由美國、中國和意大利的研究人員組成的研究小組最新研究發(fā)現(xiàn)，蜂王發(fā)育這一表觀遺傳現(xiàn)象可部分地歸因于蜂王漿中含有的組蛋白脫乙酰酶抑制劑（HDACi）活性，而蜂王漿中的10-HDA可能是承擔這一活性的主要物質(zhì)。此研究是繼蜂王漿含有的營養(yǎng)物質(zhì)在級型分化中起作用之后，首次從表觀遺傳調(diào)控因子角度探索蜂王漿中起作用的活性物質(zhì)。這一結(jié)果在線發(fā)表在今年2月18日的EMBO雜志上。

蜜蜂蜂王和工蜂間的分化是由于幼蟲得到的食物不同而引發(fā)的。前三天，所有幼蟲都食用蜂王漿。此后，工蜂幼蟲的食譜開始以蜂蜜和花粉為主，而蜂王幼蟲繼續(xù)享用蜂王漿，并且得到充足的飼喂。這蜂王食譜使得蜂王與工蜂在形態(tài)、行為和生理方面都差別巨大，并且具有比普通工蜂長約20倍的壽命。這一食物攝入有多方面的影響：激活胰島素信號級聯(lián)反應，影響大腦釋放激素，調(diào)控整體的表觀遺傳改變。蜂王漿在其中扮演著關(guān)鍵的角色。蜂王漿成分復雜，包括水、蛋白質(zhì)類物質(zhì)、脂肪酸、糖類、維生素和礦物質(zhì)。到目前為止，對蜂王漿含有的在級型分化過程中起作用的物質(zhì)的認識主要是蛋白質(zhì)和糖類等營養(yǎng)作用成分。研究表明，蜂王表型是由表觀遺傳機制引起的。此課題組發(fā)現(xiàn)蜂王漿具有表觀遺傳活性，研究人員把承擔這一活性的組分定位到了10-HDA。

在哺乳動物中，營養(yǎng)通過影響基因組的表觀遺傳狀態(tài)，直接調(diào)控基因表達和發(fā)育。維持表觀遺傳狀態(tài)的酶包括DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白乙酰化酶和脫乙酰酶，以及組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶和脫甲基酶。其中任何一種酶都能成為營養(yǎng)因子的靶標。對蜂王和工蜂大腦DNA甲基化模式進行比較，發(fā)現(xiàn)甲基化的CpGs數(shù)量沒有差別，但甲基化位點卻不盡相同，尤其是在外顯子區(qū)，這就會影響可變剪接。此外，小干擾RNA導致的新孵化的蜜蜂幼蟲Dnmt3水平的下降使得該幼蟲發(fā)育成具有充分發(fā)育的卵巢的蜂王。因此，對蜜蜂幼蟲注射Dnmt3 siRNA可以代替蜂王漿攝入對蜜蜂級型發(fā)育軌道產(chǎn)生的影響。這些研究表明蜂王漿的某組分有調(diào)控表觀遺傳途徑的能力。該課題組根據(jù)RNA引起的蜜蜂幼蟲Dnmt3水平的下降導致該幼蟲發(fā)育成蜂王這一結(jié)果，推測蜂王漿具有調(diào)控DNA甲基化的活性。他們便利用K-ras-transformed NIH 3T3細胞報告系統(tǒng)檢測2種濃度的蜂王漿（0.5%和1%）的表觀遺傳調(diào)控活性。發(fā)現(xiàn)這兩種濃度的蜂王漿與一種DNA甲基化抑制因子——5-Aza作用相似。然后，用一個超濾膜分餾王漿中3 kDa的組分，試驗表明其中＜3kDa低分子量的組分具有與5-Aza相似的作用。這一結(jié)果——以及蛋白激酶K處理王漿沒有降低王漿此活性——表明蜂王漿具有表觀遺傳調(diào)控活性，且活性組分可能是一種非蛋白源的小分子。

接著，該課題組就把目標定到了蜂王漿中的小分子——10-HDA，因為它是蜂王漿的主要組分之一，占干物質(zhì)的2%～6%，已有證據(jù)表明其在哺乳動物細胞具有生物學效力。于是，他們再一次利用K-ras-transformed NIH 3T3細胞報告系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)5mMd 10HDA溶液的確具有表觀遺傳調(diào)控活性。

為了證明10-HDA的表觀遺傳活性并非限于在K-ras-transformed NIH 3T3細胞報告系統(tǒng)，他們在第二個表觀遺傳報告系統(tǒng)——GF2-4細胞報告系統(tǒng)中檢測了10-HDA的活性，這個系統(tǒng)基于重新激活一個具有高度CpG甲基化而沉默的GFP基因。他們單獨用10-HDA或10-HDA與5-Aza的混合物分別處理細胞，發(fā)現(xiàn)10-HDA不能獨自激活沉默的GFP位點，但能與5-Aza進行功能協(xié)同從而加強GFP位點的表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)10-HDA與丁酸鈉作用方式相似，丁酸鈉是一個被廣泛證明的HDACi。這些數(shù)據(jù)表明10-HDA本身不具有DNA脫甲基物質(zhì)的功能，但是參與一個抑制基因轉(zhuǎn)錄的途徑，這一途徑與DNA甲基化途徑平行。

他們又在第三個模型系統(tǒng)——SW48細胞（一個人類克隆癌細胞系）報告系統(tǒng)中進行了研究，結(jié)果得到了和第二個系統(tǒng)相同的結(jié)果，即10-HDA不能獨自激活沉默的GFP位點，但可明顯加強5-Aza激活GFP的能力。此外，在此細胞系，蜂王漿和10-HDA都能重激活表觀遺傳沉默的p21的表達。為直接檢測10-HDA能否抑制DNA甲基化，他們對LINE-1（long interspersed nuclear element）重復元件進行測序，檢測細胞整體的甲基化情況。結(jié)果，5-Aza處理組DNA甲基化水平降低了50%，而10-HDA不能獨自降低LINE-1DNA甲基化水平，也不能增強5-Aza的效力。況且，蜂王漿處理（0.4%和4%，v/v）也沒有對LINE-1元件的DNA甲基化水平產(chǎn)生影響。

他們又檢測了10-HDA處理后CMV啟動子的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)沒有降低。因此，10-HDA不是一個DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制物。那么，有可能10-HDA不是表觀遺傳因子的直接調(diào)控者，而是干擾超細胞信號調(diào)控激酶（ERK）或磷酸肌醇3激酶（PI3K）信號通路，從而把K-ras與表觀遺傳調(diào)控因子聯(lián)系到一起。但試驗發(fā)現(xiàn)10-HDA不對任何上述信號通路造成影響，表明10-HDA是直接靶向表觀遺傳影響分子。

基于10-HDA本身不能抑制DNA甲基化，但可與DNA脫甲基物質(zhì)協(xié)同作用，而且與已知的HDACi復合物結(jié)構(gòu)相似，他們又對10-HDA是不是一個HDACi進行了研究。結(jié)果顯示10-HDA抑制了HDAC活性或推動了組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性。接著，體外實驗直接檢測到10-HDA和王漿確實具有抑制HDAC活性。需要注意的是，本實驗用的蜂王漿含有2%的10-HDA，稀釋100倍后10-HDA濃度為1mM，而稀釋100倍的王漿溶液和1mM 10-HDA溶液功效相似，因此，推測蜂王漿中HDACi活性大部分是由10-HDA承擔的。9-ODA是10-HDA的類似物，由蜂王產(chǎn)生，且其具有與HDACi相似的活性，因此9-ODA酸的活性也可能對蜂王表型的維持起到重要作用。

最后，他們再次利用K-ras-transformed NIH 3T3細胞報告系統(tǒng)，比較了TSA（一種HDACi）、丁酸鈉和10-HDA的效力，以及用重組的HDAC1,3,8,10,11進行獨立的抑制試驗，一再證實了10-HDA的HDACi活性。

此研究試驗設計比較嚴密，具有較大的說服力。但要證明10-HDA的確能對蜂王發(fā)育產(chǎn)生影響，筆者認為仍存在一些疑問需要進一步驗證：（1）需要設計體內(nèi)試驗檢測10-HDA是否對蜜蜂蜂王發(fā)育產(chǎn)生影響；（2）3齡后的工蜂食物中含有一定量的蜂王漿，需要檢測工蜂食物中是否仍含有10-HDA；（3）如果工蜂漿中含有10-HDA，那是否對工蜂發(fā)育也產(chǎn)生影響？（4）如果10-HDA對工蜂發(fā)育和蜂王發(fā)育都產(chǎn)生影響，那調(diào)控方式差別是什么？是表觀遺傳數(shù)量的還是位點的差別？（5）雖然稀釋100倍的蜂王漿溶液和1mM 10-HDA溶液功效相似，那蜂王漿除掉10-HDA后的組分，是否不具備HDACi活性？也就是說蜂王漿的HDACi活性是否僅有10-HDA承擔？

浙江大學動物科學學院 陳璇 胡福良編譯