周麗，田康明，左志銳，陳獻(xiàn)忠，石貴陽，Suren Singh，王正祥

1 江南大學(xué)生物工程學(xué)院 生物資源與生物能源研究中心 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122

2 Department of Biotechnology and Food Technology, Durban University of Technology, Durban, South Africa

乳酸是世界上公認(rèn)的三大有機(jī)酸之一，乳酸及其衍生物在釀造、食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、化工、皮革、煙草、印染、紡織等行業(yè)中用途廣泛。乳酸異構(gòu)體之一——D-乳酸是一種重要的手性中間體，同時也是合成生物可降解聚乳酸塑料的原料之一，其添加量對聚乳酸產(chǎn)品的機(jī)械強(qiáng)度、熱穩(wěn)定性等影響很大。隨著人們環(huán)保意識的提升，聚乳酸高分子材料研究活躍，乳酸成為一個極具潛力的化學(xué)品，并有望成為繼檸檬酸之后的又一大宗發(fā)酵產(chǎn)品。然而，外消旋型及低光學(xué)純度、低化學(xué)純度的乳酸在很多領(lǐng)域的應(yīng)用受到限制，人們期望獲得以高產(chǎn)量、高底物轉(zhuǎn)化率、高生產(chǎn)強(qiáng)度生產(chǎn)高化學(xué)純度和光學(xué)純度D-乳酸的方法。

大腸桿菌Escherichia coli可發(fā)酵產(chǎn)生高光學(xué)純度的D-乳酸，且生長速度快、營養(yǎng)需求簡單。與乳酸細(xì)菌相比，重組大腸桿菌作為乳酸生產(chǎn)菌株的優(yōu)越之處在于其轉(zhuǎn)化率常?？沙^ 90%[1]。作為基因操作工具菌，E. coli遺傳背景清楚，易于進(jìn)行基因操作，尤其是近年來大腸桿菌基因敲除技術(shù)的快速發(fā)展[2]，使得應(yīng)用代謝工程策略在大腸桿菌中積累乳酸更易行。現(xiàn)有研究表明，具有pta和ppc基因突變的菌株JP203在有氧條件下生長到10 g/L干重菌體 (DWC)，再厭氧發(fā)酵，產(chǎn)生62 g/L D-乳酸，轉(zhuǎn)化率達(dá)0.9 g/g，體積生產(chǎn)速度達(dá)1.0 g/(L·h)[3]。日本研究者[4]發(fā)現(xiàn)E. coli的pflA或pflB基因突變株，在微好氧條件下可以由葡萄糖生產(chǎn)大量的D-乳酸。進(jìn)一步構(gòu)建pykF、ppc、pflA、pta和adhE單基因刪除突變菌株，表明pta、ppc基因突變也能顯著提高菌株D-乳酸的產(chǎn)量[5]。Zhu等[1]刪除了E. coli YYC202 (具有 aceEF、pfl、poxB、pps基因突變) 菌株的frdABCD基因，獲得菌株ALS974，以乙酸和葡萄糖為底物生產(chǎn)了138 g/L D-乳酸，轉(zhuǎn)化率為97%，生產(chǎn)強(qiáng)度為6.3 g/(L·h)，并可以控制琥珀酸雜酸含量在3 g/L (表3)。菌株TG114能夠合成99.9%以上光學(xué)純度的D-乳酸，該菌株在含有1 mmol/L甜菜堿的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中能將12% (W/V) 葡萄糖轉(zhuǎn)化為118 g/L乳酸，轉(zhuǎn)化率達(dá)98%[6](表3)。

同時，我們注意到，菌株 ALS974雖已具有良好的生產(chǎn)性能，但需要以乙酸作為發(fā)酵原料，勢必增加了生產(chǎn)成本。菌株TG114需要添加滲透壓保護(hù)劑，培養(yǎng)條件要求較高。此外，在產(chǎn)酸階段需通入氮?dú)鈦砜刂平^對厭氧環(huán)境，也使得工藝條件復(fù)雜，生產(chǎn)成本高。針對以上問題，本中心以一株生長快速的野生型E. coli CICIM B0013作為代謝途徑改造的出發(fā)菌株，該菌株是本中心 (http://cicim-cu. jiangnan.edu.cn/) 前期研究中篩選得到的[7]。在本研究前期工作中以 B0013為出發(fā)菌株構(gòu)建了具有ackA-pta、pps和pflB基因 (以葡萄糖為底物發(fā)酵乳酸的主要代謝反應(yīng)見圖1) 突變的菌株B0013-030。本研究在B0013-030的基礎(chǔ)上刪除了其琥珀酸合成途徑 (frdA基因) 獲得菌株B0013-040B，進(jìn)而又刪除了乙酸合成途徑 (tdcD和 tdcE基因) 獲得菌株B0013-050B。經(jīng)兩階段乳酸發(fā)酵搖瓶實(shí)驗(yàn)，對比了野生型菌株 B0013與其突變株 B0013-030、B0013-040B和B0013-050B在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，以葡萄糖為唯一碳源，生產(chǎn)D-乳酸的性能。并進(jìn)一步將菌株B0013-040B和B0013-050B進(jìn)行發(fā)酵罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，考察它們的D-乳酸發(fā)酵性能。在發(fā)酵過程不添加特殊底物，厭氧階段不需以氮?dú)?、氫氣等惰性氣體控制厭氧環(huán)境。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒與引物

菌株Escherichia coli CICIM B0013由本中心篩選、保藏 (http://cicim-cu.jiangnan.edu.cn/)，菌株B0013-030由本研究前期構(gòu)建；質(zhì)粒pKD46 (溫度敏感型，含有阿拉伯糖啟動子調(diào)控的gam、bet和exo基因，Ampr) 購于CGSC[2]，pSK-EcdifGm (含有兩邊帶有dif位點(diǎn)[8]的慶大霉素抗性基因、Ampr、Gmr)由本研究前期構(gòu)建。本文所用菌株、質(zhì)粒及引物序列見表1。

pMD18-Tsimple、T4 DNA聚合酶為TaKaRa (大連) 公司產(chǎn)品，各種限制性內(nèi)切酶為 Fermentas產(chǎn)品，Taq酶、質(zhì)粒提取、純化和膠回收試劑盒為Biodev公司產(chǎn)品。

1.2 D-乳酸搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法

一級種子的制備：在LB平板上生長了24 h的單菌落接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基中 (在250 mL三角瓶中)，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)10 h。

二級種子的制備：離心收集一級種子菌體，并以0.1 g/L (菌體干重/培養(yǎng)基體積) 的接種量轉(zhuǎn)接于含5 g/L葡萄糖的50 mL改良M9液體培養(yǎng)基中 (在250 mL三角瓶中)，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)10 h。

表1 本研究中所使用的菌株、質(zhì)粒和引物Table 1 Strains, plasmids and primers used in this study

圖1 大腸桿菌菌株發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)乳酸過程中的主要代謝反應(yīng)Fig. 1 General reactions in lactate fermentation from glucose by Escherichia coli strains. pps: PEP synthase; pfl: pyruvate formate lyase; tdcE: pyruvate formate-lyase, homologous to pflB; pdh: pyruvate dehydrogenase complex; ppc: PEP carboxylase; ldhA: fermentative D-lactate dehydrogenase; poxB: pyruvate oxidase; acs: acetyl-CoA synthetase; pta: phosphotransacetylase; ackA: acetate kinase; tdcD: propionate kinase: homologous to ackA; adhE: alcohol dehydrogenase; mdh: malate dehydrogenase; fumABCD: fumarate hydratase; frdABCD: fumarate reductase; aceA: isocitrate lyase; aceB: malate synthase A.

搖瓶發(fā)酵：以 5%接種量將二級種子轉(zhuǎn)接于含有5 g/L葡萄糖的50 mL新鮮改良M9培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min好氧培養(yǎng)菌體12 h；厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸階段，補(bǔ)加15 g/L葡萄糖和40 g/L CaCO3，37 ℃靜置培養(yǎng)36 h。

一級種子培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基，二級種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基都為補(bǔ)加了一定濃度葡萄糖的改良M9液體培養(yǎng)基。改良M9培養(yǎng)基的基本成分為：每升M9液體培養(yǎng)基[10]補(bǔ)加1 mL 1 mol/L MgSO4和1 mL微量元素母液。微量元素母液成分 (g/L)：2.400 FeCl3·6H2O，0.300 CoCl2·6H2O，0.150 CuCl2·2H2O，0.300 ZnCl2，0.300 Na2MO4·2H2O，0.075 H3BO3，0.495 MnCl2·4H2O。

1.3 D-乳酸發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)方法

一級種子的制備：在LB平板上生長了24 h的單菌落接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基中 (在250 mL三角瓶中)，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)10 h。

二級種子的制備：離心收集一級種子菌體，并以0.1 g/L (菌體干重/培養(yǎng)基體積) 的接種量轉(zhuǎn)接于含5 g/L葡萄糖的150 mL改良M9液體培養(yǎng)基中(在500 mL三角瓶中)，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)9 h。

發(fā)酵罐發(fā)酵：將上述二級種子液轉(zhuǎn)接于7 L發(fā)酵罐 (Bioflo110；New Brunswick Scientific Co.，Edison，NJ)，接種量為0.062 g/L (菌體干重/培養(yǎng)基體積)，發(fā)酵培養(yǎng)基為改良M9培養(yǎng)基，接種后發(fā)酵液總體積為3 L，初始葡萄糖濃度為30 g/L。第一階段為好氧菌體生長階段，初始空氣通量為3 L/min，攪拌轉(zhuǎn)速為 200 r/min，將此時溶解氧濃度標(biāo)定為100%，發(fā)酵過程中調(diào)節(jié)通氣量直至7 L/min，并將攪拌轉(zhuǎn)速與 DO值關(guān)聯(lián)來維持溶解氧濃度大于30%；用NH4OH和10% (V/V) H2SO4維持pH值為7.0，并控制發(fā)酵溫度為37 ℃。當(dāng)菌體濃度在600 nm的吸光度 (OD600) 達(dá)到30時，即進(jìn)入第二階段，厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸階段。在第二階段中，將通氣量調(diào)零，攪拌轉(zhuǎn)速控制為100 r/min，用250 g/L Ca(OH)2懸濁液控制pH值為7.0，發(fā)酵溫度控制為37 ℃，并補(bǔ)加濃度為600 g/L的葡萄糖，補(bǔ)加的葡萄糖干物質(zhì)量為140 g，當(dāng)發(fā)酵過程中殘?zhí)菨舛冉禐?0 g/L左右，再次補(bǔ)加相同量的葡萄糖，共補(bǔ)加 4批次，當(dāng)所有4批補(bǔ)加的葡萄糖耗盡后即結(jié)束發(fā)酵。

1.4 分析方法

1.4.1 菌體量測定方法

菌體密度采用濁度法間接測量，通過 OD600來表示，并通過下列公式換算為菌體干重 (X)：

X (g/L)=0.382×OD600。

1.4.2 葡萄糖測定方法

葡萄糖用SBA-40C葡萄糖生物傳感儀 (山東省科學(xué)院生物研究所) 進(jìn)行分析。

1.4.3 進(jìn)行高效液相分析的發(fā)酵液樣品預(yù)處理方法

用 5% (V/V) 樣品體積的濃硫酸將發(fā)酵液樣品酸化，釋放由 Ca(OH)2中和的有機(jī)酸，離心去除CaSO4沉淀后用等體積 100 g/L三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)行高效液相產(chǎn)物分析。

1.4.4 有機(jī)酸測定方法

有機(jī)酸含量用高效液相色譜進(jìn)行分析，檢測器為UV (210 nm) 檢測器，色譜柱為SH1011 (Shodex)，流動相為0.01 mol/L H2SO4，流速為0.6 mL/min，柱溫50 ℃。

1.4.5 乙醇測定方法

乙醇含量用高效液相色譜進(jìn)行分析，檢測器為示差檢測器，色譜柱為SH1011 (Shodex)，流動相為0.01 mol/L H2SO4，流速為0.6 mL/min，柱溫50 ℃。1.4.6 乳酸光學(xué)純度測定方法

乳酸光學(xué)純度用高效液相色譜進(jìn)行分析，檢測器為UV (254 nm)檢測器，色譜柱為CLC-L手性柱(Advanced Separation Technologies Inc.)，流動相為5 mmol/L CuSO4，流速為1.0 mL/min，柱溫為室溫。

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌CICIM B0013-030菌株frdA基因的刪除

以FrdA1、FrdA2為引物，PCR擴(kuò)增大腸桿菌的 frdA基因片段 (1.6 kb)，PCR產(chǎn)物克隆入質(zhì)粒pSKsym 的 SmaⅠ酶切位點(diǎn)中，獲得重組質(zhì)粒pSKsym-frdA’。該重組質(zhì)粒用PstⅠ酶切 (去除frdA基因中部部分序列)，并用T4 DNA聚合酶使粘性末端平滑化，再克隆入 dif-Gm 片段 (重組質(zhì)粒pSK-EcdifGm用SmaⅠ酶切，膠回收1.0 kb大小片段，即獲得 dif-Gm 基因片段) 獲得重組質(zhì)粒pSKsym-frdA’::difGm。質(zhì)粒pSKsym-frdA’::difGm用EcoRⅠ酶切，并膠回收1.3 kb frdA’::difGm基因片段。以該片段為模板，再次用引物FrdA1、FrdA2 PCR擴(kuò)增，獲得高濃度的frdA’::difGm突變盒基因片段，經(jīng)試劑盒純化后電擊轉(zhuǎn)化含有輔助質(zhì)粒pKD46并經(jīng)2 mmol/L L-阿拉伯糖誘導(dǎo)的目的菌株B0013-030，在慶大霉素抗性平板篩選具有frdA基因突變的轉(zhuǎn)化子，并用引物FrdA1、FrdA3菌落PCR驗(yàn)證，轉(zhuǎn)化子B0013-041B (B0013-030，frdA::difGm) 獲得1.8 kb大小電泳圖譜 (圖 2)。該轉(zhuǎn)化子進(jìn)一步在無抗生素的LB液體培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，使 Gm基因兩端的dif位點(diǎn)重組，環(huán)化去除Gm基因，并挑選慶大霉素抗性丟失的菌株用引物FrdA1、FrdA3菌落PCR擴(kuò)增frdA突變基因進(jìn)行驗(yàn)證，轉(zhuǎn)化子 B0013-040B (B0013-030，frdA::dif) 獲得0.8 kb大小電泳圖譜(如圖2)，而原始菌株B0013 PCR產(chǎn)物電泳圖譜大小為2.1 kb (圖2)，即菌株B0013-030的frdA部分基因已被dif序列替換。

圖2 frdA基因突變轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定電泳圖Fig. 2 Identification of frdA gene mutants by PCR. 1: B0013 PCR product; 2: B0013-041B PCR product; 3: B0013-040B PCR product; 4: λ DNA/Pst I marker.

2.2 大腸桿菌CICIM B0013-040B菌株tdcDE基因的刪除

以TdcDE1、TdcDE2為引物，PCR擴(kuò)增大腸桿菌的 tdcDE基因片段 (2.8 kb)，PCR產(chǎn)物克隆入pMD18-Tsimple載體中，獲得重組質(zhì)粒T-tdcDE’。該重組質(zhì)粒用Hind III酶切 (去除tdcDE基因中部部分序列)，并補(bǔ)平粘性末端，克隆入dif-Gm片段獲得重組質(zhì)粒T-tdcDE’::difGm。質(zhì)粒T-tdcDE’::difGm用引物TdcDE1、TdcDE2 PCR擴(kuò)增，并膠回收1.5 kb tdcDE’::difGm基因片段。將tdcDE’::difGm突變盒基因片段電擊轉(zhuǎn)化含有輔助質(zhì)粒 pKD46并經(jīng) L-阿拉伯糖誘導(dǎo)的目的菌株B0013-040B，在慶大霉素抗性平板篩選具有tdcDE基因突變的轉(zhuǎn)化子，并用引物TdcDE3、TdcDE2菌落 PCR驗(yàn)證，轉(zhuǎn)化子 B0013-051B (B0013-040B，tdcDE::difGm) 獲得1.5 kb大小電泳圖譜 (圖3)。該轉(zhuǎn)化子進(jìn)一步在無抗生素的LB液體培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，去除 Gm基因，并挑選慶大霉素抗性丟失的菌株用引物TdcDE3、TdcDE2菌落PCR進(jìn)行驗(yàn)證，轉(zhuǎn)化子B0013-050B (B0013-040B，tdcDE::dif) 獲得0.6 kb大小電泳圖譜 (圖3)，而原始菌株B0013 PCR產(chǎn)物電泳圖譜大小為2.9 kb (圖3)，即菌株B0013-030的tdcDE部分基因已被dif序列替換。

圖3 tdcDE基因突變轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定電泳圖Fig. 3 Identification of tdcDE gene mutants by PCR. 1: λ DNA/Pst I marker; 2: B0013 PCR product; 3: B0013-051B PCR product; 4: B0013-050B PCR product.

2.3 D-乳酸搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

菌株B0013、B0013-030、B0013-040B和B0013-050B經(jīng)兩階段搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，各產(chǎn)物含量和乳酸轉(zhuǎn)化率如表2所示。野生型菌株B0013經(jīng)兩階段搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，獲得9.6 g/L D-乳酸，乙酸和琥珀酸是主要的副產(chǎn)物，此外還有甲酸、丙酮酸和乙醇積累，由于這些副產(chǎn)物的大量合成，厭氧階段乳酸轉(zhuǎn)化率僅為 51.0% (厭氧階段乳酸轉(zhuǎn)化率=厭氧階段乳酸產(chǎn)量/厭氧階段葡萄糖消耗量，表2)。菌株B0013-030丙酮酸積累量因其分解代謝支路的受阻而有所增加，乙酸產(chǎn)量顯著降低了 63.5%，不形成甲酸，副產(chǎn)物合成量的減少為乳酸的合成節(jié)約了碳源，D-乳酸產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了31.9%，厭氧階段乳酸轉(zhuǎn)化率因而增加了45.1% (表2)。然而菌株B0013-030所合成的琥珀酸副產(chǎn)物含量仍高達(dá)乳酸含量的11.9%，本文在菌株 B0013-030中刪除了琥珀酸合成途徑(frdA基因)，使得琥珀酸含量顯著降低了80.8%， D-乳酸產(chǎn)量進(jìn)一步增加了 12.2%，轉(zhuǎn)化率升高了16.5% (表2)。為了進(jìn)一步降低菌株B0013-040B的乙酸含量，我們一次性刪除了其tdcD和tdcE基因，獲得菌株B0013-050B。tdcDE基因的刪除將乙酸的含量降低了 23.8%，而對其他產(chǎn)物的含量無顯著影響 (表 2)。在搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中各菌株乙醇的合成量很少，且無顯著差異 (表2)。

2.4 菌株CICIM B0013-040B發(fā)酵罐發(fā)酵D-乳酸性能

經(jīng)兩階段發(fā)酵罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，菌株B0013-040B好氧生長約9.5 h，OD600達(dá)到30，厭氧發(fā)酵階段僅耗時26 h (圖4A)。

好氧菌體生長階段即積累了 5.6 g/L的乳酸和8.8 g/L的乙酸，進(jìn)入?yún)捬醢l(fā)酵階段后快速產(chǎn)生乳酸(圖 4A)，發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液中葡萄糖耗盡，乳酸含量高達(dá)114.5 g/L。在厭氧階段初期副產(chǎn)物乙酸繼續(xù)產(chǎn)生，并在發(fā)酵過程中逐漸被消耗，發(fā)酵結(jié)束時乙酸含量達(dá)5.4 g/L，成為發(fā)酵液中的主要副產(chǎn)物。其他副產(chǎn)物如琥珀酸、丙酮酸和乙醇的含量在整個發(fā)酵過程中都較低，發(fā)酵液中不能檢測出甲酸，如圖4A和表3。此外，菌株B0013-040B厭氧階段葡萄糖對乳酸的轉(zhuǎn)化率為 83.0%，乳酸單位體積生產(chǎn)速率達(dá)4.6 g/(L·h) (厭氧階段乳酸體積生產(chǎn)速率=厭氧階段乳酸產(chǎn)量/發(fā)酵液體積/厭氧發(fā)酵時間，表3)。

2.5 菌株CICIM B0013-050B發(fā)酵罐發(fā)酵D-乳酸性能

在兩階段發(fā)酵罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，菌株B0013-050B的好氧生長速度受到tdcDE基因突變的影響，好氧生長至OD600值為20左右時，溶氧濃度突然上升，菌體生長速度開始變慢，同時對中和劑氨水的需求量增加，表明產(chǎn)酸速度開始變快，此時菌體微環(huán)境更類似于厭氧發(fā)酵，因此OD600值達(dá)到25.4即人工將其轉(zhuǎn)入?yún)捬醢l(fā)酵階段。厭氧發(fā)酵階段耗時18 h (圖4B)，顯著快于B0013-040B。

表2 各菌株兩階段搖瓶發(fā)酵D-乳酸性能比較Table 2 Comparison of E. coli strains for D-lactate production using shake flask fermentationa

圖4 兩階段發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸過程中各產(chǎn)物的變化Fig. 4 Productions of organic compounds during the two-phase lactate fermentation. The figure shows concentrations of lactate (■), acetate (○), succinate (▲), pyruvate (□), and ethanol (◆). (A) Strain B0013-040B. (B) Strain B0013-050B.

表3 同型D-乳酸發(fā)酵重組大腸桿菌比較Table 3 Comparison of D-lactate producing E. coli strains

好氧菌體生長階段有少量的乳酸及副產(chǎn)物產(chǎn)生，乙酸的合成量僅為0.3 g/L。進(jìn)入?yún)捬醢l(fā)酵階段后快速積累乳酸 (圖 4B)，厭氧發(fā)酵末期高濃度乳酸、Ca(OH)2中存在的雜質(zhì)以及有粘性的葡萄糖使得發(fā)酵液產(chǎn)生結(jié)晶，因此提前結(jié)束發(fā)酵，菌株B0013-050B發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液中尚存在一定濃度的葡萄糖，乳酸含量達(dá)111.9 g/L，厭氧階段乳酸單位體積生產(chǎn)速率高達(dá)6.2 g/(L·h) (表3)。發(fā)酵液中無甲酸積累，僅有少量的琥珀酸、丙酮酸和乙醇積累，如表 3。通過抑制好氧階段乙酸的生成量，發(fā)酵結(jié)束時，菌株B0013-050B僅積累0.4 g/L乙酸。

2.6 發(fā)酵液D-乳酸光學(xué)純度的測定

經(jīng)高效液相分析，發(fā)酵液中D-乳酸與L-乳酸含量之比大于99.9%。

3 討論

在厭氧條件下，大腸桿菌糖酵解途徑中產(chǎn)生的大量NADH不能通過電子傳遞鏈進(jìn)行氧化，須通過還原丙酮酸為還原末端產(chǎn)物 (如乳酸、乙醇、琥珀酸等) 來釋放，實(shí)現(xiàn)NAD+的回復(fù)利用并維持氧化還原平衡 (如圖 1)。然而，野生型大腸桿菌中大量還原末端產(chǎn)物的產(chǎn)生減少了用于生成乳酸的碳架，并降低了乳酸產(chǎn)品的化學(xué)純度，增加了后續(xù)純化成本。

菌株B0013-030中，編碼乙酸激酶 (ackA) 和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶 (pta) 基因的刪除大幅度降低了副產(chǎn)物乙酸合成 (表2)；編碼丙酮酸甲酸裂解酶基因 (pflB)和編碼磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因 (pps) 的刪除阻斷了與乳酸脫氫酶競爭利用丙酮酸的代謝途徑 (圖1)，代謝流在丙酮酸代謝節(jié)點(diǎn)進(jìn)行重新分配，使得乳酸合成代謝流增加，乳酸產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率得到大幅度提高 (表2)。

大腸桿菌厭氧條件下琥珀酸產(chǎn)生的主要途徑為：葡萄糖經(jīng)EMP途徑形成磷酸烯醇式丙酮酸，再進(jìn)一步代謝為草酰乙酸 (由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化；ppc基因編碼)、蘋果酸、富馬酸，并形成琥珀酸。ppc基因刪除能夠完全去除琥珀酸的合成，但突變菌株不能在以葡萄糖為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基上生長[1,11]。富馬酸還原酶催化富馬酸合成琥珀酸 (圖1)，由A、B、C、D四個亞基構(gòu)成，frdABCD基因編碼。本研究只刪除了frdA基因即使得該酶所催化的代謝途徑阻斷。所獲得菌株B0013-040B的琥珀酸合成量顯著降低了，僅經(jīng)乙醛酸循環(huán)等代謝途徑合成少量的琥珀酸以維持其生長需求。

大腸桿菌以葡萄糖為底物厭氧發(fā)酵過程中，主要經(jīng)丙酮酸甲酸裂解酶途徑合成乙酰-CoA，進(jìn)而經(jīng)磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶途徑合成乙酰磷酸，乙酸主要是由乙酰磷酸經(jīng)乙酸激酶合成的 (圖 1)。雖然菌株B0013-040B已具有ackA、pta和pflB基因突變，其乳酸發(fā)酵產(chǎn)物中，乙酸含量仍高達(dá)5.4 g/L。tdcD基因編碼丙酸激酶，同時具有乙酸激酶的活性；與tdcD基因相鄰且同一操縱子的tdcE基因與pflB基因相似[12-13]，編碼 α-酮戊二酸裂解酶，同時具有丙酮酸甲酸裂解酶的活性。在菌株KJ091中刪除tdcDE基因使得乙酸含量降低了50%[14]。本文刪除tdcDE基因后，所獲得的菌株B0013-050B乙酸的含量比菌株B0013-040B降低了93.2%。說明除ACK、PTA途徑外，TDC途徑是乙酸合成的主要途徑。

即使在氧供應(yīng)充足的情況下，如果糖消耗速率大于將還原力重新氧化的速率，則細(xì)胞的代謝行為更類似于在厭氧條件下的，這一現(xiàn)象被稱為過速代謝。雖然這一機(jī)制尚不清楚，較為合理的解釋稱：由乙酰-CoA合成乙酸不產(chǎn)生 NADH，而乙酰-CoA流經(jīng)TCA循環(huán)會產(chǎn)生8個NAD(P)H和2個FADH2，所以合成乙酸可以被視為一個降低NAD(P)H積累的方式[15]。菌體在對數(shù)生長中后期快速生長，耗糖速率高，乙酸在這一時期大量產(chǎn)生 (如菌株B0013-040B)。而菌株B0013-050B因具有tdcDE基因突變，不能通過形成乙酸來降低 NAD(P)H的合成，促使細(xì)胞內(nèi)NADH/NAD+的水平進(jìn)一步增加，菌體代謝因此類似于在厭氧條件下的，生長速度開始變得緩慢，溶解氧濃度逐漸上升。然而，溶解氧濃度的上升相對于細(xì)胞內(nèi)的變化是有滯后性的，當(dāng)人為將發(fā)酵階段轉(zhuǎn)變?yōu)閰捬蹼A段時，細(xì)胞內(nèi)的 NADH/NAD+的水平已積累到很高，以至于菌體快速將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸，來降低NADH/NAD+的水平。而NADH的產(chǎn)生與糖酵解是同步的，高的產(chǎn)酸速率帶來高的耗糖速率和NADH產(chǎn)生速率，如此形成良性循環(huán)。因此，菌株B0013-050B 在厭氧階段的乳酸生產(chǎn)速率遠(yuǎn)快于B0013-040B的。

與表3所列出的相關(guān)研究比較，本文所構(gòu)建的重組菌株 B0013-050B未經(jīng)過基于菌體生長速度的代謝進(jìn)化[16]即具有較快的生長速度，且利用無機(jī)鹽培養(yǎng)基，以葡萄糖為唯一碳源，不需添加特殊底物和保護(hù)劑，合成光學(xué)純度的D-乳酸，發(fā)酵周期較短，乳酸產(chǎn)量較高，副產(chǎn)物含量能夠維持在較低水平，具有較優(yōu)良的生產(chǎn)性能。

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