陶 寧， 楊友才

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科技學(xué)院，長沙 410128）

溫度是影響作物生長和分布的一種重要的生態(tài)因子，在作物遺傳背景限制的前提下，對(duì)作物某些生長發(fā)育過程起著決定性作用[1]。在低溫狀態(tài)下，植物生長發(fā)育會(huì)受到影響，甚至導(dǎo)致植株死亡，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的損失[2]。

煙草原產(chǎn)于熱帶，是喜溫作物，最適生長溫度是 25～28℃，低于 10～13℃時(shí)生長停止，1～2℃時(shí)煙株死亡[3]。我國煙區(qū)分布廣泛，各地溫度條件差異很大，早春低溫危害是我國南方煙區(qū)普遍存在的問題，嚴(yán)重影響優(yōu)質(zhì)煙葉的生產(chǎn)[4]。研究提高煙草抗寒性不僅具有理論意義，在解決實(shí)際生產(chǎn)問題上也具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。筆者擬對(duì)煙草在低溫條件下的生長形態(tài)、生理生化特性、生態(tài)及細(xì)胞遺傳學(xué)等領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，在此基礎(chǔ)上展望未來的研究方向和重點(diǎn)。

1 煙草種子發(fā)芽期抗寒性

植物在不同發(fā)育時(shí)期，其抗寒力是不同的。發(fā)育水平越低，抗寒性越易得到提高。這是因?yàn)橹参镌谟酌鐣r(shí)容易改變它的遺傳性，低溫處理開始萌發(fā)的種子，可以提高它們的抗寒性[5]。

Bunn[5]和 Haroon等[6]認(rèn)為 10～32℃均屬煙草可發(fā)芽溫度，發(fā)芽低限溫度為 10℃，當(dāng)溫度低于10℃時(shí)，煙草種子的發(fā)芽受到抑制。Rosa[7]對(duì)煙草種子萌發(fā)第3天、第6天分別予以-2℃和-4℃的冷凍處理，發(fā)現(xiàn)-4℃低溫對(duì)萌發(fā)后所有時(shí)期的煙草種子都構(gòu)成了嚴(yán)重危害。陳學(xué)平等[8]對(duì)兩個(gè)煙草品種進(jìn)行了(2±0.5)℃、時(shí)間小于48 h的低溫處理，結(jié)果表明低溫對(duì)種子發(fā)芽早期影響大，早期處理的種子低溫結(jié)束后，其發(fā)芽速率增快。

在低溫脅迫下煙草的發(fā)芽特性方面，王玉芳等[9]用紅花大金元種子在低于15℃時(shí)進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)種子萌發(fā)明顯受到抑制，發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)顯著低于常溫，幼苗鮮重、根長也都明顯受到抑制。徐盛春[10]對(duì)煙草主栽品種發(fā)芽耐寒性進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)低溫11℃時(shí)，煙草種子的相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)、相對(duì)苗高、相對(duì)幼苗干重之間顯著相關(guān)，是較好的耐寒性評(píng)價(jià)指標(biāo)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)并不是所有指標(biāo)均適用于煙草抗寒性鑒定，如相對(duì)平均發(fā)芽時(shí)間、相對(duì)根長。王樹會(huì)等[11]研究發(fā)現(xiàn)品種K326裸種在溫度低于12℃時(shí)前14 d不會(huì)發(fā)芽，隨著溫度的降低，發(fā)芽所需時(shí)間延長，當(dāng)溫度低至8℃時(shí)，裸種發(fā)芽時(shí)間需要37 d；同時(shí)種子發(fā)芽指數(shù)也隨溫度降低而降低。煙草包衣種發(fā)芽時(shí)間比裸種更晚，當(dāng)溫度低至8℃時(shí)，煙草包衣種不會(huì)發(fā)芽。

種子的萌發(fā)過程受體內(nèi)激素的調(diào)節(jié)與控制，利用外源化學(xué)物質(zhì)處理種子能調(diào)節(jié)萌發(fā)過程中內(nèi)源激素的含量水平，從而調(diào)節(jié)種子的生理代謝，提高種子活力，促進(jìn)壯苗[12]。適宜濃度的JA(茉莉酸)、Me－JA(茉莉酸甲酯)等均能提高煙草種子的發(fā)芽勢，而一定濃度的赤霉素(GA3)則明顯促進(jìn)煙苗生長[13,14]。用一定濃度（CC）的氯化膽堿溶液浸種后能提高煙草種子的發(fā)芽指數(shù)和種子活力[15]。肖楊等[16]研究發(fā)現(xiàn)采用濃度0.1～0.9 mg/L赤霉素(GA3)處理浸種10min能有效打破煙草種子的休眠，提高萌發(fā)率。殷全玉等[17]研究結(jié)果顯示水楊酸浸種可以促進(jìn)低溫下的煙草種子提前萌發(fā)，萌發(fā)率顯著增大；水楊酸浸種的最佳劑量和浸種時(shí)間是0.5 mmol/L，浸泡48 h。

2 煙草苗期抗寒性研究

早春低溫是常見的自然現(xiàn)象，在煙草苗期、移栽早期及大田生長后期均有冷害現(xiàn)象發(fā)生，尤以幼苗為甚，其中又以 3～4葉期抗寒性最弱，隨著幼苗的生長抗寒性逐漸增強(qiáng)。

2.1 煙草苗期抗寒性形態(tài)表現(xiàn)

冷害本質(zhì)上是低溫對(duì)植物體造成的生理損傷。農(nóng)作物特別是一些熱帶或亞熱帶起源的喜溫植物如玉米、水稻、棉花、甜椒等經(jīng)常發(fā)生冷害現(xiàn)象，受害時(shí)間偏長，則將出現(xiàn)局部傷亡，甚至植株死亡導(dǎo)致產(chǎn)量降低和品質(zhì)下降[18]。正是由于冷害傷害了細(xì)胞的正常功能和結(jié)構(gòu)，特別是細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞器膜系，導(dǎo)致代謝發(fā)生紊亂，結(jié)構(gòu)和組織遭到破壞，進(jìn)而在形態(tài)上出現(xiàn)傷痕，對(duì)植株整個(gè)生育過程均造成不利影響。此外，冷害會(huì)致使植物群體生長發(fā)育不均，對(duì)機(jī)械收獲十分不利[19]。

煙株冷害發(fā)生后，葉片邊緣內(nèi)卷或舌狀伸展，舌狀葉和心葉顏色發(fā)白或淺黃色，甚至出現(xiàn)煙苗畸形，生長停止。試驗(yàn)證明，煙苗在－5℃～3℃條件下，持續(xù)2～3 h，或－2～0℃條件下，持續(xù)15～16 h，就會(huì)產(chǎn)生幼葉變黃或呈微白色的癥狀。低溫傷害可抑制煙株的生長發(fā)育，在無霜期短的煙區(qū)，秋季早霜可使煙葉呈水漬狀枯萎死亡，無使用價(jià)值。

低溫對(duì)煙草苗期生長的影響主要有兩方面:一是煙草苗期生長受害，大田前期生長緩慢，莖桿木質(zhì)化，變成“小老苗”。煙苗移栽后，地溫很低，老根變褐、變黑，新根生不出來，導(dǎo)致還苗期、生根期推遲，影響煙草的團(tuán)棵和旺長，嚴(yán)重影響煙葉的質(zhì)量。二是低溫誘導(dǎo)早花，而且誘導(dǎo)能力很強(qiáng)，特別是煙株長到6～12片葉時(shí)，如果氣溫在13～18℃或更低，持續(xù)10～20 d，早花株率最高，會(huì)導(dǎo)致煙草產(chǎn)量下降[20]。

在煙草幼苗不同部位對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)差異上，李軍營等[21]在短期(1 h)低溫處理烤煙幼苗時(shí)發(fā)現(xiàn)，抵抗低溫的能力排序?yàn)檠?葉≥莖>根，長期(24～72 h)低溫處理時(shí)，最易受到傷害的部位是根部，其次是莖，再次是芽和葉片。王小彥等[22]研究結(jié)果表明同一葉片不同部位對(duì)低溫響應(yīng)不同，前遠(yuǎn)側(cè)脈區(qū)(ML)比近側(cè)脈區(qū)(EL)更具有氧化能力，低溫處理前后ML都比EL具有較強(qiáng)的H2O2清除能力。李永平等[6]對(duì) 5個(gè)煙草品種苗期的抗寒性進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示在低溫脅迫下煙草幼苗的地上部比地下部敏感，而地下部變化不大。

2.2 煙草抗寒性生理變化

植物對(duì)溫度逆境的適應(yīng)主要在于細(xì)胞膜，特別是質(zhì)膜和類囊體膜的特性，低溫脅迫下植物體內(nèi)發(fā)生一系列的生理生化反應(yīng)，還涉及到糖類、蛋白質(zhì)、滲透性調(diào)節(jié)物質(zhì)及保護(hù)性酶系統(tǒng)和代謝活性等生理代謝過程。

2.2.1 生物膜系統(tǒng)與煙草的抗寒性

當(dāng)植物遭受低溫脅迫時(shí)，植物胞外或胞內(nèi)結(jié)冰，冰晶溶液比液態(tài)溶液的水勢低，因而胞內(nèi)的水分通過質(zhì)膜流出，導(dǎo)致細(xì)胞嚴(yán)重脫水[23，24]。研究表明，生物膜是低溫冷害作用的首要部位[25]。低溫傷害的原初反應(yīng)發(fā)生在生物膜系統(tǒng)類脂分子的相變上，膜脂由液晶態(tài)變成凝膠態(tài)，導(dǎo)致原生質(zhì)流動(dòng)停止，通透性增大，膜內(nèi)可溶性物質(zhì)、電解質(zhì)大量向膜外滲透，破壞了細(xì)胞內(nèi)外的離子平衡，從而使植物細(xì)胞受到傷害[26,27]，所以可通過細(xì)胞膜電解質(zhì)滲透情況來評(píng)價(jià)植物細(xì)胞遭受傷害的程度[28]。許多植物通過改變膜脂成分、活化抗氧化系統(tǒng)和積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等以緩解低溫造成的機(jī)械傷害和生理傷害[29]。植物受到低溫脅迫時(shí)，活性氧增多，產(chǎn)生膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)，從而導(dǎo)致膜的完整性被破壞，因此，MDA的含量是了解逆境脅迫對(duì)生物膜危害程度的重要指標(biāo)之一[30]。晉艷等[31]研究說明煙草品種幼苗的膜透性都隨著脅迫溫度的降低和脅迫時(shí)間的增加而增加。陳衛(wèi)國[20]研究進(jìn)一步表明低溫脅迫下煙草的細(xì)胞膜通透性和MDA含量出現(xiàn)明顯的上升，且隨低溫脅迫程度的增大，MDA含量和細(xì)胞膜透性呈極顯著相關(guān)。張燕等[32]研究顯示煙草幼苗在低溫下葉片MDA 含量隨低溫脅迫時(shí)間的延長呈逐步增加的趨勢，但是用 PEG 處理的葉片，MDA含量增長較慢，表明PEG有減緩膜脂過氧化作用，降低MDA積累的作用，能提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和膜脂過氧化的保護(hù)能力。

2.2.2 代謝活性與煙草抗寒性

對(duì)呼吸作用的影響。植物在剛受到冷害時(shí)，呼吸速率會(huì)比正常時(shí)還高，這是一種保護(hù)作用，以維持體內(nèi)代謝和能量的供給，但時(shí)間較長以后，呼吸速率便大大降低[33]。低溫脅迫能使線粒體雙層膜損傷破壞，影響有氧呼吸的強(qiáng)度，無氧呼吸比重增大。張燕等[34]的研究表明在5℃低溫下，煙草幼苗中呼吸速率呈上升趨勢，隨低溫持續(xù)時(shí)間的延長，幼苗呼吸速率下降較快，但是用 PEG 處理的煙草幼苗的呼吸速率下降的速度和幅度均低于對(duì)照。周克功等[35]用黃花煙草愈傷組織做試驗(yàn)，結(jié)果顯示4℃時(shí)線粒體呼吸以細(xì)胞色素途徑為主，第2天以交替途徑為主，到第5天后又以細(xì)胞色素途徑為主，而不經(jīng)低溫脅迫的煙株則自始至終均以細(xì)胞色素途徑為主。

對(duì)光合作用的影響。低溫下光合速率明顯下降，對(duì)于起源于熱帶和亞熱帶的冷敏感植物，當(dāng)溫度降至引起冷害的臨界溫度時(shí)，會(huì)受到強(qiáng)烈的抑制。低溫脅迫直接影響光合系統(tǒng)的功能和結(jié)構(gòu)，對(duì)植物葉綠素含量及葉綠素a/b比值、葉綠體亞顯微結(jié)構(gòu)、光合能量代謝及光合系統(tǒng) Ⅱ ( P S Ⅱ )活性等一系列重要的生理生化過程都有明顯影響。晉艷等[3]研究發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下煙草幼苗葉綠素 a、葉綠素 b和葉綠素總量因葉綠體受損而下降。陳衛(wèi)國[20]研究發(fā)現(xiàn)隨著低溫脅迫加重，葉綠素含量逐漸減少，而且Chla/Chlb值增大，且降解速度Chlb>Chla。張燕等[36]用 PEG處理低溫脅迫下的煙草幼苗發(fā)現(xiàn)葉綠素含量均高于對(duì)照，表明PEG對(duì)葉綠素有一定的保護(hù)作用，因而減緩了葉綠素在低溫下的分解速度。易建華等[37]研究了低溫對(duì)煙苗葉片光合特性的影響，結(jié)果表明: 在16，8，3 ℃條件下，凈光合速率(Pn)、表觀量子效率(AQY)、羧化效率(CE)、RuBP最大再生能力隨溫度的降低顯著下降，在8，3℃條件下發(fā)生了低溫光抑制現(xiàn)象。

2.2.3 保護(hù)性酶系統(tǒng)與煙草抗寒性

低溫下由于植物對(duì) O2的利用能力降低，多余的 O2則被轉(zhuǎn)化成對(duì)植物有毒害作用的活性氧（ROS）?；钚匝踉龆鄷?huì)導(dǎo)致膜脂過氧化加劇，引起膜蛋白的變性，并最終導(dǎo)致植物受到傷害和死亡，因此必須通過植物抗氧化酶系統(tǒng)及時(shí)清除[38]。植物抗氧化酶系統(tǒng)分為酶促和非酶促兩類，酶促防御系統(tǒng)包括:超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)等；非酶促防御系統(tǒng)包括谷胱甘肽（GSH）、抗壞血酸(ASA)等[39]。這些物質(zhì)協(xié)同作用以去除植物體內(nèi)的活性氧自由基，其中尤以 SOD最為重要，它是植物體內(nèi)第一個(gè)清除活性氧的關(guān)鍵抗氧化酶。劉鴻先等[40]研究表明，煙草的低溫傷害與細(xì)胞膜系統(tǒng)脂質(zhì)過氧化作用和活性氧清除系統(tǒng)活性的降低存在密切關(guān)系，這點(diǎn)與前人的研究結(jié)果一致。低溫脅迫下這些抗氧化酶活性會(huì)發(fā)生變化，冷敏感植物抗氧化酶活性呈先增加后下降的趨勢；而抗冷植物能維持較高的抗氧化酶活性[41]。煙草幼苗在5℃低溫下，脅迫l d，葉片中抗壞血酸和還原型谷光甘肽含量均有所上升，隨脅迫時(shí)間的延長，其含量不斷下降[36]。相關(guān)研究表明，隨著低溫脅迫時(shí)間的增加，煙草幼苗內(nèi)的CAT和SOD活性降低，而POD活性增加[32]。張燕等[36]研究在低溫脅迫期下，分別用PEG和CaCl2處理煙苗種子，煙草SOD、CAT、POD等活性顯著高于對(duì)照，其膜脂過氧化產(chǎn)物和質(zhì)膜透性及 O2－含量均低于對(duì)照，細(xì)胞相對(duì)電導(dǎo)率低，恢復(fù)生長后，幼苗膜透性和保護(hù)酶活性恢復(fù)較快。朱振乾等[42]用CuSO4處理煙草幼苗，發(fā)現(xiàn)CuSO4低于0.08 g/L時(shí)，CuSO4施用量增加能促進(jìn)煙草生長，而且低溫脅迫下，POD活性隨CuSO4濃度增加而上升。這些研究表明通過外源化學(xué)物質(zhì)處理煙草可以緩解保護(hù)性酶系統(tǒng)活性下降趨勢，提高煙草抗寒能力。

2.2.4 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與煙草抗寒性

植物在適應(yīng)環(huán)境脅迫的過程中會(huì)產(chǎn)生一些具有保水作用的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，如脯氨酸、甜菜堿、可溶性糖等。在低溫脅迫下，植物通過誘導(dǎo)該類物質(zhì)生成的基因的大量表達(dá)，增加這類物質(zhì)的積累，維持滲透壓的平衡，從而避免低溫傷害[43]。脯氨酸具有溶解度高，在細(xì)胞內(nèi)積累無毒性，水溶液水勢較高等特點(diǎn)，低溫脅迫下，游離脯氨酸可能是通過保護(hù)酶的空間結(jié)構(gòu)，為生化反應(yīng)提供足夠的自由水及化學(xué)和生理活性物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用，此外脯氨酸與蛋白質(zhì)相互作用可以增加蛋白質(zhì)的可溶性，從而增強(qiáng)蛋白質(zhì)的水合能力[44]。因此脯氨酸含量的高低可作為衡量植物抗冷性的指標(biāo)。煙草幼苗在經(jīng)過PEG處理后，脯氨酸含量隨低溫脅迫時(shí)間的延長逐步增多[36]。說明了游離Pro含量與煙草抗寒性有密切的關(guān)系。陳衛(wèi)國[20]深入研究發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下煙草中脯氨酸含量的響應(yīng)程度耐寒性強(qiáng)的品種強(qiáng)于耐寒性弱的品種。甜菜堿的化學(xué)性質(zhì)與脯氨酸相似，它一方面通過與蛋白質(zhì)的相互作用保護(hù)生物大分子在高電解質(zhì)濃度下不變性；另一方面又可以作為滲透平衡物維持細(xì)胞的膨壓[45]。

可溶性糖的含量與植物的抗冷性密切相關(guān)，低溫下植株中可溶性糖積累是作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和防脫水劑而起作用的，它可以降低細(xì)胞水勢，增強(qiáng)持水力。多數(shù)情況下，可溶性糖類的含量可作為植物抗冷性鑒定的重要參數(shù)。張燕等[36]的研究表明:在 5℃低溫下，煙草幼苗可溶性糖含量隨處理時(shí)間的延長而增加。但是同一低溫條件下，持續(xù)脅迫的可溶性總糖含量的增加度極顯著高于間歇脅迫間的[20]。

3 小結(jié)與展望

對(duì)煙草抗寒性方面的研究還有待進(jìn)一步加強(qiáng)。僅從某一個(gè)層面去研究煙草的抗寒性或抗寒性中的某個(gè)環(huán)節(jié)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，在發(fā)生低溫凍害時(shí)，往往伴隨著其他逆境脅迫如旱、澇、鹽堿等，因此應(yīng)將低溫脅迫與其他因素相結(jié)合進(jìn)行研究。對(duì)煙草抗寒性的評(píng)價(jià)也必須是多方面的，指標(biāo)單一化很難反映植物的抗寒性實(shí)質(zhì)，應(yīng)該明確各項(xiàng)指標(biāo)的變化規(guī)律，綜合各個(gè)指標(biāo)之間的關(guān)系及協(xié)同作用，形成抗寒指標(biāo)鑒定體系，才能得出正確的結(jié)論，目前在許多作物上已基本建立抗寒指標(biāo)鑒定體系，但在煙草上研究較少。而且關(guān)于煙草種子資源的耐寒性的綜合鑒定研究也少見報(bào)道。在植物抗寒機(jī)制研究中，低溫誘導(dǎo)蛋白的發(fā)現(xiàn)為植物抗寒性的研究提供了一條新的途徑，這些蛋白質(zhì)具有高度的熱穩(wěn)定性和親水性，能夠保護(hù)植物細(xì)胞免受低溫傷害，但是目前真正分離純化出來的低溫誘導(dǎo)蛋白并不多，而且植物的抗寒分子機(jī)理特別是抗凍蛋白的結(jié)構(gòu)特征和生理功能研究仍不夠深入，因此利用內(nèi)源低溫誘導(dǎo)蛋白和外源化學(xué)物質(zhì)調(diào)控技術(shù)來提高煙草的抗寒能力將是煙草抗寒性研究的重點(diǎn)領(lǐng)域。

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