李 林，陳 武，周清明，黎定軍

(1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙 410128；2 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科技學(xué)院，長沙 410128；3 湖南廣播電視大學(xué)，長沙 410004)

PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)， 是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程?，F(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)學(xué)、植物病理學(xué)等領(lǐng)域的研究。最初的PCR技術(shù)相當(dāng)不成熟，但在隨后的幾十年里，PCR技術(shù)被不斷改進(jìn)，它從一種定性的分析方法發(fā)展到定量測定；從原先只能擴(kuò)增幾個(gè) kb的基因到目前已能擴(kuò)增長達(dá)幾十個(gè) kb的DNA片段[1]。到目前為止，PCR技術(shù)已有十幾種之多，本文對其近年來的主要擴(kuò)展及應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 PCR技術(shù)的擴(kuò)展

1.1 AP-PCR技術(shù)

1.1.1 AP-PCR技術(shù)的定義、來源及特點(diǎn)

AP-PCR(Arbitrarily primed PCR)技術(shù)[2]，是指在對所擴(kuò)增基因順序一無所知的情況下，主觀上隨意地設(shè)計(jì)或選擇一個(gè)非特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)在不嚴(yán)格條件下擴(kuò)增1至數(shù)輪后，再于嚴(yán)格條件下進(jìn)行。通過比較擴(kuò)增產(chǎn)物的指紋圖，即可反映出待分析基因組的特征。AP-PCR 技術(shù)由 Williams等[3]于20世紀(jì)90年代建立，它可以快速地從兩個(gè)或更多的個(gè)體組織細(xì)胞中分離出差異基因或基因差異表達(dá)產(chǎn)物，具有簡單、靈敏、有效和重復(fù)性好等特點(diǎn)。

1.1.2 AP-PCR技術(shù)的應(yīng)用

AP-PCR技術(shù)是常規(guī)PCR技術(shù)在差異基因分離方面的擴(kuò)展，主要應(yīng)用在：(1)差異基因的分離，Liang和Pardee[2]應(yīng)用AP-PCR技術(shù)對正常A31和腫瘤起源的BPA31細(xì)胞進(jìn)行了鑒定，并分離得到了僅存在于正常細(xì)胞的N1及僅存在于腫瘤細(xì)胞的T1片段；(2)菌株鑒定，楊國玲等[3]采用AP-PCR技術(shù)對甲真菌病病原菌進(jìn)行了快速鑒定；(3)遺傳作圖，Welsh等[2]成功地應(yīng)用AP-PCR方法快速鑒定了重組鼠(C56BL/6J×DBA/2J)擴(kuò)增多態(tài)性在染色體圖譜中位置。

1.2 LP-PCR和彩色PCR

1.2.1 LP-PCR和彩色PCR的定義

LP-PCR(Labelled primers PCR)，即標(biāo)記PCR，它是指利用同位素、熒光素等對PCR引物5’端進(jìn)行標(biāo)記，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增，來檢測目的基因存在與否。

彩色PCR (Color Complement Assay)是指利用熒光染料標(biāo)記引物的 5’端，不同熒光(熒光染料TAMRA呈紅色熒光，JOE和 FAM呈綠色熒光，COUM 呈藍(lán)色熒光)標(biāo)記的引物同時(shí)參加反應(yīng)，經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增后，根據(jù)不同熒光的色澤來判斷目標(biāo)基因是否存在及擴(kuò)增基因的類型[4]。

1.2.2 LP-PCR和彩色PCR的比較

LP-PCR與彩色PCR由熒光PCR[5]發(fā)展而來，彩色PCR是LP-PCR的一種。與常規(guī)PCR相比，LP-PCR更為直觀，其省去了限制性內(nèi)切酶酶解及分子雜交等繁瑣步驟，并且一次可以同時(shí)分析多種基因成分，但是LP-PCR只能對產(chǎn)物進(jìn)行定性鑒定。與LP-PCR相比，彩色PCR通常需要2種不同顏色的引物：一種作為基因檢測引物；另一種作為控制條件的內(nèi)對照，但是在檢測多點(diǎn)突變時(shí)，彩色PCR需用更多的色彩[4]。

1.2.3 LP-PCR和彩色PCR的應(yīng)用

LP-PCR和彩色PCR是常規(guī)PCR技術(shù)與標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，LP-PCR常被用于大量臨床標(biāo)本的基因診斷，同時(shí)可用于對 PCR產(chǎn)物進(jìn)行定性鑒定。彩色PCR常被用于檢測基因的突變，染色體重排或轉(zhuǎn)位，基因缺失及微生物的型別鑒定等，如被用于檢測多突變點(diǎn)的遺傳病[4]。

1.3 免疫PCR技術(shù)

1.3.1 免疫PCR技術(shù)的定義、來源及特點(diǎn)

免疫PCR(immuno polymerase chain reaction, IMPCR)是利用抗原抗體反應(yīng)的特異性和PCR擴(kuò)增反應(yīng)的高靈敏性而建立的一種微量抗原檢測技術(shù)，它綜合了固相免疫反應(yīng)和PCR的特點(diǎn)。免疫PCR技術(shù)是1992年Sano建立的一種檢測微量抗原的高靈敏度技術(shù)[6]。與常規(guī)PCR及普通ELISA相比，免疫PCR優(yōu)勢明顯，具體表現(xiàn)為：靈敏度增加，可以同時(shí)進(jìn)行多種抗原/半抗原檢測，有更寬的線性范圍[7]。

1.3.2 免疫PCR技術(shù)的應(yīng)用

免疫PCR技術(shù)是常規(guī)PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)免疫學(xué)領(lǐng)域的主要擴(kuò)展，它常被用于：(1)激素和細(xì)胞因子的檢測，F(xiàn)uruya等[8]運(yùn)用免疫PCR技術(shù)對白介素-18進(jìn)行了檢測，靈敏度提高了10000倍；(2)生化酶類的檢測，Chang等[9]通過改良的免疫PCR方法對大腸桿菌β-葡萄糖苷酶進(jìn)行了檢測；(3)致病微生物的檢測，Monteiro等[10]將磁珠技術(shù)和免疫PCR技術(shù)相結(jié)合，設(shè)計(jì)了一種能檢測糞便中幽門螺桿菌的新方法；(4)寄生蟲感染的檢測，國內(nèi)利用免疫PCR技術(shù)檢測弓形蟲C抗原，敏感性較ELISA法提高了200倍[2]；(5)其他毒素或蛋白的檢測，宋云揚(yáng)等[11]建立的檢測金葡菌腸毒素B的雙抗體夾心免疫PCR方法比ELISA靈敏度高1000倍。

1.4 原位PCR技術(shù)與原位反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)

1.4.1 原位PCR技術(shù)與原位反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)的定義

原位PCR(in situ polymerase chain reaction)技術(shù)將PCR高效擴(kuò)增與原位雜交的細(xì)胞定位相結(jié)合，在組織細(xì)胞水平，原位檢測單拷貝的特定 DNA或 RNA序列[12]。原位反轉(zhuǎn)錄 PCR技術(shù)(in situ reverse transcription PCR,RT in situ PCR or in situ cDNA PCR)，簡稱原位 RT-PCR，它是指先將細(xì)胞和組織進(jìn)行處理(固定、酶消化)，以獲得適度的細(xì)胞通透性；再通過逆轉(zhuǎn)錄使rnRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA；然后把載玻片放人熱循環(huán)機(jī)，對靶DNA等細(xì)胞內(nèi)靶目標(biāo)在原位進(jìn)行 PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增反應(yīng)中含有標(biāo)記的單核苷酸)；最后通過檢測標(biāo)記產(chǎn)物的方法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物[13]。

1.4.2 原位PCR技術(shù)與原位反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)的比較

原位 PCR技術(shù)在進(jìn)一步提高以單細(xì)胞底物進(jìn)行PGD (preim plantation genetic diagnosis,PGD)的效率的前提下，由 Thornhill［14］提出，它具有細(xì)胞定位能力和高度特異敏感。原位反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)是原位PCR技術(shù)的一種，它檢測的靶序列為RNA，由Nuovo等[15]1992年發(fā)明，具有操作簡單、流程短、省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)具有特異性差、容易出現(xiàn)非特異性 DNA產(chǎn)物、造成假陽性、且擴(kuò)增效率較低，特別是石蠟切片[16]等缺點(diǎn)。

1.4.3 原位PCR技術(shù)與原位反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)的應(yīng)用

原位PCR技術(shù)是常規(guī)PCR在細(xì)胞學(xué)領(lǐng)域的擴(kuò)展，它常被用于感染性外源基因的檢測、內(nèi)源基因的檢測與導(dǎo)入基因的檢測等，如對H IV、結(jié)核桿菌等進(jìn)行的檢測[17]。原位反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)常被用于擴(kuò)增和檢測標(biāo)本中罕見的rnRNA，如定量細(xì)胞表達(dá)特殊rnRNA的豐度、檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的細(xì)胞起源及檢測細(xì)胞群中基因表達(dá)的趨勢等[18]。

1.5 定量PCR技術(shù)

1.5.1 定量PCR技術(shù)的定義及特點(diǎn)

定量PCR(Polymerase Chain Reaction)技術(shù)有廣義和狹義兩層含義。廣義的定量PCR技術(shù)是指以外參或內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，通過對PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測，進(jìn)行PCR起始模板量的定量。狹義的定量 PCR技術(shù)，又稱為實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)(rea1-time fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)，它是嚴(yán)格意義上的定量 PCR技術(shù)，指用外標(biāo)法(熒光雜交探針保證特異性)通過監(jiān)測PCR過程(監(jiān)測擴(kuò)增效率)達(dá)到精確定量起始模板數(shù)的目的，同時(shí)以內(nèi)對照有效排除假陰性結(jié)果(擴(kuò)增效率為零)，1996年由美國Applied Biosystems公司推出。與常規(guī)PCR技術(shù)相比，定量PCR技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對DNA模板的定量，同時(shí)具有靈敏度更高、特異性和可靠性更強(qiáng)、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無污染性、具實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)[19]。

1.5.2 定量PCR技術(shù)的應(yīng)用

定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR技術(shù)從定性分析到定量測定的發(fā)展，它常被應(yīng)用于臨床微生物、食品微生物、臨床腫瘤學(xué)的檢測、腫瘤耐藥基因表達(dá)的研究、細(xì)胞因子的表達(dá)分析等方面。其中，臨床微生物和食品微生物是定量 PCR應(yīng)用中最重要的兩個(gè)方面，彭年才等[19]2010年自主研發(fā)了用于食品安全檢測的實(shí)時(shí)定量PCR儀，并已投入產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

1.6 多重PCR技術(shù)

1.6.1 多重PCR技術(shù)的定義及特點(diǎn)

多重PCR(multiplex PCR)是在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，它最明顯的優(yōu)點(diǎn)是省時(shí)、省力、能夠快速檢測和鑒別病原體[20]，另外，多重PCR還可以精確地估計(jì)一個(gè)樣品中模板數(shù)量。

1.6.2 多重PCR技術(shù)的應(yīng)用

多重PCR技術(shù)將多個(gè)PCR反應(yīng)放在同一個(gè)體系內(nèi)，進(jìn)一步提高了PCR反應(yīng)的效率，它被廣泛地用于病原體鑒別、性別鑒定、連鎖分析、法醫(yī)研究、模板檢測和基因的疾病診斷等方面，高玉龍等[21]對煙草轉(zhuǎn)基因進(jìn)行了檢測。

1.7 反向PCR技術(shù)

1.7.1 反向PCR技術(shù)的定義及特點(diǎn)

反向 PCR(reverse PCR)，又稱為染色體緩移(chrornosome walking)[22]，它是指利用在已知序列內(nèi)部沒有切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶對此段DNA進(jìn)行酶切，在DNA連接酶作用下自連形成環(huán)狀DNA分子，然后利用方向合適并與已知序列兩端互補(bǔ)的引物，以連接成環(huán)的DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到已知序列的旁側(cè)DNA片段。與常規(guī)PCR技術(shù)相比，反向PCR優(yōu)勢突出，但它需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進(jìn)行酶切，另外，由于大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復(fù)序列，在YAC或Cosmid的未知功能序列中有時(shí)也會(huì)存在這些序列，從而導(dǎo)致反向PCR得到的探針與多個(gè)基因序列雜交，影響擴(kuò)增效果。

1.7.2 反向PCR技術(shù)的應(yīng)用

反向PCR技術(shù)在檢測病毒、轉(zhuǎn)座子等在基因組中的整合位點(diǎn)，建立基因組步移文庫及研究基因的上游調(diào)控元件等方面較常規(guī)PCR技術(shù)優(yōu)勢明顯[22]，Souer等1995年將反向PCR技術(shù)與差別篩選法相結(jié)合，從矮牽牛W138中分離得到了高效轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽dTph1標(biāo)記的基因。

1.8 錨定PCR技術(shù)

1.8.1 錨定PCR技術(shù)的定義及特點(diǎn)

錨定PCR(Anchored PCR)[23]，又稱固定PCR，它以基因組總 DNA為模板，用一條基因特異性引物進(jìn)行線性PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物；在末端轉(zhuǎn)移酶的作用下，在單鏈DNA分子的3’末端加上多聚胞嘧啶；用巢式基因特異性引物與多聚胞嘧啶配對的錨定引物對加尾的產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物連入載體后進(jìn)行測序鑒定。與常規(guī)PCR技術(shù)相比，錨定PCR技術(shù)特異性高、有較長的步行距離，一次實(shí)驗(yàn)可以獲得1.5 kb左右的目的片段，同時(shí)它無需對基因組總 DNA進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化及連接反應(yīng)，另外，其操作過程較其他方法簡單，大約2-3個(gè)工作日就能完成。

1.8.2 錨定PCR技術(shù)的應(yīng)用

錨定PCR技術(shù)解決了常規(guī)PCR技術(shù)所不能完成的已知片段側(cè)翼序列的克隆問題，是常規(guī)PCR技術(shù)的又一重大擴(kuò)展，賈小平等[24]用A-PCR對谷子微衛(wèi)星文庫進(jìn)行了篩選。

1.9 兼并引物PCR技術(shù)

1.9.1 兼并引物PCR技術(shù)的定義

兼并引物PCR(degenerate primer PCR)是指針對由密碼子的兼并性引起的，單以氨基酸順序推測編碼的 DNA序列的不精確性，設(shè)計(jì)成對兼并引物，通過PCR擴(kuò)增所有編碼已知順序的核酸序列。

1.9.2 兼并引物PCR技術(shù)的應(yīng)用

兼并引物PCR技術(shù)是常規(guī)PCR技術(shù)在蛋白領(lǐng)域的應(yīng)用，具體表現(xiàn)在兩個(gè)方面：(1)尋找新蛋白已被測定的一段氨基酸序列的相應(yīng)基因；(2)尋找具有進(jìn)化上保守結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)家族新成員的基因[25]。陶愛林等[26]采用該技術(shù)成功進(jìn)行了蓰草花粉過敏原全長同源基因的克隆。

1.10 重組PCR技術(shù)及其應(yīng)用

1.1 0.1 重組PCR技術(shù)的定義

重組PCR (recombinant PCR)是通過DNA重疊序列的銜接作用，使多個(gè) DNA分子融合在一起的體外擴(kuò)增技術(shù)[27]。它包括三個(gè)階段：(1)制備用于重組的DNA組件；(2)組件分子作為引物互為模板延伸；(3)克隆和定向篩選重組產(chǎn)物[28]。

1.1 0.2 重組PCR技術(shù)的應(yīng)用

重組PCR技術(shù)的出現(xiàn)，使常規(guī)PCR技術(shù)得到進(jìn)一步擴(kuò)展，它是PCR技術(shù)在核酸與蛋白兩個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用的結(jié)晶。重組PCR技術(shù)的應(yīng)用主要表現(xiàn)在：(1)精確解析大分子功能和相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，如標(biāo)定活性位點(diǎn)的關(guān)鍵殘基、確認(rèn)已知蛋白中未知功能的結(jié)構(gòu)域、揭示配體-受體識(shí)別過程中相互臨近的區(qū)域等。(2)探索順式作用元件的調(diào)控機(jī)理，揭示mRNA的非翻譯區(qū)的功能、確定啟動(dòng)子和增強(qiáng)子成分的功能等。(3)嵌合受體在研究信號(hào)途徑和胞內(nèi)定位中具有獨(dú)特的“釣魚”優(yōu)勢，用功能已知的分子和待研究對象嵌合來研究結(jié)合TGF之后的TGFR二聚化形式和內(nèi)向整流型鉀通道的脂筏定位過程[29,30]，(4)開發(fā)新型載體，比如通過DNA重排來增強(qiáng)綠色熒光蛋白 (GFP)的熒光穩(wěn)定性；(5)升級分子標(biāo)記，通過DNA改組已經(jīng)獲得的重組擬南芥K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以使植株內(nèi)的鉀離子富集度提高26.1%；(6)重組 PCR在蛋白體外定向進(jìn)化中的的應(yīng)用最引人矚目；(7)基于重組PCR技術(shù)的分子育種 (molecular breeding)在疫苗研發(fā)中有著廣闊的應(yīng)用前景，以HIV病毒疫苗研制為例，2002年運(yùn)用DNA shufling技術(shù)突破了HIV的宿主專一性，得到了高復(fù)制率的嵌合猿-人免疫缺陷病毒(SHIV)[28]。

2 PCR技術(shù)在煙草領(lǐng)域的應(yīng)用

2.1 煙草轉(zhuǎn)基因的檢測

煙草作為基因工程研究的模式植物，轉(zhuǎn)基因體系已經(jīng)很成熟，但是由于對轉(zhuǎn)基因安全性不確定，目前我國還不允許種植轉(zhuǎn)基因煙草。在轉(zhuǎn)基因檢測方法中，對轉(zhuǎn)基因所用載體特異序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增是最簡單有效的，其精確度可達(dá)0.1%[21]，而多重PCR與錨定PCR[31]的應(yīng)用使得這項(xiàng)檢測更加簡單、有效。

2.2 常規(guī)煙草病毒病的鑒定

我國煙區(qū)有15種病毒病危害煙草，不同病毒可能造成相似的癥狀，而不同條件下相同病毒也可能造成極為不同的癥狀，由于不同種類病毒在傳播方式、流行規(guī)律和防治方法等方面差異較大，病毒種類的準(zhǔn)確的鑒定是進(jìn)行有效防治的前提。顏培強(qiáng)等2004年應(yīng)用多重PCR原理建立了適于復(fù)合侵染病毒種類鑒定的PCR鑒定技術(shù)，采用熒光定量PCR技術(shù)建立了適于病毒定量研究的煙草病毒定量檢測技術(shù)，為煙草病毒病藥效防治效果評估和病毒在植株體內(nèi)的消長規(guī)律研究提供了更為精確的檢測方法。

3 展 望

PCR作為一項(xiàng)“革命性的技術(shù)”，不僅推動(dòng)了遺傳與分子生物學(xué)的發(fā)展，而且在其它領(lǐng)域科學(xué)家的努力與創(chuàng)新下，其不斷與該領(lǐng)域的核心技術(shù)相結(jié)合，極大地推動(dòng)了此領(lǐng)域的發(fā)展。另外，PCR技術(shù)從問世便成為生物學(xué)界的一大熱點(diǎn)，它在煙草領(lǐng)域的應(yīng)用由來已久，它的出現(xiàn)對煙草領(lǐng)域的研究者們造成了極顯著的影響，同時(shí)也極大地促進(jìn)了煙草領(lǐng)域的研究?？傊S著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，PCR技術(shù)必將得到新的發(fā)展，以之為基礎(chǔ)的新技術(shù)將不斷出現(xiàn)，它在煙草領(lǐng)域研究中的作用亦日漸明顯。

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