于霞 黃海榮

(北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所 北京 101149)

噬菌體治療結(jié)核病研究進展

于霞 黃海榮

(北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所 北京 101149)

細菌噬菌體(bacteriophage)是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒,由F.d'Herelle(1917年)和 F.W.Twort(1915年)各自獨立發(fā)現(xiàn)[1]。1947年,Gardner首次分離并命名了分枝桿菌噬菌體,至今已發(fā)現(xiàn)250多種分枝桿菌噬菌體。早在20世紀30年代,噬菌體已被嘗試應用于感染性疾病的治療,然而隨著高效抗生素的大量開發(fā),噬菌體治療感染的作用逐漸被冷落,直到近年,由于各種致病細菌的耐藥情況日趨嚴重,噬菌體治療才又受到關(guān)注。隨著對噬菌體研究的不斷深入,目前已有60多種分枝桿菌噬菌體的全基因序列和特性被闡明[2],為噬菌體治療分枝桿菌感染奠定了基礎(chǔ)。本文擬對噬菌體在結(jié)核病治療方面的研究予以綜述。

1 噬菌體治療結(jié)核病的發(fā)展歷程和現(xiàn)狀

1.1 噬菌體的分類和結(jié)構(gòu)特點 根據(jù)噬菌體對其宿主菌的作用方式,可將噬菌體分為兩類,即烈性噬菌體和溫和性噬菌體[3]。烈性噬菌體感染敏感細菌后,可在其細胞內(nèi)快速增殖并使之裂解,故又稱毒性噬菌體。溫和噬菌體侵入宿主細胞后,其核酸附著并整合在宿主染色體上與宿主核酸同步復制,但宿主菌不裂解反而繼續(xù)生長。因此,從作用原理看,治療用噬菌體以裂解型噬菌體為主。噬菌體顆粒在結(jié)構(gòu)上分為三種類型：無尾結(jié)構(gòu)的十二面體,如L5,D29,DS6A,TM4,Bxz2,Che9c等;有尾結(jié)構(gòu)的二十面體,如I3和Bxz1;線狀體。迄今已知的噬菌體大多是有尾結(jié)構(gòu)的二十面體[4]。

1.2 噬菌體治療作用的早期研究 噬菌體治療細菌感染不是一個新概念。1921年,Bruynoghe和Maisin首次發(fā)表了噬菌體治療人類葡萄球菌感染的報告,被感染的外科手術(shù)傷口可在應用噬菌體治療后24～48 h內(nèi)消退[5]。20世紀 30—40年代,美國一些大型醫(yī)藥公司也開發(fā)出治療葡萄球菌和結(jié)腸桿菌等感染的噬菌體,但之后由于抗生素的出現(xiàn)和廣泛應用,許多細菌感染能夠得到快速有效控制,噬菌體治療受到了冷落,西方國家停止了商業(yè)性生產(chǎn),只有前蘇聯(lián)和一些東歐國家繼續(xù)將之與抗生素一起使用[6]。

1.3 噬菌體質(zhì)量新被關(guān)注的原因 隨著抗生素的大范圍應用以及誤用和濫用,導致抗生素耐藥現(xiàn)象嚴重。全球結(jié)核病例中 13.3%對異煙肼單耐藥,0.6%對利福平單耐藥,5.3%為耐多藥(MDRTB)[7]。全世界每年新出現(xiàn)的 MDR-TB患者50萬,XDR-TB[8]達到5萬例。根據(jù)我國2007年全國耐藥性結(jié)核病基線調(diào)查的情況推測,我國每年新發(fā)MDR-TB 12萬,XDR-TB近1萬。耐藥結(jié)核病的廣泛流行使得結(jié)核病的治療陷入困境[9-10]。與此同時,非結(jié)核分枝桿菌(NTM)的感染也逐漸增多[11-12],中國基線調(diào)查NTM 獲得率3.4%,廣東報道高于20%。由于非結(jié)核分枝桿菌對大多數(shù)抗結(jié)核藥物天然耐藥[13],因此常用的抗結(jié)核藥物療效較差?；谝陨显?結(jié)核病的治療需要開拓思路,尋求多渠道的治療方式,由此應用噬菌體治療結(jié)核病又受到關(guān)注。

1.4 噬菌體治療結(jié)核的研究 噬菌體作為耐藥結(jié)核的一種新的治療方法,在體內(nèi)和體外的治療已取得初步的成效。Ranjan[14]等通過對6種已測序的分枝桿菌噬菌體 Che9c,D29,Bxz1,Bxb1,ω和TM4進行相對同義密碼子分析,得出TM4是適合噬菌體療法的殺菌最強的噬菌體。Broxmeyer[15]等在體外對大鼠腹腔巨噬細胞系建立結(jié)核和鳥分枝桿菌感染模型,然后用恥垢做載體攜帶 TM4到達感染的巨噬細胞,證實了TM4對于分枝桿菌的感染無論是預防還是治療均有意義。Danelishvili等[16]對小鼠尾靜脈攻毒建立鳥分枝桿菌感染模型,分別給予噬菌體、恥垢、恥垢-噬菌體治療。結(jié)果單獨噬菌體,單獨恥垢組與空白對照組均差異無統(tǒng)計學意義,只有恥垢和TM4混合組細菌數(shù)量與對照組差異明顯。實際上,48 h后恥垢-噬菌體組的細菌數(shù)量就下降100倍。黃新[17]等用超聲波分散法把噬菌體制成脂質(zhì)體包被液,對耐藥結(jié)核菌小鼠模型行氣管切開法滴入治療,效果優(yōu)于化療組,治療60 d轉(zhuǎn)陰率為75%,治療120 d轉(zhuǎn)陰率87%。彭麗等[18]通過對小鼠大腿內(nèi)側(cè)皮下攻毒建立體表病灶,用滴鼻的方式給與噬菌體,治療18 d體內(nèi)出現(xiàn)噬菌體中和抗體,協(xié)同噬菌體殺滅病灶內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌。由此可見,噬菌體對于分枝桿菌的治療在動物實驗水平已經(jīng)取得了明顯的成效。

1.5 噬菌體的治療價值 噬菌體治療較其他方法治療存在明顯的優(yōu)勢。(1)指數(shù)增值：分枝桿菌噬菌體在體內(nèi)也會以指數(shù)形式增值,由此可能減少后續(xù)給藥,甚至是無需后續(xù)給藥,因此維持血藥濃度方面要優(yōu)于抗生素。(2)不良作用小：噬菌體治療具有特異性,只針對致病菌,很少有不良作用。Bruttin[19]等對15名健康受試者接受口服噬菌體治療后,均無肝毒性,15人中僅有4例有輕微不良反應,3例胃腸道不適,1例喉嚨疼痛。但噬菌體對于分枝桿菌的治療尚處于動物實驗階段,對于噬菌體的安全性和不良反應尚需要進一步研究。(3)成本低：噬菌體只需通過簡單的體外擴增就可獲得,并且噬菌體在體外的保存相對穩(wěn)定。彭麗等[20]對7種分枝桿菌噬菌體的擴增和保存條件進行研究,得出感染48 h后采用孵育-過濾方法收集的噬菌體效價高且方法簡單。液體4℃保存的噬菌體穩(wěn)定性好,在28周內(nèi)噬菌體效價均未降低101數(shù)量級以上。因此,噬菌體治療在成本方面也有很大優(yōu)勢。(4)與藥物治療或其他治療的機制完全不同,不宜產(chǎn)生交叉耐藥,可以與其他藥物或治療手段聯(lián)合應用以提高療效。

2 噬菌體治療中需要關(guān)注的因素

2.1 噬菌體的宿主范圍 噬菌體具有嚴格的宿主特異性,只寄居在易感的宿主菌體內(nèi),一旦離開宿主細胞噬菌體即不能生長又不能復制,但噬菌體的宿主范圍是不可預測的[4]。Rybniker[21]等通過對14種分枝桿菌噬菌體在7H10培養(yǎng)基上能否形成噬菌斑來判定是否可以感染分枝桿菌,其中可以裂解結(jié)核分枝桿菌的噬菌體有Bxz2,D29,L5,TM4。TM4的宿主有恥垢,結(jié)核,BCG,潰瘍;D29,Bxz2和 L5宿主范圍很廣,包括恥垢,結(jié)核,BCG,鳥,潰瘍,另外L5和Bxz2還可以感染偶然和膿腫分枝桿菌。因為噬菌體具有嚴格的宿主特異性,在使用噬菌體治療感染時,一定要明確感染的分枝桿菌菌種之后再進行個性化治療。目前,在診斷方面應用較多的是D29,通過噬菌體生物擴增法檢測臨床標本中的結(jié)核分枝桿菌及對利福平的耐藥性。在治療方面應用較多是TM4,在體內(nèi)外治療分枝桿菌感染均取得了較好的療效[15-16]。

2.2 不同給藥途徑對療效的影響 噬菌體作為一種外源性微生物,機體存在清除體內(nèi)噬菌體的趨勢。如何提高噬菌體在機體內(nèi)的半衰期將直接影響到治療效果和重復給藥間隔,而不同的給藥途徑與噬菌體的半衰期直接相關(guān)。針對肺結(jié)核,主要寄居于單核巨噬細胞內(nèi),因此要想使噬菌體有效地到達病灶,避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除,必須要一種合適的載體將其保護然后轉(zhuǎn)運到病灶[15-17]。針對腸結(jié)核,可以口服噬菌體。Chibani-Chennoufi[22]等通過口服噬菌體治療由產(chǎn)腸毒大腸桿菌引起的腹瀉,結(jié)果噬菌體只感染產(chǎn)腸毒的大腸桿菌,而對正常腸道菌落無影響。局部病灶直接給藥,理論上避免了循環(huán)系統(tǒng)的免疫防御機制,被清除的可能性最小。

2.3 噬菌體治療劑量的確定和是否需要重復給藥噬菌體治療致細菌感染必定存在2個途徑：被動治療和主動治療。被動治療與傳統(tǒng)抗生素療法相似,就是首次用量大,一次性殺傷敏感菌,但可根據(jù)需要重復追加用藥。主動治療是指噬菌體利用自身復制的優(yōu)勢在感染細菌后增殖,以達到持續(xù)治療的目的。傳統(tǒng)的抗生素用藥越早越好,而噬菌體則不然。Payne等根據(jù)噬菌體治療的動力學原理解釋說,主動免疫會出現(xiàn)一種矛盾,就是噬菌體只有在細菌達到一定密度的時候才開始增殖,噬菌體接種過早或劑量不合適,可能會在開始增殖之前就被機體清除掉[23]。所以,確定最佳接種時間和劑量將成為噬菌體治療的一大難題。

2.4 噬菌體抗性 如同抗生素治療,是否產(chǎn)生噬菌體抗性也決定了此種治療方式的連續(xù)性和有效性。噬菌體在感染細菌之前,首先要與細菌細胞壁的蛋白受體結(jié)合,然后將其DNA注射到細菌體內(nèi)。因此,任何與這兩個過程相關(guān)的基因突變都會導致噬菌體抗性的產(chǎn)生。通過對恥垢分枝菌耐D29菌株篩查,并未發(fā)現(xiàn)細胞壁受體的缺失,唯一的變化是mpr基因的過表達,而mpr基因可以阻止噬菌體DNA進入細菌。這種基因過表達也可以對噬菌體L5產(chǎn)生抗性,部分對 TM4抗性,但不影響B(tài)xb1和I3感染[24]。因此,在使用噬菌體治療前和治療過程中,也應定期進行敏感性試驗,及時了解噬菌體對細菌的殺傷活力。

3 噬菌體治療的展望

噬菌體治療結(jié)核病的研究雖然肯定了其療效,但在真正應用于臨床之前,還需要從多個角度出發(fā),從多個方面改善噬菌體的治療作用。主要涉及以下幾個方面：

3.1 噬菌體基因重組 為了提高噬菌體的治療效率,延長噬菌體在體內(nèi)的半衰期,降低噬菌體治療的不良作用,可以通過基因重組技術(shù)對噬菌體進行基因修飾。

3.1.1 提高療效 對噬菌體的衣殼蛋白進行修飾,從而改變其藥代動力學,生物分布和免疫原性,更好的治療細菌感染。也可將噬菌體衣殼蛋白與藥物偶聯(lián),一個藥物分子可攜帶多個噬菌體,到達體內(nèi)環(huán)境時,從藥物中釋放出來發(fā)揮殺菌作用[25]。

3.1.2 降低不良作用 一些噬菌體帶有重組基因[26-28],如分枝桿菌噬菌體ch9c編碼的蛋白gp60和gp61與大腸分枝桿菌中的recT和recE同源,分枝桿菌噬菌體HALO的gp43和 giles的gp53相似,但與rec類似蛋白較遠,也可以介導同源重組。裂解型噬菌體在感染分枝桿菌時,會導致內(nèi)毒素水平的增加,因此可以對溫和型噬菌體進行基因重組,使之攜帶殺菌的基因,從而有效殺菌和減少內(nèi)毒素的釋放[29]。Hagen和 Bl?si[30]通過對 M13噬菌體進行基因重組,加入限制性內(nèi)切酶BgⅢ基因或是經(jīng)過修飾的噬菌體Holin基因,這種基因修飾的噬菌體在發(fā)揮高效的殺菌作用的同時又保持細菌細胞結(jié)構(gòu)的完整,相對于裂解性噬菌體,內(nèi)毒素的釋放量大大減少。分枝桿菌噬菌體在治療結(jié)核時,也可以對非裂解型噬菌體進行基因修飾,以達到有效殺菌又減少不良作用的目的。

3.1.3 改造使噬菌體能夠不易被機體清除,即長效的噬菌體。通過對噬菌體進行改造,使其免受網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除,從而延長在體內(nèi)的存活時間,不需要反復用藥,即可以保持有效地殺菌能力,因為噬菌體也具有預防結(jié)核的作用,體內(nèi)的長效噬菌體也可以抑制持留菌。

3.2 給藥途徑的優(yōu)化 使用噬菌體治療感染時,要根據(jù)感染部位選擇合適的給藥途徑,從而達到最佳治療效果。針對肺結(jié)核,結(jié)核菌寄居于巨噬細胞,因此要想使噬菌體避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除有效到達病灶,必須要一種合適的載體將其保護然后轉(zhuǎn)運到病灶;針對結(jié)腦,能通過血腦屏障的抗結(jié)核藥物很少,噬菌體能通過血腦屏障[31],可以考慮直接靜脈注射的方式治療。針對腸結(jié)核,可口服噬菌體并對其進行包被,只有達到腸道才能釋放,盡可能減少胃酸殺傷作用;針對體表結(jié)核,可以采用局部皮下注射的方式或是制成合劑外敷,滲透到病灶內(nèi)達到治療的目的。

3.3 通過噬菌體特異位點開發(fā)新藥 噬菌體的殺菌機制也為新藥的研發(fā)提供依據(jù)。projan[32]認為與其利用噬菌體本身來治療,還不如通過噬菌體的殺菌機制來研發(fā)新的抗生素。Liu[33]等對26種黃色葡萄球菌噬菌體進行測序,證實31種蛋白或多肽抑制細菌的生長。從噬菌體篩選出殺菌作用的靶蛋白,找到靶蛋白的小分子抑制劑,進而加工成有殺菌作用的抗生素。Rybniker[34]等通過分枝桿菌穿梭載體,證實了噬菌體 L5在復制初期的3種毒性蛋白抑制了恥垢分枝桿菌的生長。通過毒性多肽確定細菌細胞內(nèi)的靶蛋白,就可以成為藥物的作用位點。

4 結(jié)語

噬菌體治療結(jié)核病的研究方興未艾,已獲得的數(shù)據(jù)都顯示此種方法有效且具有一定的可行性。在比利時布魯塞爾,醫(yī)學倫理委員會于2007年批準醫(yī)務工作者用噬菌體治療由綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌引起的燒傷后感染[35]。雖然噬菌體對結(jié)核病的治療還處于動物實驗階段,但在全球結(jié)核耐藥現(xiàn)象嚴重和非結(jié)核分枝桿菌發(fā)病有所上升的背景下,噬菌體作為一種新的治療手段,通過進一步研究可能具有廣闊的應用前景。

[1]Broxmeyer L.Bacteriophages：antibacterials with a future?[J].M ed Hy potheses,2004,62(6)：889-893.

[2]Hatfull GF,Jacobs-Sera D,Lawrence JG,Pope WH,Russell DA,Ko CC,Weber RJ,Patel MC,Germane KL,Edgar RH,Hoyte NN,Bowman CA,T antoco AT,Paladin EC,Myers M S,Smith AL,Grace MS,Pham T T,O'Brien M B,Vogelsberger AM,Hry ckowian AJ,Wy nalek JL,Donis-Keller H,Bogel MW,Peebles CL,Cresawn SG,Hendrix RW.Comparative genomic analysis of 60 Mycobacteriophage genomes：genome clustering,gene acquisition,and gene size[J].mol biol,2010,397(1)：119-143.

[3]Lenski RE.Dynamics of interactions between bacteria and virulent bacteriophage[J].Adv Microb Ecol,1988,10：1-44.

[4]吳雪瓊,張宗德,樂軍.分枝桿菌分子生物學[M].北京：人民軍醫(yī)出版社,2010：54-57.

[5]Chanishvill N,Chanishvili T,T ediashvili M.Phages and their application against drug-resistant bacteria[J].Journal of Chemical T echnology and Biotechnology,2001,76：689-699.

[6]Clark JR,March JB.Bacteriophages and biotechnology：vaccines,gene therapy and antibacterials[J].Trends Biotechnol,2006,24(5)：212-218.

[7]Bergval IL,Schuitema AR,Klatser PR,Anthony RM.Resistant mutants ofMycobacterium tuberculosisselectedin vitrodo not reflect thein vivomechanism of isoniazid resistance[J].J Anti-microb Chemother,2009,64(3)：515-523.

[8]anerjee R,Allen J,Westenhouse J,Oh P,Elms W,Desmond E,Nitta A,Royce S,Flood J.Extensively drug-resistant tuberculosis in California 1993—2006[J].Clin Infect Dis,2008,47(4)：450-457.

[9]Fox W,Ellard GA,Mitchison DA.Studies on the treatment of tuberculosis undertaken by the British M edical Research Council tuberculosis units,1946—1986,with relevant subsequentpublications[J].Int J Tuberc Lung Dis,1999(10 Suppl2)：S231-279.

[10]O'Brien RJ,Nunn PP.The need for new drugs against tuberculosis[J].Am J Respir crit Care Med,2001,162：1055-1058.

[11]Cassidy PM,Hedberg K,Saulson A,McNelly E,Winthrop KL.Nontuberculous mycobacterial disease prevalence and risk facto rs：a changing epidemiology[J].Clin Infect Dis,2009,49(12)：124-129.

[12]Billinger ME,Olivier KN,Viboud C,de Oca RM,Steiner C,Holland SM,P revots DR.Nontuberculous mycobacteria-associated lung disease in hospitalized persons,United States,1998—2005[J].Emerg Infect Dis,2009,15(10)：1562-1569.

[13]akarova MV,Freǐ man GE.Study of the drug-sensitivity of nontuberculous mycobacteria[J].Probl T uberk Bolezn Legk,2009,7：55-58.

[14]Ranjan A,Vidyarthi AS,Poddar R.Evaluation of codon bias perspectives in phage therapy ofMycobacterium tuberculosisby multivariate analysis[J].In Silico Biol,2007,7(4-5)：423-431.

[15]Broxmeyer L,Sosnowska D,Miltner E,Chacón O,Wagner D,McGarvey J,Barletta RG,Bermudez LE.Killing of Mycobacterium avium andMycobacterium tuberculosisby a mycobacteriophage delivered by a nonvirulent mycobacterium：a model for phage therapy of intracellular bacterial pathogens[J].J Infect Dis,2002,186(8)：1155-1160.

[16]Danelishvili L,Young LS,Bermudez LE.In vivoefficacy of phage therapy for Mycobacterium avium infection as delivered by a nonvirulent mycobacterium[J].Microb DrugResis,2006,12(1)：1-6.

[17]黃新,高飛絮,常勝合,秦廣雍,方華圣.噬菌體脂質(zhì)體包被液治療小鼠耐多藥結(jié)核的初步研究[J].中國新藥雜志,2008,17(6)：482-485.

[18]彭麗,羅永艾,陳保文,黎友倫,沈小兵,王國治.噬菌體對結(jié)核病模型豚鼠免疫功能的影響[J].醫(yī)藥導報,2006,25(8)：767-770.

[19]Bruttin A,Brǜssow H.Human volunteers receiving Escherichia coli phage T 4 orally：a sfety test of phage therapy[J].Antimicrob Agents Chemother,2005,49(7)：2874-2878.

[20]彭麗,羅永艾,沈小兵,王國治.分枝桿菌噬菌體生物學特性探討[J].微生物學免疫學進展,2005,33(1)：19-23.

[21]Ry bniker J,K ramme S,Small PL.Host range of 14 mycobacteriophages in Mycobacterium ulcerans and seven other mycobacteria includingMycobacterium tuberculosis—application for identifyication and susceptibility testing[J].J Med Microbiol,2006,55(1)：37-42.

[22]Chibani-Chennoufi S,Sidoti J,Bruttin A,Kutter E,Sarker S,Brǜssow H.In vitroandin vivobacteriolytic activities ofEscherichia coliphages：implications fo r phage therapy[J].Antimicrob Agents Chemother,2004,48(7)：2558-69.

[23]Platt R,Rey nolds DL,Phillips GJ.Development of a novel method of lytic phage deliveryby use of a bacteriophage P22 site-specific recombination system[J].FEMS Microbiol Let 2003,223(2)：259-265.

[24]Barsom EK,Hatfull GF.Characterization of My cobacterium smegmatis gene that confers resistance to phages L5 and D29 when overexpressed[J].Mol Microbiol.1996,21(1)：159-170.

[25]Yacoby I,Shamis M,Bar H,Shabat D,Benhar I.Targeting antibacterial agents by using drug-carrying filamentous bacteriophages[J].Antimicrob Agents Chemother,2006,50(6)：2087-2097.

[26]van Kessel JC,Hatfull GF.Recombineering inMycobacterium tuberculosis[J].Nat M ethods,2007,4(2)：147-152.

[27]van Kessel JC,Hatfull GF.Efficient point mutagenesis in mycobacteria using single-stranded DNA recombineering：characterization of antimy cobacterial drug targets[J].M ol Microbiol,2008,67(5)：1094-1107.

[28]van Kessel JC,Hatfull GF.Mycobacterial recombineering[J].MethodsMol Biol,2008,435：203-215.

[29]Westwater C,Kasman LM,Schofield DA,Werner PA,Dolan JW,Schmidt MG,Norris JS.Use ofgenetically engineered phage to deliver antimicrobial agents to bacteria：an alternatevetherapy for treatment of bacterial infections[J].Antimicrob Agents Chemother,2003,47(4)：1301-1307.

[30]Hagens S,Bl? si U.Genetically modified filamentous phage as bactericidal agents：a pilotstudy[J].Lett Appl Microbiol,2003,37(4)：318-323.

[31]Barrow PA,Soothill JS.Bacteriophage therapy and prophy laxis：rediscovery and renewed assessment of potential[J].Trends Microbiol,1997,5(7)：268-271.

[32]Projan S.Phage-inspired antibiotics?[J].Nat Biotechnol,2004,22(2)：167-168.

[33]Liu J,Dehbi M,Moeck G,A rhin F,Bauda P,Bergeron D,Callejo M,Ferretti V,Ha N,Kwan T,M cCarty J,Srikumar R,Williams D,Wu JJ,Gros P,Pelletier J,DuBow M.Antimicroial drug discovery throug h bacteriophage genomics[J].Nat Biotechnol,2004,22(2)：185-191.

[34]Rybniker J,Plum G,Robinson N,Small PL,Hartmann P.I-dentification of three cy totoxic early proteins of mycobacteriophage L5 leading to growth inhibition in My cobacterium smegmatis[J].Microbiology,2008,154(8)：2304-2314.

[35]Verbeken G,De Vos D,Vaneechoutte M,Merabishvili M,Zizi M,Pirnay JP.European regulatory conundrum of phage therapy[J].Future Microbiol,2007,2(5)：485-491.

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黃海榮(hairong.huangcn@gmail.com)

2010-02-08)

(本文編輯：張曉進)