吳輝，李志敏，葉勤

華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237

大腸桿菌NZN111是大腸桿菌W1485的丙酮酸甲酸裂解酶 (PFL) 和乳酸脫氫酶 (LDH) 雙突變株。文獻(xiàn)報(bào)道即使在復(fù)合培養(yǎng)基中添加了乙酸鹽它也不能在厭氧條件下代謝葡萄糖進(jìn)行生長(zhǎng)[1-2]，普遍認(rèn)為這是由于NZN111缺失了消耗NADH的乳酸脫氫酶以及為乙醇合成提供前體乙酰輔酶A (Ac-CoA)的丙酮酸甲酸裂解酶，整個(gè)厭氧代謝的氧化還原系統(tǒng)平衡遭到破壞，細(xì)胞不能夠有效氧化葡萄糖經(jīng)糖酵解 (EMP) 途徑產(chǎn)生的 NADH，導(dǎo)致了胞內(nèi)不尋常高的 NADH/NAD+比例，從而導(dǎo)致代謝的停滯。NZN111表達(dá)LDH改善了NADH消耗，NAD的生成使EMP途徑能夠運(yùn)行[3]。然而NZN111能夠以甘露糖、乳糖、果糖和海藻糖等與葡萄糖相同氧原狀態(tài)的糖進(jìn)行厭氧生長(zhǎng)，NZN111的代謝途徑 (見(jiàn)圖 1) 中仍然存在其他一些能夠消耗 NADH產(chǎn)生NAD+的酶，如富馬酸還原酶 (FR)、蘋果酸脫氫酶(MDH) 以及蘋果酸酶 (ME) 等，NZN111本應(yīng)該具有通過(guò)三羧酸 (TCA) 循環(huán)還原段來(lái)調(diào)節(jié)氧化還原平衡的能力。由此可以看出 NZN111不能代謝葡萄糖的主要原因可能是葡萄糖代謝調(diào)控產(chǎn)生的酶系統(tǒng)中補(bǔ)給途徑和NADH消耗途徑活性不夠?qū)е碌摹?/p>

圖1 大腸桿菌葡萄糖厭氧發(fā)酵途徑Fig. 1 Metabolic pathways in E. coli strain NZN111 under anaerobic condition. Not all the enzyme catalyzed steps and intermediates are shown. PTS: phosphotransferase transport system; PPC: PEP carboxylase; PCK: PEP carboxykinase; PK: pyruvate kinase; PPS: PEP synthetase; PDHc: pyruvate dehydrogenase complex; PTA: phosphoacetyltransferase; ACK: acetate kinase; ICL: isocitrate lyase; MS: malate synthase; MDH: malate dehydrogenase; ME: malic enzyme; FUM: fumarase; SDH: succinate dehydrogenase; and FRD: fumarate reductase. × indicates inactivated reactions. Dashed line indicates the enzyme activity formed in aerobic culture.

葡萄糖對(duì)胞內(nèi) cAMP和 cAMP的受體蛋白質(zhì)(Cyclic AMP receptor protein，CRP) 水平具有調(diào)節(jié)作用，分解代謝物敏感操縱子 (Catabolite-sensitive operons) 的轉(zhuǎn)錄受到 CRP和 cAMP結(jié)合產(chǎn)物cAMP-CRP的調(diào)節(jié)，cAMP-CRP與這些基因啟動(dòng)子上游特定保守序列結(jié)合，激活這些操縱子的轉(zhuǎn)錄[4]，而葡萄糖通過(guò)對(duì)胞內(nèi)的腺苷酸環(huán)化酶 (Adenylate cyclase，AC) 活性[5]和crp轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控[6]來(lái)控制cAMP和CRP的濃度，從而達(dá)到對(duì)分解代謝敏感操縱子代謝阻遏作用。補(bǔ)給途徑、TCA循環(huán)以及乙醛酸支路的酶如 MDH[7-8]、磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP)羧激酶 (PCK)[8-10]、富馬酸酶 (FUM)[11-12]、異檸檬酸裂解酶 (ICL)[8,11]等的表達(dá)都受到葡萄糖的分解代謝物阻遏作用，當(dāng)大腸桿菌在糖異生碳源 (如乙酸、丙酮酸、蘋果酸、琥珀酸以及延胡索酸等) 或分解代謝物阻遏效應(yīng)較弱的碳源 (如甘油等) 上生長(zhǎng)時(shí)這些酶的表達(dá)受到不同程度的誘導(dǎo)[13-14]。葡萄糖對(duì)大腸桿菌中心代謝途徑存在強(qiáng)烈的分解代謝物阻遏作用，直接導(dǎo)致了NZN111在厭氧條件下不能高效代謝葡萄糖，有氧階段以C2-C5等有機(jī)酸作為NZN111碳源可以誘導(dǎo)補(bǔ)給途徑、TCA循環(huán)以及乙醛酸支路的酶系，恢復(fù)NZN111在厭氧條件下快速代謝葡萄糖的能力[13-14]。

葡萄糖和糖異生碳源對(duì) NZN111代謝調(diào)節(jié)存在如此巨大差異，其他單糖或雙糖作為有氧碳源對(duì)NZN111代謝途徑的調(diào)節(jié)作用是否影響其厭氧代謝葡萄糖的性能？產(chǎn)生的效果是否與葡萄糖類似呢？本研究選用PTS依賴型的單糖果糖以及非PTS依賴的雙糖麥芽糖作為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)以這兩種糖為有氧碳源培養(yǎng)得到的NZN111，在厭氧條件下發(fā)酵葡萄糖的性能明顯要優(yōu)于葡萄糖，產(chǎn)物分配比例與糖異生碳源培養(yǎng)的菌體差異較大。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

本研究中采用的菌種為L(zhǎng)DH和PFL缺失的基因工程大腸桿菌NZN111 [F+λ?rpoS396 (Am) rph-1 ΔpflB::Cam ΔldhA::Kan]，由美國(guó)南伊利諾依大學(xué)(Southern Illinois University，US) 的D. P. Clark 教授提供。該菌種?20 ℃保存于25% (W/V) 甘油中。

Luria-Bertani (LB) 培養(yǎng)基 (g/L)：胰蛋白胨10，酵母抽提物5.0，NaCl 10，pH 7.2。

基本鹽 (SM) 培養(yǎng)基 (g/L)：Na2HPO4·12H2O 15.12，KH2PO43.0，NaCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，CaCl20.011，NH4Cl 1.0，1%維生素B1 0.2 mL/L以及微量元素混合液0.2 mL/L，pH 7.0。微量元素混合液 (g/L)：FeSO4·7H2O 80，MnSO4·nH2O 10，AlCl3·6H2O 10，CoCl24.0，ZnSO4·7H2O 2.0，Na2MoO4·2H2O 2.0，CuCl2·2H2O 1.0，H3BO40.5，溶于3.0 mol/L HCl中。其中維生素B1溶液和微量元素混合液采用微孔濾膜 (0.22 μm) 過(guò)濾除菌，待培養(yǎng)基滅菌冷卻后加入；葡萄糖、硫酸鎂和氯化鈣單獨(dú)滅菌后再加入，其他無(wú)機(jī)鹽混合溶液121 ℃滅菌30 min。

FSM和MSM培養(yǎng)基：SM培養(yǎng)基中分別添加5.0 g/L果糖和麥芽糖。

SMN培養(yǎng)基 (厭氧搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基)：不含氮源的SM培養(yǎng)基，添加15 g/L的葡萄糖和10 g/L的NaHCO3。

5 L發(fā)酵罐使用培養(yǎng)基：添加4.0 g/L的NH4Cl，其他成分與 SM培養(yǎng)基中相同，按不同情況在培養(yǎng)基中分別添加15 g/L果糖和麥芽糖。

抗生素用于種子培養(yǎng)，培養(yǎng)基中卡那霉素的終濃度為30 mg/L，氯霉素的終濃度為34 mg/L。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

將1 mL冷凍保存的菌種NZN111接入裝有30 mL LB培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，于37 ℃，220 r/min的搖床培養(yǎng)9 h。

1.2.2 搖瓶培養(yǎng)

整個(gè)實(shí)驗(yàn)主要采用的是兩階段培養(yǎng)法，即先有氧培養(yǎng)增殖菌體，然后再轉(zhuǎn)入?yún)捬醢l(fā)酵[13]。各實(shí)驗(yàn)條件采用2~3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。有氧階段，取2 mL活化的種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于裝有100 mL FSM或MSM的500 mL搖瓶中，于37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)9 h。培養(yǎng)結(jié)束后，于4 ℃、3 300×g離心10 min，棄去上清液，收集菌體，然后重懸于厭氧SMN培養(yǎng)基中，使菌體密度約為4.0 g DCW/L。50 mL厭氧瓶中加入25 mL菌懸液，通過(guò)液面上方空間充以CO2來(lái)建立厭氧環(huán)境，于轉(zhuǎn)速150 r/min，溫度37 ℃的水浴搖床，厭氧培養(yǎng)10 h。

1.2.3 5 L罐培養(yǎng)

5 L玻璃發(fā)酵罐是華東理工大學(xué)原生化工程研究所設(shè)計(jì)制造的RIBE-5型，攪拌槳采用本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)的自吸式攪拌槳，發(fā)酵控制軟件為國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心 (上海) 的 Tophawk發(fā)酵控制系統(tǒng)，數(shù)據(jù)由計(jì)算機(jī)采集。

根據(jù)5 L罐初始有氧培養(yǎng)的碳源的不同，轉(zhuǎn)接2 mL一級(jí)種子于裝有100 mL FSM或MSM培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h，作為5 L罐兩階段培養(yǎng)的二級(jí)種子。

發(fā)酵罐裝2.8 L培養(yǎng)基，接入二級(jí)種子200 mL，有氧階段培養(yǎng)條件為溫度37 ℃，初始攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min，初始通氣量2.0 L/min，通氣量和攪拌速率根據(jù)溶氧 (DO) 進(jìn)行手動(dòng)調(diào)整，以保證整個(gè)有氧培養(yǎng)過(guò)程中DO在10%以上。NZN111細(xì)胞首先在含有15 g/L果糖 (或麥芽糖) 的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞消耗完果糖 (或麥芽糖) 后，直接轉(zhuǎn)入?yún)捬醢l(fā)酵階段。厭氧狀態(tài)通過(guò)在發(fā)酵罐中通入CO2來(lái)實(shí)現(xiàn)：關(guān)閉空氣入口，從CO2鋼瓶中向發(fā)酵罐液面上方通入CO2，通氣持續(xù)5.0 min，關(guān)閉鋼瓶和發(fā)酵罐排氣口，將發(fā)酵罐上方進(jìn)氣口與裝有純CO2的橡膠氣袋連接。橡膠袋置于電子秤上，以計(jì)量CO2的吸收量。罐液面上方氣體通過(guò)自吸式攪拌槳吸入并分散到培養(yǎng)基中并在發(fā)酵罐內(nèi)不斷循環(huán)。厭氧發(fā)酵開(kāi)始時(shí)加入20 g/L葡萄糖，當(dāng)葡萄糖的濃度降低到5.0 g/L左右時(shí)再次加入葡萄糖。pH通過(guò)8.0 mol/L的NaOH來(lái)控制，有氧階段控制在7.0，厭氧階段控制在6.3。

1.3 分析方法

菌體濃度測(cè)定采用濁度法，培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，在600 nm測(cè)定其光密度 (OD600)，在一定的范圍內(nèi)OD600與菌體干重成線性關(guān)系。

葡萄糖濃度用葡萄糖試劑盒 (上?？菩郎锛夹g(shù)研究所) 測(cè)定。

果糖和麥芽糖濃度的測(cè)定采用高壓液相色譜法(HPLC)。高壓液相色譜儀是日本島津公司的LC-10AT vp，色譜柱為Bio-Rad Aminex HPX-87H，柱溫65 ℃，檢測(cè)器為Knauer RI detector，流動(dòng)相為5.0 mmol/L的H2SO4，流速為0.6 mL/min，進(jìn)樣20 μL。色譜工作站是杭州英譜科技開(kāi)發(fā)有限公司開(kāi)發(fā)的HS2000色譜處理軟件。

發(fā)酵液中乙酸、丙酮酸和琥珀酸濃度用離子色譜法測(cè)定。離子色譜儀是Dionex ICS1500，陰離子分析柱為Ionpac AS11-HC (4 mm×250 mm)，保護(hù)柱為Ionpac AG11-HC (4 mm×50 mm)，DS6電導(dǎo)檢測(cè)器以及陰離子再生抑制器ASRS ULTRAII，梯度儀為Reagent Free Controller-30，Chromeleon Client 6.8色譜工作站。柱溫和檢測(cè)器溫度都為30 ℃，流動(dòng)相為KOH，濃度梯度程序：1.0 mmol/L KOH，8.0 min；在20 min內(nèi)，KOH濃度從1.0 mmol/L勻速增加到30 mmol/L；最后維持30 mmol/L KOH，5.0 min。淋洗液的流速為1.0 mL/min。

2 結(jié)果

2.1 果糖、麥芽糖對(duì)NZN111厭氧代謝的影響

搖瓶實(shí)驗(yàn)中，大腸桿菌NZN111在FSM和MSM培養(yǎng)基中有氧培養(yǎng)，培養(yǎng)9 h細(xì)胞濃度分別為1.31和1.11 g DCW/L，pH在7.3左右，離心分離的菌體重懸于SMN培養(yǎng)基中厭氧發(fā)酵葡萄糖。NaHCO3為琥珀酸發(fā)酵提供CO2來(lái)源，同時(shí)起著緩沖pH的作用。以果糖和麥芽糖有氧培養(yǎng)的NZN111細(xì)胞在厭氧階段葡萄糖的代謝見(jiàn)表1。

以葡萄糖為有氧培養(yǎng)碳源得到的 NZN111在SMN培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)只消耗了3.3 g/L的葡萄糖[13]，而用果糖和麥芽糖培養(yǎng)的NZN111厭氧代謝葡萄糖的性能都有明顯提高，葡萄糖的消耗分別增加了1.82和1.78倍，厭氧代謝終產(chǎn)物主要是琥珀酸和丙酮酸，琥珀酸的濃度分別達(dá)到了 5.39和5.03 g/L，琥珀酸和丙酮酸的濃度比分別為1.63∶1和1.45∶1。搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，果糖為碳源有氧培養(yǎng)的 NZN111在厭氧發(fā)酵中更傾向于琥珀酸的合成，琥珀酸的得率 (0.88 mol/mol) 比用麥芽糖時(shí)(0.84 mol/mol) 略高。對(duì)比以葡萄糖為有氧碳源的情況，雖然厭氧條件下葡萄糖代謝和琥珀酸生產(chǎn)得到了提高，但是細(xì)胞自溶現(xiàn)象沒(méi)有緩解，果糖為有氧碳源培養(yǎng)的細(xì)胞10 h后細(xì)胞濃度下降了15.2%，麥芽糖為碳源時(shí)則達(dá)到了 21.3%，而以乙酸為有氧碳源培養(yǎng)得到的細(xì)胞基本沒(méi)有自溶現(xiàn)象[13]。

2.2 5 L罐中的發(fā)酵

5 L罐中的發(fā)酵同樣采用兩階段發(fā)酵方法，細(xì)胞在消耗完15 g/L的果糖或麥芽糖后補(bǔ)加葡萄糖，直接進(jìn)入?yún)捬醢l(fā)酵過(guò)程，發(fā)酵過(guò)程曲線見(jiàn)圖 2。有氧階段 NZN111在果糖和麥芽糖為碳源生長(zhǎng)時(shí)的代謝差異如表2所示。

NZN111以麥芽糖為碳源有氧生長(zhǎng)的時(shí)間比以果糖為碳源時(shí)明顯縮短，但果糖為碳源時(shí)幾乎沒(méi)有乙酸產(chǎn)生。由表2可以看出，NZN111消耗麥芽糖的時(shí)間 (tSE) 為消耗果糖時(shí)間的81.4%，最大比生長(zhǎng)速率 (μmax) 是果糖的 1.24倍；麥芽糖為碳源時(shí)菌體對(duì)碳源的得率 (YX/S) 略低，主要原因是有少量的乙酸生成；麥芽糖的比消耗速率 (qs) 比果糖高26.2%。

以果糖或麥芽糖為碳源的有氧培養(yǎng)結(jié)束后，得到的 NZN111菌體不經(jīng)離心分離和濃縮直接轉(zhuǎn)入?yún)捬醢l(fā)酵，厭氧發(fā)酵開(kāi)始時(shí)添加的葡萄糖濃度為20 g/L左右，當(dāng)葡萄糖濃度降低到5 g/L左右時(shí)，第2次添加葡萄糖。第1次加入葡萄糖后，果糖和麥芽糖培養(yǎng)的細(xì)胞葡萄糖消耗較快，葡萄糖消耗速率分別達(dá)到2.92和2.31 g/(L·h)，主要產(chǎn)物為琥珀酸和丙酮酸，果糖培養(yǎng)的菌體琥珀酸和丙酮酸濃度比為1.63∶1，而麥芽糖培養(yǎng)的菌體則為1∶1，降低了 38.7%，兩種菌體的碳流在丙酮酸節(jié)點(diǎn)上差異較大。這階段果糖培養(yǎng)的細(xì)胞琥珀酸生產(chǎn)速率(1.54 g/(L·h)) 高于麥芽糖培養(yǎng)的細(xì)胞 (0.98 g/(L·h))，琥珀酸的得率分別為0.81和0.65 mol/mol，丙酮酸的得率分別為0.66和0.86 mol/mol。

表1 搖瓶實(shí)驗(yàn)中有氧階段以果糖和麥芽糖作為碳源對(duì)NZN111厭氧代謝葡萄糖和產(chǎn)物形成的影響Table 1 Effects of fructose and maltose as the carbon sources in aerobic culture of E. coli NZN111 on glucose consumption and product formation in subsequent anaerobic fermentation in flasks

表2 在5 L罐兩階段培養(yǎng)過(guò)程中NZN111以果糖和麥芽糖為有氧碳源分批培養(yǎng)的代謝特性Table 2 Metabolic performances of NZN111 cultured on fructose and maltose in the aerobic phase of the two-stage cultivation

圖2 NZN111在5 L發(fā)酵罐兩階段發(fā)酵過(guò)程菌體生長(zhǎng)、葡萄糖消耗、產(chǎn)物生成曲線Fig. 2 Profiles of cell growth, glucose consumption, metabolites accumulation in two-stage cultivation of NZN111 in a 5 L bioreactor. (A) Fructose as the aerobic carbon source. (B) Maltose as the aerobic carbon source. △ fructose; ▲ maltose; cell density;■ glucose; ● succinic acid; ＊pyruvic acid; ○ acetic acid; + ethanol.

在第2次加入葡萄糖后，葡萄糖消耗速率和琥珀酸的生產(chǎn)速率明顯降低。果糖培養(yǎng)的細(xì)胞基本耗完了加入的葡萄糖 (殘留僅為1.21 g/L)，而麥芽糖培養(yǎng)的細(xì)胞在厭氧發(fā)酵終了時(shí)殘?zhí)菨舛冗€有10.2 g/L。麥芽糖培養(yǎng)的細(xì)胞琥珀酸和丙酮酸濃度比有所增加，達(dá)到了 1.38，整個(gè)厭氧發(fā)酵最終的比值為 1.21；果糖培養(yǎng)得到的菌體厭氧產(chǎn)物的比值增加的幅度不大 (1.76)，整體較為穩(wěn)定，發(fā)酵結(jié)束時(shí)的比值為 1.73。以果糖和麥芽糖為碳源有氧培養(yǎng)的細(xì)胞厭氧發(fā)酵階段分別維持了33.2和38.0 h，最終琥珀酸得率分別為0.84和0.75 mol/mol，丙酮酸得率分別達(dá)到了0.65和0.83 mol/mol，琥珀酸最終濃度分別為18.0和15.7 g/L，丙酮酸最終濃度分別達(dá)到了10.5和13 g/L。

兩種情況的厭氧發(fā)酵階段都存在細(xì)胞自溶現(xiàn)象，第一次加糖階段尤為明顯，果糖培養(yǎng)的菌體下降了13.1%，麥芽糖得到的菌體下降了16.1%，這一趨勢(shì)與搖瓶實(shí)驗(yàn)相同，發(fā)酵終了時(shí)兩者細(xì)胞濃度下降相差不大 (33%左右)。

3 討論

自然界中存在多種糖類化合物，Monod把這些糖分為兩類：A類包括甘露糖、甘露醇和果糖，它們與葡萄糖同時(shí)存在于培養(yǎng)基中時(shí)，細(xì)菌不會(huì)出現(xiàn)二次生長(zhǎng)現(xiàn)象，它們主要通過(guò)與葡萄糖類似的 PTS系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞；B類包括阿拉伯糖、麥芽糖、乳糖、木糖和半乳糖等，它們和葡萄糖同時(shí)加入培養(yǎng)基中后，細(xì)菌則表現(xiàn)出二次生長(zhǎng)現(xiàn)象，它們通過(guò)非 PTS的透性酶系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞[15-16]。果糖通過(guò)果糖相關(guān)的PTS系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞，果糖操縱子 (fruBKA基因) 受到果糖阻遏蛋白 (Fructose repressor，F(xiàn)ruR，也稱為Cra) 的阻遏，中間代謝產(chǎn)物1-磷酸果糖和1,6-二磷酸果糖是FruR的效應(yīng)子，它們與FruR結(jié)合后使其失活[17-18]，減少了FruR的阻遏作用，誘導(dǎo)果糖操縱子的表達(dá)。麥芽糖是 2個(gè)葡萄糖分子以 α-1,4 糖苷鍵連接起來(lái)的雙糖，屬于非PTS系統(tǒng)的糖類，它進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)是通過(guò)周質(zhì)麥芽糖結(jié)合蛋白(MalE) 和需ATP提供能量的多亞基ABC運(yùn)輸系統(tǒng)(MalFGK2)，這些蛋白的表達(dá)受到 MalT蛋白正調(diào)控[19]。在轉(zhuǎn)錄層面，MalT的轉(zhuǎn)錄受到 PTS系統(tǒng)的調(diào)控，Mlc阻遏MalT的轉(zhuǎn)錄，去磷酸化的Enzyme IICBGlu與 Mlc結(jié)合使得 Mlc的阻遏性能喪失，而cAMP-CRP結(jié)合體則對(duì)MalT的轉(zhuǎn)錄具有激活作用，這兩個(gè)葡萄糖相關(guān)的調(diào)控機(jī)制存在矛盾性，具體相互協(xié)調(diào)的作用機(jī)理至今尚不確切。在蛋白活性層面，麥芽糖和ATP對(duì)MalT蛋白具有激活作用[20]。我們考察果糖和麥芽糖作為有氧碳源對(duì) NZN111厭氧代謝葡萄糖生產(chǎn)琥珀酸的影響，發(fā)現(xiàn)果糖和麥芽糖代謝調(diào)控效果雖然不如糖異生碳源，但可以較好恢復(fù)NZN111厭氧代謝葡萄糖性能，主要代謝產(chǎn)物是琥珀酸和丙酮酸。

大腸桿菌通過(guò)多種調(diào)節(jié)因子調(diào)控胞內(nèi)各種分解代謝和合成代謝途徑來(lái)適應(yīng)不同碳源上的生長(zhǎng)?；谀壳皩?duì)分解代謝調(diào)控研究的成果，分解代謝調(diào)控主要分為兩類：cAMP依賴型 (cAMP-CRP) 和cAMP非依賴型 (FruR)，見(jiàn)圖 3。Perrenoud 等[22]對(duì)fruR、crp和cya敲除進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)缺失fruR對(duì)細(xì)胞在葡萄糖上生長(zhǎng)沒(méi)有影響，而crp和cya的敲除則大大降低了葡萄糖的利用速度，減緩了細(xì)胞的生長(zhǎng)。cAMP依賴的分解代謝阻遏調(diào)控作用對(duì)細(xì)胞代謝的影響要遠(yuǎn)大于fruR的調(diào)控作用。從cAMP依賴的分解代謝阻遏模型來(lái)看，培養(yǎng)基中不存在葡萄糖時(shí)，胞內(nèi)磷酸化的Enzyme IIAGlu濃度較高，腺苷環(huán)化酶被激活，胞內(nèi)cAMP水平增加，cAMP與受體蛋白CRP結(jié)合后高效結(jié)合到DNA上激活胞內(nèi)超過(guò)100個(gè)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄[23]，其中包括糖異生途徑基因 (pck)、乙醛酸支路基因 (aceAB) 和TCA途徑基因 (mdh、sdhABCD、fumA、gltA和 acnAB等)[22,24]。Nam 等[25]測(cè)定了以果糖和麥芽糖為碳源時(shí)胞內(nèi)磷酸化的Enzyme IIAGlu和cAMP的濃度，兩者濃度明顯高于以葡萄糖為碳源的情況，此時(shí)糖異生途徑、乙醛酸支路以及TCA途徑基因轉(zhuǎn)錄被激活。同樣，Bettenbrock等[26]對(duì)在不同碳源上生長(zhǎng)的大腸桿菌胞內(nèi)磷酸化的Enzyme IIAGlu和cAMP的濃度以及PEP和丙酮酸的比值進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)糖異生碳源(包括乙酸、琥珀酸)、果糖、麥芽糖以及甘油為碳源培養(yǎng)得到的細(xì)胞，三者明顯高于葡萄糖培養(yǎng)的細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)部這些信號(hào)物質(zhì)的積累有利于cAMP-CRP的形成，引起糖異生途徑基因 (pck)、乙醛酸支路基因(aceAB) 和TCA途徑基因 (mdh、sdhABCD、fumA、gltA和acnAB等) 轉(zhuǎn)錄的激活。代謝調(diào)控非常復(fù)雜，不同的調(diào)控子之間還有影響，在 fur (Ferric uptake regulator) 缺失的大腸桿菌菌株中乙醛酸支路受 crp負(fù)調(diào)控[27]。

圖3 大腸桿菌依賴和非依賴cAMP的分解代謝調(diào)控[20]Fig. 3 The cAMP-dependent or independent catabolic regulation of the central carbon metabolism in Escherichia coli[20]. Filled green ellipses represent transcriptional regulators assigned to catabolite control. Non-filled ellipses correspond to proteins (and ribosome) involved in signal transduction. Red coloured ellipses represent intracellular signalling molecules. Shortdashed lines: transcriptional regulation; long dashed lines: regulation of enzyme activity. +: positive regulation; ?: negative regulation; +/?: positive and negative regulation.

FruR (Cra) 為不依賴cAMP的分解代謝阻遏和激活全局調(diào)控因子，通過(guò)對(duì)中心代謝途徑中碳代謝和能量代謝相關(guān)酶基因表達(dá)的調(diào)控來(lái)調(diào)節(jié)中心代謝途徑的碳流[17,28]。FruR 對(duì)糖酵解途徑的基因 (如pfkA、pykA、gapA、pgk以及eno等)、ED途徑基因(如 edd和 eda) 以及非葡萄糖的代謝基因 (如果糖操縱子 fruBKA、甘露醇操縱子 mtlADR) 有阻遏作用，但對(duì)糖異生途徑基因 (fbp、pckA和 ppsA)、乙醛酸支路基因 (aceBA) 以及 TCA途徑基因有激活作用。FruR缺失的菌株不能在以乙酸、丙酮酸或TCA中間代謝產(chǎn)物為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)[29]，主要原因是大腸桿菌在糖異生碳源上的生長(zhǎng)受到pps和pck的控制[30]，ppsA上游區(qū)域只有FruR結(jié)合位點(diǎn)，不存在其他調(diào)節(jié)子結(jié)合位點(diǎn)，糖異生關(guān)鍵酶 PPS的表達(dá)對(duì) FruR有較大的依賴性[18]。大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)不包括 fruR的果糖操縱子(fruBKA) 對(duì)糖異生途徑、TCA循環(huán)以及乙醛酸途徑酶的表達(dá)也有類似的阻遏作用[31]，過(guò)量表達(dá)果糖操縱子為 1-磷酸果糖和 1,6-二磷酸果糖的合成提供了大量的酶源，生成的 1-磷酸果糖和 1,6-二磷酸果糖抑制了FruR的活性。果糖經(jīng)過(guò)PTS系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞，被Enzyme IIAfru磷酸化生成1-磷酸果糖，1-磷酸果糖由 1-磷酸果糖激酶磷酸化生成 1,6-二磷酸果糖，1-磷酸果糖和1,6-二磷酸果糖與部分FruR結(jié)合抑制了它們的活性，減小了FruR對(duì)糖異生途徑基因、乙醛酸支路基因以及TCA途徑基因的激活作用。

綜上所述，結(jié)合 NZN111厭氧代謝的結(jié)果來(lái)看，果糖和麥芽糖對(duì)糖異生途徑基因、乙醛酸支路基因以及 TCA途徑基因的調(diào)控效果優(yōu)于以葡萄糖為有氧碳源的代謝調(diào)控，更有利于NZN111厭氧條件下胞內(nèi)的氧化還原平衡，改善了其厭氧條件下的葡萄糖代謝能力。

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