，，

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙包頭 014109；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué))

乳酸菌是促使青飼料發(fā)酵的主要微生物，是指一類以糖為原料的消耗葡萄糖50%以上、厭氧型、產(chǎn)生乳酸、革蘭氏陽(yáng)性，不形成芽孢的細(xì)菌。乳酸菌依其發(fā)酵糖生產(chǎn)乳酸的能力分為兩類，一類是同型發(fā)酵乳酸菌(Homo-fermentative lactic acid bacteria);另一類是異型發(fā)酵乳酸菌(Hetero-fermentative lactic acid bacteria)[1]。同型發(fā)酵乳酸菌在生產(chǎn)乳酸和青貯飼料方面更有效,耗能更少，且容易保存營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，屬比較經(jīng)濟(jì)的發(fā)酵類型。

青貯能否成功則很大程度上取決于同型發(fā)酵乳酸菌能否迅速大量繁殖，篩選并培養(yǎng)最適合的乳酸菌是關(guān)鍵，調(diào)節(jié)青貯料內(nèi)微生物區(qū)系，調(diào)控青貯發(fā)酵過(guò)程，創(chuàng)造適宜的厭氧環(huán)境，促進(jìn)多糖物與粗纖維的轉(zhuǎn)化，從而有效地提高青貯飼料的質(zhì)量，這是近30年來(lái)青貯研究的熱點(diǎn)。

本文主要對(duì)乳酸菌在飼料青貯中的應(yīng)用及研究進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述，供參考。

1 乳酸菌(LAB)在飼料青貯中的應(yīng)用

1.1青貯歷史 青貯飼料在世界各地有著悠久的發(fā)展歷史。據(jù)考證，青貯飼料起源于古埃及文化鼎盛時(shí)期(McDonald，1981.)[2]；在我國(guó)，600多年前的元代(王禎農(nóng)書)和清代(風(fēng)廣義)中曾記載有苜蓿、馬齒莧等青飼料的發(fā)酵方法。但實(shí)際應(yīng)用于生產(chǎn)是在18世紀(jì)初期，1885年德國(guó)人庫(kù)英(G.Kuin)及G.Frg報(bào)道了青貯飼料技術(shù)方面的文章；我國(guó)最早關(guān)于青貯飼料的試驗(yàn)研究報(bào)道是1944年發(fā)表于《西北農(nóng)林》的“玉米窖貯藏青貯料調(diào)制試驗(yàn)”。1943年西北農(nóng)學(xué)院教授王棟、助教盧得仁首次進(jìn)行帶棒玉米窖貯藏青飼料，并向陜西及全國(guó)推廣。

1.2微生物青貯劑的種類和研究概況 微生物青貯劑(SIB)，又稱青貯接種菌，生物青貯劑，青貯飼料發(fā)酵劑，是專門用于飼料青貯的一類微生物添加劑，由一種或多種乳酸菌、酶和一些營(yíng)養(yǎng)物組成，采用人工加入菌種的方法，有利于這類乳酸菌盡快達(dá)到足夠的數(shù)量，加快乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸，決定著青貯質(zhì)量的好壞。

1.2.1乳酸菌制劑 理想的青貯應(yīng)是乳酸菌控制整個(gè)發(fā)酵過(guò)程，乳酸生成占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。乳酸菌制劑的添加或直接接種乳酸菌可以加快乳酸菌發(fā)酵進(jìn)程，改善青貯發(fā)酵品質(zhì)，如Seale等(1986)[3]研究報(bào)道其添加效果明顯。Weinderg.等(1996)[4]研究指出，采食添加乳酸菌制劑青貯料的家畜，產(chǎn)奶量和日增重顯著提高。Fllya等(2007)[5]研究表明，乳酸菌接種劑對(duì)苜蓿青貯具有極好的效果，可以降低pH值，改善發(fā)酵品質(zhì)。上述結(jié)果表明，接種乳酸菌或添加乳酸菌制劑可明顯改善飼料的發(fā)酵品質(zhì)，提高動(dòng)物生產(chǎn)性能。目前主要使用的菌種有Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium和Pediococcus pentosaceus等。

據(jù)Naoki Nishino(1999)[6]等報(bào)道，近年來(lái)，Ohshima等進(jìn)行的綠色發(fā)酵汁(PFJ)調(diào)制青貯研究。PFJ類似于乳酸菌制劑，通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)植株上的固有乳酸菌以達(dá)到乳酸菌迅速增殖的目的。添加PFJ可明顯降低生產(chǎn)成本，工藝流程簡(jiǎn)單，且添加入青貯料后可迅速提高青貯料中的乳酸含量，降低pH值，抑制梭菌活動(dòng)，保護(hù)蛋白質(zhì)的分解損失，在改善青貯發(fā)酵品質(zhì)方面較乳酸菌更穩(wěn)定。據(jù)韓瑞麗(2002)[7]報(bào)道，PFJ可以使附著在牧草表面的乳酸菌群增殖，作為乳酸發(fā)酵的啟動(dòng)因子，顯示其有效性，是乳酸菌制劑的一種良好替代品。

1.2.2碳水化合物類 碳水化合物類添加劑能直接彌補(bǔ)乳酸菌發(fā)酵底物較低的缺陷，如糖蜜，是制糖工業(yè)的副產(chǎn)物，添加入青貯料后，可使pH及NH3-N含量降低，乳酸及可溶性糖的含量增加，同樣添加適量葡萄糖可明顯提高苜蓿青貯品質(zhì)。

1.2.3細(xì)胞壁降解酶 主要作用于兩方面，一是降解細(xì)胞壁成分，增加青貯發(fā)酵底物，促進(jìn)乳酸發(fā)酵優(yōu)勢(shì)的形成;二是酶降解作用后易被瘤胃微生物作用，提高有機(jī)物消化率。據(jù)YuZhu, Naoki Nishino等(1999)[8]報(bào)道，添加細(xì)胞壁降解酶的苜蓿青貯與對(duì)照組相比，乳酸含量明顯提高(P<0.01)，pH值下降(P< 0.01)，且對(duì)經(jīng)處理后的青貯料進(jìn)行瘤胃降解試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)可快速降解DM，從而使青貯料品質(zhì)得到明顯改善。

1.2.4纖維素酶 據(jù)席興軍等(2003)[9]報(bào)道，在玉米秸青貯飼料中加入乳酸菌和纖維素酶，可使青貯料中的氨態(tài)氮與總氮比、NDF、ADF含量顯著降低，青貯品質(zhì)得到明顯的改善。

2 乳酸菌的研究進(jìn)展

乳酸菌是微生物青貯劑中最早應(yīng)用的菌種，研究報(bào)道最多。近年來(lái)，許多學(xué)者對(duì)乳酸菌性質(zhì)，特別是分子生物學(xué)方面進(jìn)行了研究，取得了較多的新進(jìn)展。

黃良昌等(2002)[10]曾對(duì)保加利亞乳酸菌的濃縮培養(yǎng)進(jìn)行了研究。優(yōu)化培養(yǎng)條件:發(fā)酵時(shí)間為12 h，起始pH值5.80，發(fā)酵溫度40℃；確定MRS為培養(yǎng)基:MRS+7.5%番茄汁+12%麥芽汁+0.009 mol/L CaCl2+2%乳清。通過(guò)中和試驗(yàn)，可使菌體濃度達(dá)到9.55×109個(gè)/mL。

李霞等(2005)[11]應(yīng)用改良MRS培養(yǎng)基，對(duì)保加利亞乳酸菌進(jìn)行了超濃縮培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中，采用了離心式半連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)，最終使菌體濃度達(dá)到了1.045×1010個(gè)/mL。

近年來(lái)，黃紅等(2004)[12]對(duì)乳酸菌素進(jìn)行了詳細(xì)研究。日前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的乳酸菌素約有40余種，乳酸菌素是在乳酸菌代謝過(guò)程中，合成并分泌到環(huán)境中的一類對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌(尤其是親緣性較近的細(xì)菌)具有抑制作用的殺菌蛋白或多肽。分別由乳球菌、片球菌、明串球菌、乳桿菌、雙歧桿菌、腸球菌、鏈球菌、肉食桿菌等屬的菌株產(chǎn)生。乳酸菌可通過(guò)其代謝產(chǎn)物，主要是酸性物質(zhì)和乳酸菌素等，起到有效的抑菌作用。

乳酸菌素的功能類似抗菌素，但作用機(jī)制不同，具專一性，完全不產(chǎn)生抗藥性及毒性，可有效抑制病原菌的生長(zhǎng)。乳酸菌素的代謝產(chǎn)物(Nisin乳鏈菌肽)，能有效抑制多種導(dǎo)致腐敗的革蘭氏陽(yáng)性菌，尤其對(duì)產(chǎn)生芽孢的細(xì)菌特別有效，是一種高效、無(wú)毒的天然抑菌劑。抑菌實(shí)驗(yàn)表明，乳酸菌素不僅對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有抑制作用，而且對(duì)革蘭氏陰性菌也有不同程度的抑制作用，故可治療胃、腸炎。乳酸菌素還能促進(jìn)胃液分泌，增強(qiáng)胃腸蠕動(dòng)，促進(jìn)食物消化。目前的藥用制劑有麗珠腸樂(lè)、普樂(lè)拜爾等。

據(jù)Alexander等(2001)[13]報(bào)道，自2001年完成第一株乳酸菌即乳酸乳球菌IL 1403的全基因組測(cè)序以來(lái)，目前已公布完成測(cè)序的乳酸菌包括:乳酸乳球菌IL1403、長(zhǎng)雙歧桿菌NCC2705、植物乳桿菌WCSF1、約氏乳桿菌NCC533及嗜酸乳桿菌NCFM/ATCC700396等。乳酸菌基因組的大小在一個(gè)特定的范圍內(nèi)，從1.8～2.6 Mb不等，只有植物乳桿菌相對(duì)較大，為3.3 Mb。乳酸桿菌和雙歧桿菌分別具有較低和較高的GC含量，乳酸桿菌的GC含量為30.9%～50%不等，而長(zhǎng)雙歧桿菌則高達(dá)60.1%。另外，還有一些乳酸菌具有非常復(fù)雜的插入重復(fù)序列(IS)，說(shuō)明該菌具有較高的遺傳可塑性。

據(jù)王保平等(2010)[14]報(bào)道，乳酸菌遺傳學(xué)研究開始于20世紀(jì)70年代初，由于乳酸菌在青貯飼料中有著十分重要的作用，從而激發(fā)了人們對(duì)染色體外遺傳物質(zhì)，即質(zhì)粒的研究。質(zhì)粒(plasmid)是一段存在于染色體外或整合在染色體上的共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，含50～100個(gè)基因。質(zhì)粒可獨(dú)立存在于細(xì)菌染色體外，能夠進(jìn)行自我復(fù)制、穩(wěn)定遺傳和表達(dá);也可整合和消失，并可在一定范圍內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞間傳遞。許多次生代謝產(chǎn)物(如抗生素、色素)的合成一般受質(zhì)?？刂啤Ｙ|(zhì)粒并非細(xì)菌生命活動(dòng)所必需，但可攜帶決定細(xì)菌某些遺傳特性的基因，是遺傳工程的重要載體。

目前，已有多種方法可從細(xì)菌中提取質(zhì)粒DNA，如堿裂解法、煮沸法、微波爐法，此外還有有機(jī)溶劑法等。2008年，劉紅娟等結(jié)合Anderson與Sullivan等的乳酸菌質(zhì)粒提取方法和質(zhì)粒提取原理設(shè)計(jì)了乳酸菌質(zhì)粒提取方法，并對(duì)其中的各個(gè)步驟進(jìn)行了優(yōu)化，確定溶菌酶用量為2.5 mg/mL，作用時(shí)間為15 min，加入異丙醇后室溫放置5 min,從而得到了一種乳酸菌質(zhì)粒DNA高效、快速的提取方法。

乳酸菌質(zhì)粒的研究是乳酸菌遺傳學(xué)研究的基礎(chǔ)，乳酸菌質(zhì)粒的研究對(duì)于篩選新的優(yōu)良菌種，改良現(xiàn)有的生產(chǎn)菌種具有良好的作用。如果把異型發(fā)酵菌種中可以調(diào)高有氧穩(wěn)定性的基因，通過(guò)基因重組，建立良好的基因工程，再加入同型發(fā)酵菌中進(jìn)行改良，則可為飼料工業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益和生態(tài)效益。

3 小結(jié)與展望

乳酸菌是人和大多數(shù)動(dòng)物腸道內(nèi)的常見細(xì)菌，因其在各個(gè)領(lǐng)域中的長(zhǎng)期應(yīng)用已證明不具有致病性，被公認(rèn)為安全級(jí)(GRAS)微生物。20世紀(jì)90年代，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開始致力于對(duì)乳酸菌分子生物學(xué)及作用機(jī)制的研究，以乳酸球菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌作為基因工程受體菌，應(yīng)用基因工程技術(shù)有目的、有選擇地研制新一代微生態(tài)制劑，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步為人們探索其新的應(yīng)用潛力提供了基礎(chǔ)。

Le LOIR和RAW N等相繼開發(fā)出多種適合于乳酸球菌的信號(hào)肽系列(Langella，2001)[15]，為探索其他外源蛋白在乳酸菌中的大量表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。乳酸桿菌是一種良好的疫苗載體，用乳酸桿菌作為疫苗載體不僅可使口服的乳酸桿菌刺激產(chǎn)生粘膜及全身免疫反應(yīng)，提高某些免疫活性因子，如IL-2,IFN-α的分泌，而且可將特異性抗原分子攜帶并分泌到腸道，同時(shí)也可穿過(guò)腸壁進(jìn)入粘膜下層，進(jìn)而引起細(xì)胞免疫和體液免疫。更有意義的是，法國(guó)和巴西已于2000年聯(lián)手開展在乳酸桿菌中表達(dá)輪狀病毒的抗原基因，然后用重組的乳酸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)酸奶，來(lái)預(yù)防輪狀病毒性腹瀉?？傊?，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展及研究水平的不斷提高，通過(guò)對(duì)乳酸菌進(jìn)一步改造、表達(dá)調(diào)控的認(rèn)識(shí)不斷深入和對(duì)免疫學(xué)特別是粘膜免疫機(jī)制的研究，可以肯定將會(huì)得到更為優(yōu)良的益生乳酸菌基因工程菌。

隨著人們對(duì)乳酸菌功能了解的深入，乳酸菌的生物青貯劑的需求量也將進(jìn)一步增大。因此，對(duì)應(yīng)用于飼料青貯中的乳酸菌種進(jìn)行進(jìn)一步研究和開發(fā)有著重要意義。

總之，未來(lái)乳酸菌的應(yīng)用范圍將更加廣泛，功能將更加完備，乳酸菌的研發(fā)和應(yīng)用將具有更廣闊的發(fā)展前景。

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