王春暉

（湖南省食用菌研究所，湖南 長沙 410013）

當(dāng)今世界，人口急劇膨脹，資源環(huán)境日益惡化，食品和能源的供應(yīng)日益緊張，農(nóng)業(yè)面臨著巨大壓力，人們將解決食品問題的希望寄托于一場新的農(nóng)業(yè)科技革命。上世紀(jì)七十年代能源危機(jī)后，喚醒了人們對農(nóng)業(yè)、工業(yè)廢棄物再利用的重視。食用菌是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的重要組成部分，聯(lián)合國糧農(nóng)組織向發(fā)展中國家推薦了18種珍稀菌。大規(guī)模利用秸稈、木屑、棉籽殼等廢料來栽培食用菌，已被認(rèn)為是通過生物作用變廢為寶的重要途徑，也將是解決人類面臨的食物短缺，環(huán)境污染和健康質(zhì)量下降等問題的有效途徑，特別是在生產(chǎn)力水平不太發(fā)達(dá)的發(fā)展中國家則更加重要。以生物技術(shù)為主體的現(xiàn)代高新技術(shù)大量應(yīng)用于農(nóng)業(yè)，對農(nóng)業(yè)產(chǎn)生了廣泛而深刻的影響，推動農(nóng)業(yè)和農(nóng)業(yè)科技向更高、更深、更廣的領(lǐng)域發(fā)展。上世紀(jì)興起的發(fā)酵工程技術(shù)、原生質(zhì)體技術(shù)、基因工程技術(shù)等高新生物技術(shù)很快地滲透到食用菌各個領(lǐng)域并被廣泛采用，展現(xiàn)了美好的發(fā)展前景。

1 原生質(zhì)體技術(shù)簡述

原生質(zhì)體是指植物細(xì)胞 （包括真菌和細(xì)菌）在酶的作用下，細(xì)胞壁被酶解后所形成的原生質(zhì)球 （Protoplast）。原生質(zhì)球沒有細(xì)胞壁，因此失去了原有細(xì)胞的固定形態(tài)，但是它依然有細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和完整的遺傳物質(zhì)，是一個具有生理功能的結(jié)構(gòu)單位。原生質(zhì)體技術(shù)是一種以原生質(zhì)體為細(xì)胞基礎(chǔ)發(fā)展起來的細(xì)胞生物工程新技術(shù)，在植物和細(xì)菌中研究應(yīng)用較早，在真菌中起步較晚。原生質(zhì)體技術(shù)在食用菌領(lǐng)域中具有明顯的開拓創(chuàng)新性，它包括以原生質(zhì)體為主體的再生、誘變、融合、單核化和外源DNA導(dǎo)入轉(zhuǎn)化等主要研究內(nèi)容。原生質(zhì)體技術(shù)在食用菌中的應(yīng)用最早見于Daries和Wessels對雙孢蘑菇和草菇的原生質(zhì)體制備和分離。30多年來，食用菌原生質(zhì)體在理論和應(yīng)用上發(fā)展迅速。目前已有60多種食用菌品種成功制備出原生質(zhì)體，原生質(zhì)體技術(shù)食用菌品種的脫毒、提純、復(fù)壯和育種中得到了廣泛的應(yīng)用和推廣。

2 原生質(zhì)體技術(shù)研究應(yīng)用

2.1 原生質(zhì)體無性再生

原生質(zhì)體再生無性繁殖在食用菌的遺傳育種中主要有3個方面的應(yīng)用。一是進(jìn)行脫毒、提純和復(fù)壯，食用菌品種經(jīng)過長期無性繁殖，會導(dǎo)致病菌污染，純度不高，活性不強(qiáng)和退化現(xiàn)象，通過單細(xì)胞原生質(zhì)體再生，可以達(dá)到脫毒、提純和復(fù)壯的目的；二是從再生菌株中選育種性改良的優(yōu)良生產(chǎn)菌株；三是應(yīng)用于真菌細(xì)胞質(zhì)遺傳、核遺傳和生理生化研究。佐木堯從金針菇的雙核菌絲制備的原生質(zhì)體再生無性系發(fā)現(xiàn)了菌落形態(tài)突變株、黃色素等生化突變株。我國在這方面也有報道。郭硯翠等[1]進(jìn)行了黑木耳原生質(zhì)體再生株選育高產(chǎn)菌株研究。何培新等[2]進(jìn)行了光木耳原生質(zhì)體無性系繁殖的研究。朱宏發(fā)等[3]進(jìn)行了原生質(zhì)體復(fù)壯平菇初探。王海英等[4]進(jìn)行了原生質(zhì)體技術(shù)在食用菌育種上的應(yīng)用研究。研究表明，食用菌的原生質(zhì)體再生無性系具有出菇能力強(qiáng)、產(chǎn)量高和早熟等優(yōu)良變異。另外，原生質(zhì)體的形成和再生不是一個簡單的物理化學(xué)變化，而是一個生命過程，伴隨一系列復(fù)雜的生命運動和優(yōu)勝劣汰。原生質(zhì)體再生無性系的變異機(jī)理在于去壁細(xì)胞敏感性增強(qiáng)，再生過程能消除與經(jīng)濟(jì)性狀傳遞有關(guān)的質(zhì)粒，導(dǎo)致次級代謝途徑的變化，從而出現(xiàn)有利于產(chǎn)量性狀的變異。

2.2 原生質(zhì)體誘變

以原生質(zhì)體為誘變對象，與常規(guī)誘變相結(jié)合，稱為原生質(zhì)體誘變。食用菌菌絲為多細(xì)胞，不宜作誘變材料。擔(dān)孢子雖是單細(xì)胞且大多單核，但因其壁厚，誘變劑不易穿透，誘變效果不甚理想。而去除細(xì)胞壁的原生質(zhì)體對外界環(huán)境非常敏感，經(jīng)誘變劑處理后易發(fā)生突變，因此，食用菌原生質(zhì)體誘變育種已成為食用菌原生質(zhì)體育種的一種有效方法。劉國振等[5]以紫外線誘變處理篩選出增產(chǎn)、早熟、抗逆性強(qiáng)、菇型改變、效益提高的香菇菌株，該系統(tǒng)產(chǎn)生的營養(yǎng)缺陷型突變株，為原生質(zhì)體融合研究提供了遺傳標(biāo)記型材料。在側(cè)耳屬和香菇屬中，利用原生質(zhì)體誘變獲得的營養(yǎng)缺陷型菌株在國內(nèi)外都已有不少成功的例子。原生質(zhì)體誘變系統(tǒng)還被應(yīng)用于選育無孢平菇。許囊中等[6]報道用無孢平菇菌株原生質(zhì)體進(jìn)行紫外線誘變處理，經(jīng)拮抗試驗、孢子印檢測、掃描電鏡和出菇試驗，篩選出1株中低溫型、高產(chǎn)、菇型好的無孢平菇突變菌株。張淵等[7]進(jìn)行了刺芹側(cè)耳原生質(zhì)體誘變育種初報。與常規(guī)誘變比較，真菌原生質(zhì)體誘變具有幾大優(yōu)點：原生質(zhì)體誘變無須帶任何標(biāo)記，操作簡便、成本低，直接選取性能優(yōu)良的菌株重復(fù)誘變即可收到明顯效果；原生質(zhì)體誘變敏感性增強(qiáng)，誘變因子更直接作用于DNA，突變率提高，變異幅度增大，更易得到優(yōu)良變異株，提高育種效率；原生質(zhì)體是單細(xì)胞的，而且有一部分是單核的，有助于均勻地和誘變劑結(jié)合，有助于突變基因的表達(dá)，提高誘變的效果；原生質(zhì)體的獲得不受時間因素的限制，這使得原生質(zhì)體誘變在食用菌育種中顯示出巨大的活力。常規(guī)孢子誘變，孢子來源于子實體，受時間與季度限制，而原生質(zhì)體可以通過菌絲體酶解隨時得到。當(dāng)然，在實際操作中，原生質(zhì)體誘變也存在著一些同常規(guī)誘變一樣不可改變的缺點。

2.3 原生質(zhì)體融合

原生質(zhì)體融合 （Protoplast fusion）是指通過去除細(xì)胞壁后的不同遺傳類型的原生質(zhì)體，在融合劑的誘導(dǎo)下進(jìn)行結(jié)合，最終達(dá)到部分或者整套基因重組，產(chǎn)生出新的品種和類型，也就是說原生質(zhì)體融合育種技術(shù)是一種不通過有性生活史而達(dá)到遺傳重組或有性雜交的育種手段。原生質(zhì)體融合育種技術(shù)同基因工程技術(shù)相比，其技術(shù)難度較小，所需要的設(shè)備簡單，不需要大量的藥品和價格昂貴的儀器，因此，原生質(zhì)體融合技術(shù)是現(xiàn)代生物工程中最重要的遺傳操作技術(shù)之一。

原生質(zhì)體融合技術(shù)研究是近幾年食用真菌原生質(zhì)體育種中的活躍領(lǐng)域，技術(shù)大致包括有原生質(zhì)體的制備、遺傳標(biāo)記、原生質(zhì)體融合及融合子的篩選等?？茖W(xué)研究已取得了有效的成果，得到了少數(shù)種間或者屬間、科間的融合子。Masahide S[8]進(jìn)行毛木耳營養(yǎng)突變體種間融合獲得成功。肖在勤等[9]把經(jīng)滅活的原生質(zhì)體，以PEG為助融劑，在高鈣、高pH值條件下，獲得科間原生質(zhì)體融合子。孫麗等[10]進(jìn)行香菇和瓜哇香菇種間融合，得到2株融合子，其生長特征明顯不同于親本。李省印等[11]進(jìn)行平菇種內(nèi)原生質(zhì)體分離與融合雜育種研究，得到種內(nèi)雜融合子5株，其中有4株融合子再生出菌絲體和子實體，選育出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、高抗新菌株優(yōu)生1號新品系。王春暉等 （2008年）應(yīng)用原生質(zhì)體融合技術(shù)，選育出湘杏98融合新菌株，技術(shù)成果通過省級鑒定，新菌株生物轉(zhuǎn)化率比對照菌株提高28.6%。

在融合試驗中，親本菌株多數(shù)帶有缺陷遺傳標(biāo)記，液體培養(yǎng)基營養(yǎng)要求豐富，使菌絲體在短時間內(nèi)旺盛生長。原生質(zhì)體的釋放量與酶解時間成正比，但酶解時間越長，原生質(zhì)體的再生率越低。解決這一矛盾的方法是在酶液濃度不變條件下，加大酶液用量，縮短酶解時間。既保證有一定數(shù)量的原生質(zhì)體釋放，又保證原生質(zhì)體有較高的生活力和再生率。酶解時要調(diào)整好兩親本的酶解時間，防止酶液去除后原生質(zhì)體失活或再生壁的形成。在純化原生質(zhì)體時，應(yīng)盡量除去菌絲殘片，以免影響原生質(zhì)體的融合和再生效果。在融合前期適當(dāng)攪動增加碰撞機(jī)會，后期靜止有利于融合的發(fā)生。PEG有一定的毒性，影響原生質(zhì)體的再生率，加等滲液或再生液體培養(yǎng)基，既可降低PEG濃度，減少PEG毒性，提高原生質(zhì)體的融合率。同時，控制好再生溫度等環(huán)境條件，提高再生率。

在融合子的鑒定方面， 同工酶分析是采用最普遍的方法。酯酶是一種普遍存在且相對穩(wěn)定的酶系，其同工酶譜具有較高的多型性，可作為雜種鑒定的指標(biāo)，同時木質(zhì)素、纖維素酶活也可作為參考指標(biāo)。較為實用的另一種鑒定方法是融合株與親本株的拮抗試驗，拮抗表現(xiàn)的多樣性反映融合子的變異程度，同時菌株形態(tài)生長特性上的自然標(biāo)記，也可以鑒別異源融合株。當(dāng)然利用缺陷遺傳標(biāo)記或RAPD等分子標(biāo)記，鑒定分析融合株更具可靠性和科學(xué)性。

2.4 原生質(zhì)體單核化

單核體是異宗結(jié)合食用菌雜交育種中的基本材料，雙核體單核化的方法主要有分生孢子分離、化學(xué)處理、機(jī)械分割，這些方法有一些局限性和難度。原生質(zhì)體單核化是同宗和異宗結(jié)合蕈菌的普遍現(xiàn)象。原生質(zhì)體單核體和由孢子萌發(fā)形成的單核體具有不同的遺傳特性，前者可認(rèn)為是親本的無性后代，后者則是通過減數(shù)分裂的有性后代。利用原生質(zhì)體單核雜交，親本中好的性狀，可以得到穩(wěn)定的表達(dá)，有性孢子獲得單核體雜交，親本中好的性狀就會丟失。潘迎捷[12]開展單核和同核原生質(zhì)體技術(shù)在食用菌遺傳育種上的應(yīng)用。國內(nèi)一些教學(xué)研究單位開展香菇及木耳等蕈菌原生質(zhì)體再生質(zhì)體單核菌絲交配分析和雜交育種的技術(shù)研究，均取得了可喜的結(jié)果。楊岱筠等[13]開展白色金針菇原生質(zhì)體單核菌系的建立及其遺傳特性分析。薛麗娥等

[14]運用原生質(zhì)體融合技術(shù)培育香菇新品種。焦海濤等[15]報道了香菇原生質(zhì)體單核體雜交方法試驗，各親本、單核體生長速度明顯慢于雙核菌絲，雜交株與親本的酯酶同工酶存在著較大差異。原生質(zhì)體單核化現(xiàn)象是原生質(zhì)體技術(shù)在食用菌遺傳和育種研究中的一個重要分支。單核化原生質(zhì)體育種，無需經(jīng)過減數(shù)分裂，有利于親本優(yōu)良性狀的保存和穩(wěn)定表達(dá)；無需進(jìn)行孢子收集和單孢分離，親本性狀可以達(dá)到集中表達(dá)，有利于減少工作量，縮短育種時間，可以為菌根真菌等野生珍稀菌的馴化育種提供單核材料，為同宗結(jié)合的食用菌雜交育種提供了一個有效途徑。由于單核原生質(zhì)體具有特殊的遺傳背景，在理論上是研究其基因定位和遺傳性狀的重要材料，在育種上形成了以單核原生質(zhì)體為材料的新方向，具有廣闊的應(yīng)用和推廣前景。

2.5 外源基因轉(zhuǎn)化與導(dǎo)入

轉(zhuǎn)化技術(shù)在微生物遺傳改良、基因工程中占十分重要的地位，但大部分微生物的自然轉(zhuǎn)化能力很低，特別是真核微生物幾乎很少能發(fā)現(xiàn)自然轉(zhuǎn)化。食用菌中的遺傳轉(zhuǎn)化已有多例成功的報道，包括糙皮側(cè)耳、楊樹菇、紫孢側(cè)耳、雙孢蘑菇等。外源DNA導(dǎo)入即提供供體的DNA，把它導(dǎo)入受體，使一定異源DNA片段整合到染色體上。在真菌尤其是食用菌中用外源DNA導(dǎo)入進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化是一種有效的育種手段，它可以克服原生質(zhì)體融合難以得到融合子的特點，又不需要一定載體及限制性內(nèi)切酶，也能有效地克服屬間遠(yuǎn)緣雜交的困難，有時甚至獲得意想不到的效果。

外源DNA導(dǎo)入的方法有多種，如CaCl2/PEG介導(dǎo)法、顯微注射法、脂質(zhì)體法、電激法等，同時很多實驗證明原生質(zhì)體有直接吸收多種外源性物質(zhì)的能力，其中包括DNA在內(nèi)。Davey（1980年）用裸露的質(zhì)粒DNA通過PEG和高pH作用處理煙草原生質(zhì)體后，發(fā)現(xiàn)T－DNA已整合到細(xì)胞核中。楊虹 （1990年）將蘇云金芽孢桿菌與S－內(nèi)霉素基因?qū)胨驹|(zhì)體后獲得轉(zhuǎn)基因植株。目前，外源基因?qū)胧秤镁淖畛Ｓ梅椒ㄊ荂aCl2/PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。王春暉等[16]以平雜49 DNA為供體，草菇V157為受體，用PEG、CaCl2作誘導(dǎo)劑，選育出草菇V157－1優(yōu)良品種。王春暉[17]將湘平992 DNA導(dǎo)入瀏陽麻菇原生質(zhì)體，選育出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)麻菇新品種。

3 總結(jié)和展望

筆者認(rèn)為食用菌原生質(zhì)體技術(shù)育種與傳統(tǒng)的育種方法相比有3個方面的特點與優(yōu)勢：原生質(zhì)體的形成與再生過程既是一個生命過程，也是一個引發(fā)變異和優(yōu)勝劣汰的過程，涉及一系列基因與酶的變化，活力強(qiáng)、遺傳信息完整的個體能優(yōu)先再生成無性系，成為單個細(xì)胞擴(kuò)繁的菌落，這些菌落酶活、生長速度、大小等形態(tài)與生理指標(biāo)趨于一致，比組織分離效果好，在一定程度上能提高生物轉(zhuǎn)化效率，因此，原生質(zhì)體無性再生不失為一種育種手段，值得在食用菌品種提純與復(fù)壯上推廣應(yīng)用；原生質(zhì)體不受細(xì)胞壁的限制，能形成單核體，能吸收多種外源性物質(zhì)，對外界刺激敏感性強(qiáng)，突變性強(qiáng)，為基因和遺傳性狀研究、誘變突變株的篩選、外源DNA的導(dǎo)入與轉(zhuǎn)化等試驗提供了良好的實驗材料和新的研究方向，具有廣闊的研究和應(yīng)用前景，要加大研發(fā)力度，并及時轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力；原生質(zhì)體融合育種不受親緣關(guān)系的影響，遺傳信息傳遞量大，不需要詳細(xì)了解雙親的遺傳背景，操作方便，適用性強(qiáng)，可以實現(xiàn)遠(yuǎn)源原生質(zhì)體融合，通過融合打破種間不能進(jìn)行體細(xì)胞雜交的屏障，實現(xiàn)種間遺傳物質(zhì)的重組，為遺傳物質(zhì)的變異提供了最大的可能性，為食用菌新品種的選育提供了廣闊的發(fā)展前景。

原生質(zhì)體融合育種可以作為我國食用菌產(chǎn)業(yè)新品種研發(fā)的重點領(lǐng)域，同時原生質(zhì)體技術(shù)在發(fā)展過程中也存在著一些問題，需要進(jìn)一步改進(jìn)完善，主要有幾個方面：原生質(zhì)體形成與再生受酶解時間、酶解濃度、鈣離子濃度、整合劑、滲透壓穩(wěn)定劑、酶系、菌絲菌齡等多種因素的影響，原生質(zhì)技術(shù)系統(tǒng)性強(qiáng)，一定要在原生質(zhì)體制備、純化和再生技術(shù)很成熟的條件下，才能取得成功，行業(yè)要對原生質(zhì)體技術(shù)進(jìn)行集成和熟化；原生質(zhì)體融合和再生率總體不高，融合子再生率則更小，同時融合子尤其是遠(yuǎn)緣融合子存在著一定不穩(wěn)定性，需要時間進(jìn)行穩(wěn)定性試驗，要獲得正向的研究結(jié)果，往往需要經(jīng)過多次反復(fù)試驗，因此，在原生質(zhì)體育種過程中，制備、再生、篩選工作依然顯得繁重，有待于進(jìn)一步改進(jìn)和創(chuàng)新；原生質(zhì)體技術(shù)育種中難點和重點之一在于融合子的篩選，目前原生質(zhì)體融合子選擇的標(biāo)記與方法主要有形態(tài)標(biāo)記、生理生化指標(biāo)、營養(yǎng)缺陷和抗藥性標(biāo)記等，這些標(biāo)記技術(shù)盡管可行并有一定的發(fā)展，但每一種方法都有局限性，只能適用于一定的條件與范圍，而且存在著一些不確定性因素的影響，需要不斷改良，向分子標(biāo)記方向發(fā)展，提高篩選的準(zhǔn)確性、可靠性。

研究與應(yīng)用表明，原生質(zhì)體生物新技術(shù)、新方法為食用菌遺傳育種、物種鑒別、核型分析、外源染色體檢測、基因定位和基因轉(zhuǎn)移等方面向更高、更深的領(lǐng)域發(fā)展奠定了堅實的基礎(chǔ)。由于食用菌病蟲害日趨嚴(yán)重，所以將原生質(zhì)體技術(shù)和DNA分子技術(shù)結(jié)合，用分子生物學(xué)方法培養(yǎng)新品種已成為當(dāng)代食用菌科研工作者的重任。隨著食用菌技術(shù)的高新化及相應(yīng)的高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)化，食用菌的科研和產(chǎn)業(yè)將更加燦爛輝煌，生物工程和基因工程的新技術(shù)、新成果、新工藝、新產(chǎn)品將不斷問世，前景十分廣闊。

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