王 軼,劉珊珊,黃 瑾

(中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院1.ICU;2.呼吸科,廣東 珠海519000)

本研究以紅霉素為代表,探討金黃色葡萄球菌在不同藥物濃度下耐藥產(chǎn)生的比率及何濃度下更容易誘導(dǎo)耐藥,并探討對(duì)紅霉素高度耐藥的菌株是否有遺傳穩(wěn)定性,及對(duì)其他種類的抗生素有無(wú)交叉耐藥,以期對(duì)臨床醫(yī)生用藥給予一定的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 受試菌株 標(biāo)本為從我院臨床呼吸道標(biāo)本中分離出的對(duì)紅霉素敏感(MIC≤0.5 μ g/ml)的菌株4株,來(lái)自晨起痰標(biāo)本、纖維支氣管鏡吸取痰標(biāo)本、支氣管肺泡灌洗液。標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29213來(lái)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。菌株均經(jīng)過(guò)革蘭氏染色及美國(guó)BD公司生產(chǎn)的Phoenix100全自動(dòng)微生物鑒定儀通過(guò)鑒定/藥敏復(fù)合板鑒定及測(cè)定MIC值,試驗(yàn)前再次采用NCCLS M-27A方案,用瓊脂稀釋法對(duì)試驗(yàn)菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[1]。

1.2 誘導(dǎo)方法 含紅霉素的藥物瓊脂平皿從四分之一MIC(0.125 μ g/ml)開(kāi)始,以 2倍連續(xù)稀釋濃度配制,把臨床分離的菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株在不同藥物濃度含藥平皿中各接種5-10代,每株菌株同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組,于每個(gè)藥物濃度傳代后測(cè)MIC值的變化[2],以 8 μ g/ml≤MIC ≤16 μ g/ml為低度 耐藥 ,16 μ g/ml≤MIC ≤64 μ g/ml為中度耐藥 ,MIC ≥256 μ g/ml為高度耐藥。成功誘導(dǎo)后,再測(cè)定耐藥突變株的遺傳穩(wěn)定性及對(duì)其他種類抗生素包括青霉素類、頭孢類、氨基糖甙類、喹諾酮類等有無(wú)交叉耐藥。

2 結(jié)果

4株敏感菌株及1株標(biāo)準(zhǔn)菌株在不同濃度梯度的培養(yǎng)皿中多次傳代后,獲得了抗不同濃度紅霉素的耐藥突變菌株。5株菌株最后的MIC值分別為2株 MIC ≥256 μ g/ml,2 株 4 μ g/ml＜MIC ＜8 μ g/ml,1株16 μ g/ml＜MIC ＜32 μ g/ml。同時(shí)做空白對(duì)照的只在空白培養(yǎng)皿中的5株菌株的MIC值分別為3株2 μ g/ml＜MIC ＜4 μ g/ml,1 株 1 μ g/ml＜MIC ＜2 μ g/ml,1株 0.5 μ g/ml＜MIC ＜1 μ g/ml。耐藥突變菌株經(jīng)遺傳穩(wěn)定性測(cè)定后發(fā)現(xiàn)其獲得的耐藥性是穩(wěn)定的。誘導(dǎo)前后的菌株均未對(duì)其他種類抗生素發(fā)生交叉耐藥。

3 討論

臨床抗生素的不合理使用及濫用使得耐藥菌株不斷增加,特別是近年來(lái)革蘭氏陽(yáng)性球菌感染不斷上升,約占醫(yī)院感染的40%,已經(jīng)重新成為醫(yī)院感染的主要病原菌,其中金黃色葡萄球菌占所有革蘭氏陽(yáng)性球菌感染的第一位[3]。

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素不良反應(yīng)少、半衰期長(zhǎng)、臨床適應(yīng)證廣而仍被使用在金葡菌的社區(qū)感染和醫(yī)院感染的敏感菌株上。所有CAP指南都推薦用大環(huán)內(nèi)酯單一療法治療門(mén)診或住院病人[4]。紅霉素在細(xì)胞中的作用方式有兩種[5]:一是抑制50S核糖體大亞基的形成;另一個(gè)是抑制核糖體的翻譯作用。安全性和有效性使大環(huán)內(nèi)酯得到廣泛的應(yīng)用,而耐藥性也相應(yīng)增加。抗性細(xì)菌主要通過(guò)影響紅霉素在胞內(nèi)的積累(大環(huán)內(nèi)酯的外排機(jī)制)、破壞紅霉素的結(jié)構(gòu)使其失去抗菌作用、改造或修飾紅霉素在核糖體上的結(jié)合作用位點(diǎn)來(lái)消除環(huán)境中的紅霉素抗菌作用。

以往金黃色葡萄球菌耐藥性的研究,多采用不匹配的菌株,這些菌株背景復(fù)雜多樣,其耐藥性的產(chǎn)生受多種因素影響,如不同來(lái)源、不同患者的用藥情況、患者的依從性等。本實(shí)驗(yàn)采用人工誘導(dǎo)耐藥的方法,通過(guò)考查同一菌株在藥物的選擇壓力下,由敏感到耐藥的演變過(guò)程,復(fù)制金黃色葡萄球菌的耐藥模型,為其耐藥機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ),為臨床合理用藥提供可靠的理論依據(jù)。

對(duì)耐藥菌的出現(xiàn),人們通常習(xí)慣認(rèn)為是抗生素殺死了敏感菌,而將耐藥的菌群亞株選出來(lái),即耐藥株是先天存在的,而非后天的適應(yīng)性改變[6]。本實(shí)驗(yàn)金黃色葡萄球菌在藥物選擇壓力的作用下,為了使自身適應(yīng)生存環(huán)境,通過(guò)一系列的方式如改變自身基因結(jié)構(gòu)去適應(yīng)環(huán)境,即產(chǎn)生耐藥性,且根據(jù)結(jié)果可以看出高度耐藥菌株的一半在二分之一MIC時(shí)產(chǎn)生,從而確認(rèn)所謂小劑量預(yù)防用藥是錯(cuò)誤的。

在本實(shí)驗(yàn)初始,敏感菌在較高含紅霉素濃度(≥0.5 μ g/ml)培養(yǎng)均不能生長(zhǎng),說(shuō)明足夠濃度的抗菌藥物可有效殺滅致病菌,提示臨床上在選擇合理、足量地應(yīng)用抗菌藥物才能有良好療效。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的敏感菌從低至高逐級(jí)紅霉素濃度培養(yǎng),非但不能殺滅金黃色葡萄球菌,反而篩選出的高度耐藥菌生長(zhǎng),這說(shuō)明了劑量不足、給藥方法等不合理的應(yīng)用抗菌藥物是導(dǎo)致致病菌耐藥性出現(xiàn)的重要原因之一,結(jié)果嚴(yán)重影響臨床療效。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外耐藥性誘導(dǎo)獲得的金黃色葡萄球菌耐藥株,有1株在二分之一MIC濃度時(shí)誘導(dǎo)耐藥,1株在2MIC時(shí)誘導(dǎo)耐藥,說(shuō)明臨床用藥時(shí),無(wú)論是劑量不足還是劑量過(guò)大,都有可能誘導(dǎo)細(xì)菌變異,特別是在劑量不足的情況下。同時(shí),對(duì)劑量過(guò)大誘導(dǎo)的耐藥,因考慮到細(xì)菌單純傳代時(shí)也可引起細(xì)菌的MIC變化,故在大劑量藥物引起細(xì)菌耐藥的過(guò)程中有無(wú)此因素的參與尚不確定,臨床上尚不能完全參考此結(jié)果。

高度耐藥菌株誘導(dǎo)成功后,在無(wú)藥培養(yǎng)基中經(jīng)5次傳代,其MIC值不發(fā)生改變,說(shuō)明菌株的獲得性耐藥具有穩(wěn)定性。此穩(wěn)定性提示臨床用藥時(shí),即使間隔一段時(shí)間再用同類藥物仍不會(huì)有明顯療效。將誘導(dǎo)后的耐藥株測(cè)定對(duì)非誘導(dǎo)藥物的MIC,并比較誘導(dǎo)前后MIC的比值,其他抗生素的MIC無(wú)明顯變化,說(shuō)明紅霉素與其他抗生素?zé)o交叉耐藥,說(shuō)明在臨床上感染嚴(yán)重時(shí)可以聯(lián)合用藥以提高療效。此與何禮賢[7]的研究結(jié)果以及2001年美國(guó)胸科學(xué)會(huì)修訂的《成人社會(huì)獲得性肺炎處理指南》中的觀點(diǎn)一致[8]。

在空白平皿中單獨(dú)傳代也導(dǎo)致敏感菌株的MIC值較前有較大的變化,說(shuō)明臨床用藥過(guò)程中,細(xì)菌可能隨著細(xì)菌傳代引起耐藥,使治療效果不盡人意,提示臨床用藥時(shí),可以隨著治療的過(guò)程延長(zhǎng),增加用藥的劑量以保證治療效果。

綜上所述,現(xiàn)革蘭陽(yáng)性球菌的感染不斷增多,耐藥率逐年升高,目前治療耐藥革蘭陽(yáng)性菌感染新藥雖不斷問(wèn)世,然而對(duì)耐藥菌感染的控制并不能僅依賴于高效新藥,嚴(yán)格掌握適應(yīng)證,根據(jù)患者病情、病原菌藥敏結(jié)果合理選用藥物,有指征預(yù)防用藥,監(jiān)測(cè)細(xì)菌耐藥性、掌握耐藥機(jī)制等綜合措施的實(shí)施,才能提高耐藥菌感染的防治水平,減緩細(xì)菌耐藥性的增長(zhǎng)。

[1]陳民鈞.美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)2004年版有關(guān)藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化更新要點(diǎn)[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2004,27(9):608.

[2]臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì).抗微生物藥物敏感試驗(yàn)的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn);第十六版信息增刊.CLSI文件 M100-S16(ISBN 1-56238-556-7).2006,26(3):37-41.

[3]倪語(yǔ)星.葡萄球菌研究進(jìn)展[J].中國(guó)處方藥,2005,44(11):18.

[4]中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì).社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2006,29(10):651.

[5]Matsuoka M,Inoue M,Nakajima Y,et al.New erm Gene in Staphylococcus aureus clinical isolates[J].Antimicrob Agents Chemother,2002,46(1):211.

[6]Cairns J,Overbaugh J,Meller S.The origin of mutants[J].Nature,1988,335(6186):142.

[7]何禮賢.社區(qū)獲得性肺炎診治指南評(píng)價(jià)及有關(guān)問(wèn)題[J].中國(guó)抗感染雜志,2004,27(4):28.

[8]Niederman MS,Mandell LA,Anzueto A,et al.Guidelines for the management of adults with community-acquired pneumonia.Diagnosis,assessment of severity,antimicrobial therapy,and prevention[J].Am J Respir Crit Care Med,200l,163:1730.