[20]。鹽土植物獐毛AlSAP的表達(dá)水平能被高鹽、干旱、冷凍、高溫及ABA和SA誘導(dǎo)增強(qiáng)，過表達(dá)AlSAP可提高煙草的抗旱和抗鹽能力，轉(zhuǎn)化植株的 ROS清除系統(tǒng)和滲透保護(hù)的基因表達(dá)也相對增強(qiáng)[21]。A20/AN1鋅指蛋白可能屬于植物逆境信號通路中的上游調(diào)控因子，通過抑制或激活信號傳遞相關(guān)蛋白進(jìn)而調(diào)控下游基因表達(dá)，SAP家族基因在植物抗逆基因過程中具有很好的應(yīng)用前景，但其作用的分析機(jī)制仍然需要進(jìn)一步研究。

甘蔗在成熟過程中，伴隨著糖分等滲透物質(zhì)的不斷累積，抗逆性不斷增強(qiáng)，ShSAP1可能參與了甘蔗成熟相關(guān)如可溶性糖累積等過程。根據(jù) ShSAP1在ET、GA3、ABA、干旱和鹽脅迫的表達(dá)分析結(jié)果，我們推測 ShSAP1可能參與了 ET、GA3的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在干旱和鹽脅迫下參與了早期依賴于ABA的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)從而調(diào)控下游基因的表達(dá)。ShSAP1在甘蔗成熟與逆境應(yīng)答中的功能及其調(diào)控機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究，包括下游調(diào)控基因網(wǎng)絡(luò)及轉(zhuǎn)基因分析等。本文對ShSAP1的基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)模式進(jìn)行了分析，為ShSAP1的功能研究打下了基礎(chǔ)。

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