周雍進(jìn)，趙宗保

1 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，大連 116023

2 大連潔凈能源國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 (籌)，大連 116023

3 中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京 100049

先進(jìn)生物燃料導(dǎo)向的脂肪酸途徑合成生物學(xué)改造

周雍進(jìn)1,3，趙宗保1,2

1 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，大連 116023

2 大連潔凈能源國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 (籌)，大連 116023

3 中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京 100049

化石能源日益枯竭，迫切需要尋找新型燃料。脂肪族生物燃料由于其熱值高、性能好而受到廣泛重視。微生物脂肪酸代謝途徑是生產(chǎn)先進(jìn)生物燃料的重要途徑。文中綜述了近幾年基于合成生物學(xué)理念改造脂肪酸途徑的進(jìn)展，介紹了合成生物學(xué)在微生物柴油、中長(zhǎng)鏈脂肪醇、長(zhǎng)鏈烴類化合物生物合成中的應(yīng)用，并展望了脂肪族生物燃料的發(fā)展方向。

合成生物學(xué)，先進(jìn)生物燃料，脂肪酸合成，生物柴油

燃料乙醇和生物柴油是當(dāng)前生物燃料研究的熱點(diǎn)，其生產(chǎn)成本在持續(xù)下降。但是燃料乙醇作為汽油替代品，其水溶性、揮發(fā)性、熱值低等缺點(diǎn)制約著其大規(guī)模使用。先進(jìn)生物燃料 (Advanced biofuel)是指以高產(chǎn)非糧作物、農(nóng)林廢棄物、其他可持續(xù)性生物質(zhì)或者藻類為原料，通過(guò)化學(xué)、物理、生物甚至必要的組合技術(shù)，轉(zhuǎn)化獲得的具有與化石燃料相當(dāng)甚至更高能量密度，易于儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)娜剂戏肿覽3]。由于其性能優(yōu)良和可持續(xù)性，先進(jìn)生物燃料近來(lái)受到學(xué)術(shù)界和工業(yè)界重視?；谖⑸锎x的生物技術(shù)對(duì)設(shè)計(jì)和制造先進(jìn)生物燃料分子具有重要意義[4]。美國(guó)加州大學(xué)洛杉磯分校學(xué)者通過(guò)合成生物學(xué)手段改造大腸桿菌Escherichia coli氨基酸生物合成途徑，合成了一系列碳鏈稍長(zhǎng)的醇類化合物，并且大幅度提高了產(chǎn)量，為生物汽油發(fā)展提供了新思路[5]。生物柴油和石油來(lái)源的柴油性質(zhì)相似，如果能進(jìn)一步降低綜合生產(chǎn)成本，將具有巨大市場(chǎng)潛力。然而，生物柴油當(dāng)前面臨最重要的瓶頸問(wèn)題是植物油脂資源非常有限，難以支撐產(chǎn)業(yè)發(fā)展。另外，中長(zhǎng)鏈 (碳鏈長(zhǎng)度 C10-C18) 燃料如航空煤油目前尚沒(méi)有非常有效的途徑獲取生物基替代品。最近關(guān)于微生物脂肪酸生物合成途徑的認(rèn)識(shí)和改造取得了一些成果，拓展了生物燃料的合成路線。

以下綜述了近年來(lái)理性改造脂肪酸途徑獲取以脂肪酸代謝衍生物為目標(biāo)的生物燃料研究，并展望了合成生物學(xué)策略在設(shè)計(jì)、改造生物燃料代謝途徑中的應(yīng)用。

1 合成生物學(xué)概念的內(nèi)涵及其蓬勃發(fā)展

合成生物學(xué)一詞早在1911年就出現(xiàn)在法國(guó)物理化學(xué)家 Stephane Leduc所著“生命的機(jī)理 (The Mechnism of Life)”一書中。1980年，Hobom B將其定義為利用重組 DNA技術(shù)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行基因工程改造[6]。隨著分子系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展，2000年Kool等在美國(guó)化學(xué)年會(huì)上重新提出，定義為基于系統(tǒng)生物學(xué)的遺傳工程，從人工堿基DNA分子、基因片段、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與信號(hào)傳導(dǎo)路徑到細(xì)胞的人工設(shè)計(jì)與合成[7]。西方學(xué)者對(duì)合成生物學(xué)比較一致的定義是：利用工程理念理性合成復(fù)雜、具有生物意義的不同層次系統(tǒng)—從單個(gè)生物分子到整個(gè)細(xì)胞、組織、器官，而這些合成的生物系統(tǒng)能執(zhí)行自然界所沒(méi)有的功能[8]。合成生物學(xué)、計(jì)算生物學(xué)與化學(xué)生物學(xué)一同構(gòu)成系統(tǒng)生物技術(shù)的方法基礎(chǔ)。

近幾年合成生物學(xué)發(fā)展十分迅速，世界上多國(guó)政府部門及眾多學(xué)者開始關(guān)注合成生物學(xué)研究，合成生物學(xué)也因此取得了蓬勃發(fā)展，并在天然產(chǎn)物、生物能源等領(lǐng)域取得了令人矚目的成績(jī)。比如：美國(guó)學(xué)者先后在 E. coli和釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae中構(gòu)建了青蒿素前體生物合成途徑[9-10]，并進(jìn)行代謝工程優(yōu)化，在 S. cerevisiae中獲得149 mg/L的青蒿酸[10]，有望降低青蒿素生產(chǎn)成本，為非洲貧窮瘧疾患者帶來(lái)了希望。為了獲得性能更好的汽油替代品，在 E. coli中引入 2-酮酸脫羧酶(KDC) 和乙醇脫氫酶 (ADH) 對(duì)氨基酸生物合成途徑進(jìn)行改造，構(gòu)建了異源的醇類生物合成途徑，合成了一系列碳鏈長(zhǎng)度 (C3-C8) 醇類生物燃料，其中異丁醇產(chǎn)量最高達(dá)到22 g/L[5,11]。為了增加抗癌藥物紫杉醇產(chǎn)量，降低其生產(chǎn)成本，在E. coli中構(gòu)建紫杉醇前體生物合成途徑，通過(guò)模塊優(yōu)化策略優(yōu)化生物合成途徑，其紫杉二烯產(chǎn)量達(dá)到1.0 g/L，5-羥基紫杉二烯產(chǎn)量達(dá)到 60 mg/L[12]。最引人注目的成果當(dāng)屬2010年Venter研究所成功地將人工合成的蕈狀支原體 Mycoplasma mycoides基因組轉(zhuǎn)入到山羊支原體Mycoplasma capricolum宿主細(xì)胞中，獲得了具有生存和自我復(fù)制能力的新菌株[13]。

合成生物學(xué)的蓬勃發(fā)展使人們對(duì)微生物理性改造有了更深入的認(rèn)識(shí)，也給現(xiàn)代工業(yè)生物技術(shù)提供了更有效的工具。近年來(lái)，生物燃料研究也充分利用了合成生物學(xué)最新發(fā)展理念，加速了其自身發(fā)展。除了上述利用合成生物學(xué)成功生產(chǎn)汽油替代品(C3-C8醇類) 外，人們開始利用合成生物學(xué)策略改造脂肪酸途徑合成能量密度更高，性能更好的中長(zhǎng)鏈生物燃料。

2 合成生物學(xué)改造脂肪酸途徑合成生物燃料

模式微生物E. coli、S. cerevisiae等由于其遺傳背景清楚，遺傳操作手段成熟，被廣泛用作合成生物學(xué)研究宿主。而脂肪生物合成能力較強(qiáng)的產(chǎn)油微生物遺傳背景認(rèn)識(shí)非常有限，尚難以進(jìn)行合成生物學(xué)改造。目前脂肪族生物燃料的研究主要集中在E. coli中。

2.1 E. coli脂肪酸代謝途徑

E. coli脂肪酸合成途徑及其調(diào)控機(jī)制已得到廣泛研究。如圖1所示，乙酰-CoA經(jīng)羧化得到丙二單酰-CoA后，經(jīng)脂肪酸合成酶合成脂酰-ACP，隨后經(jīng)硫酯酶催化合成脂肪酸。在E. coli中，大部分脂酰-ACP經(jīng)過(guò)甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移到甘油衍生物合成磷脂，少量的合成類脂等物質(zhì)。當(dāng)脂肪酸在E. coli中過(guò)量積累時(shí)，被快速轉(zhuǎn)化為脂酰-CoA，然后經(jīng)過(guò)β氧化途徑分解成乙酰-CoA。E. coli脂肪酸生物合成途徑受一系列機(jī)制嚴(yán)格調(diào)控，脂肪酸調(diào)節(jié)子的轉(zhuǎn)錄嚴(yán)格受到FadR和FabR調(diào)控，乙酰-CoA羧化酶和脂肪酸合成途徑的FabH (3-酮酰-ACP合成酶III) 和FabI (烯酰ACP還原酶) 受到長(zhǎng)鏈脂酰-ACP反饋抑制[14]。這些機(jī)制一起限制細(xì)胞內(nèi)脂肪酸及其衍生物過(guò)量積累。所以，要大量合成脂肪類生物燃料，必須打破其調(diào)節(jié)機(jī)制，促進(jìn)脂肪酸大量合成。最常用的策略之一是敲除脂肪酸分解途徑關(guān)鍵基因fadD和fadE以減少脂肪酸分解；另外，過(guò)表達(dá)植物來(lái)源以及內(nèi)源的硫酯酶解除長(zhǎng)鏈脂酰-CoA反饋抑制，也可以加強(qiáng)脂肪酸合成[15]。

圖1 E. coli中脂肪酸代謝途徑[15]Fig. 1 The fatty acid metabolism in E. coli[15].

2.2 脂肪酸途徑改造合成生物柴油

生物柴油是指短鏈一元烷醇脂肪酸酯，目前生物柴油通常是通過(guò)甘油三酯與短鏈醇類進(jìn)行酯交換反應(yīng)得到[16]。隨著生物柴油需求增加，這個(gè)策略暴露了越來(lái)越多的缺點(diǎn)。首先其依賴于植物油脂供應(yīng)，我國(guó)植物油脂資源極其短缺，現(xiàn)有油料作物年產(chǎn)油脂在1 000萬(wàn)t左右，尚不足以滿足國(guó)內(nèi)食用油消費(fèi)市場(chǎng)需求[17]。近幾年油脂進(jìn)口量逐年遞增，2009年超過(guò)900萬(wàn)t，是全球最大植物油凈進(jìn)口國(guó)。其次生物柴油轉(zhuǎn)酯化需要消耗大量勞動(dòng)力和能量，勢(shì)必會(huì)減少其轉(zhuǎn)化率，增加成本[2]。所以迫切需要尋找新技術(shù)以支撐生物柴油產(chǎn)業(yè)發(fā)展。為了解決這個(gè)問(wèn)題，策略之一是尋找新的油脂來(lái)源。微生物油脂因其生產(chǎn)強(qiáng)度高，占用耕地面積少而受到廣泛關(guān)注[18]；另一種策略是利用微生物直接生產(chǎn)生物柴油，這種策略避免了轉(zhuǎn)酯化等過(guò)程，也引起了重視。在 E. coli進(jìn)行中過(guò)表達(dá)來(lái)源于運(yùn)動(dòng)單胞菌Zymomonas mobilis的丙酮酸脫羧酶增加乙醇供應(yīng)，并表達(dá)來(lái)源于貝氏不動(dòng)桿菌 Acinetobacter baylyi的?；D(zhuǎn)移酶。在培養(yǎng)基中添加油酸進(jìn)行有氧發(fā)酵，脂肪酸乙酯(FAEE) 產(chǎn)量達(dá)到1.28 g/L，F(xiàn)AEE含量達(dá)到細(xì)胞生物量的 26%[2]。由于這個(gè)過(guò)程要在胞外添加油酸，使其更像一個(gè)生物轉(zhuǎn)化過(guò)程，但 FAEE高產(chǎn)量對(duì)未來(lái)脂肪酸途徑改造研究具有重要參考價(jià)值。

為了實(shí)現(xiàn)生物柴油體內(nèi)生物合成，敲除 E. coli DH1脂肪酸分解基因fadD增加脂肪酸供應(yīng)，表達(dá)硫酯酶TesA、脂酰-CoA連接酶ACL、酯合成酶AtfA，從而構(gòu)建了脂肪酸乙酯 (FAEE) 生物合成途徑。然后過(guò)表達(dá)來(lái)源于 Z. mobilis的丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶加強(qiáng)乙醇生物合成途徑，F(xiàn)AEE產(chǎn)量最大達(dá)到674 mg/L，為理論產(chǎn)量的7.4%[19]。相信對(duì)生物合成途徑進(jìn)行優(yōu)化改造能進(jìn)一步提高FAEE產(chǎn)量。

2.3 脂肪酸途徑改造合成脂肪酸和脂肪醇

脂肪酸是微生物合成生物柴油的前體，也可以用作油脂化工行業(yè)的基本原料。如果能利用微生物過(guò)量生產(chǎn)脂肪酸，對(duì)生物燃料和生物基化學(xué)品生產(chǎn)具有重要價(jià)值。因此，已有研究對(duì)脂肪酸生物合成途徑進(jìn)行改造并增加脂肪酸產(chǎn)量。如通過(guò)敲除E. coli的fadD基因限制長(zhǎng)鏈脂肪酸分解途徑；過(guò)表達(dá)來(lái)源于油料植物種子的硫酯酶以加強(qiáng)脂肪酸合成速率；過(guò)表達(dá)乙酰-CoA羧化酶增加前體丙二酸單酰-CoA的供應(yīng)；表達(dá)內(nèi)源硫酯酶解除長(zhǎng)鏈脂酰-CoA反饋抑制，最后脂肪酸產(chǎn)量達(dá)到2.5 g/(L·d)，生產(chǎn)強(qiáng)度為0.024 g/(h·g DCW)[20]。在此基礎(chǔ)上，將油料植物種子的硫酯酶和E. coli內(nèi)源的硫酯酶在阿拉伯糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子下串聯(lián)表達(dá)，脂肪酸產(chǎn)量達(dá)到4.0 g/(L·d)，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到0.04 g/(h·g DCW)。這已經(jīng)很接近現(xiàn)在乙醇工業(yè)的生產(chǎn)強(qiáng)度0.1 g/(h·g DCW)[21]。有類似報(bào)道在敲除脂肪酸分解途徑的菌株中過(guò)表達(dá)來(lái)源于植物的脂酰-ACP硫酯酶和乙酰-CoA羧化酶獲得了約0.8 g/L脂肪酸[22]。在高產(chǎn)脂肪酸菌株的基礎(chǔ)上，通過(guò)表達(dá)脂酰-CoA連接酶和脂酰-CoA還原酶，構(gòu)建了脂肪醇生物合成途徑，脂肪醇產(chǎn)量達(dá)到60 mg/L[19]。除E. coli外，也有報(bào)道對(duì)藍(lán)細(xì)菌脂肪酸合成進(jìn)行改造[23]，在藍(lán)細(xì)菌Synechocystis sp. PCC6803中過(guò)表達(dá)來(lái)源于好好芭 Simmondsia chinensis的脂酰-ACP還原酶，利用CO2作為碳源，脂肪醇產(chǎn)量達(dá)到0.2 mg/(L·OD730)。但是藍(lán)細(xì)菌脂肪酸途經(jīng)調(diào)節(jié)機(jī)理不夠清楚，如何進(jìn)一步進(jìn)行代謝工程改造制約著產(chǎn)量進(jìn)一步提高。

2.4 脂肪酸途徑改造合成脂肪烴

烷烴和烯烴是汽油、柴油、航空煤油的最主要成分。在自然界中，許多生物能夠體內(nèi)能夠合成烴類化合物，藍(lán)細(xì)菌就是其中一種。然而，其生物合成的一些關(guān)鍵代謝步驟還沒(méi)有得到清晰認(rèn)識(shí)，因此也就很難通過(guò)合成生物學(xué)構(gòu)建烴類生物合成途徑。美國(guó)LS9公司通過(guò)差減策略從藍(lán)細(xì)菌Synechococcus elongatus PCC7942中鑒定到烷烴生物合成基因脂酰-ACP還原酶編碼基因和醛脫羰基酶基因，并對(duì)其表達(dá)酶生物化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，其催化生物反應(yīng)如圖2所示。在E. coli中共表達(dá)脂酰-ACP還原酶和醛脫羰基酶，得到超過(guò)300 mg/L的烷烴，并且80%以上的烷烴是在細(xì)胞外。除了烷烴外，還生成了一定的醇類，這可能是由大腸桿菌內(nèi)源的還原酶將中間產(chǎn)物脂肪醛還原產(chǎn)生的[24]。但是，在體外實(shí)驗(yàn)中脂酰-ACP還原酶和醛脫羰基酶共同催化脂酰-ACP并沒(méi)有醇生成。如果增加醛脫羰基酶活力，并且通過(guò)代謝工程改造降低細(xì)胞內(nèi)源的脂肪醛還原酶活力有可能將細(xì)胞內(nèi)積累的醇類進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為中長(zhǎng)鏈烴，提高脂肪烴生產(chǎn)能力。

圖2 脂肪烴生物合成途徑Fig. 2 Alkane/Alkene biosynthesis pathway.

3 脂肪族生物燃料生物制造的展望

利用合成生物學(xué)理論與技術(shù)已實(shí)現(xiàn)了生物柴油、生物汽油、中長(zhǎng)鏈烷烴等的微生物合成，但其產(chǎn)量還不夠高，尚不能達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)水平。進(jìn)一步通過(guò)合成生物學(xué)及代謝工程手段構(gòu)建高產(chǎn)菌株是未來(lái)發(fā)展方向。將來(lái)可以從3個(gè)方面入手 (圖3)：1) 挖掘與改造合成生物學(xué)元件。自然界中資源豐富，有很多高效基因及酶有待于挖掘，設(shè)計(jì)高通量的篩選策略挖掘高效的基因元件為下一步合成生物學(xué)改造提供材料。近幾年興起的宏基因組技術(shù)和比較基因組學(xué)是篩選生物元件良好策略，如利用宏基因組技術(shù)從白蟻中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)纖維素酶[25]，最近又有報(bào)道利用宏基因組技術(shù)從牛胃中發(fā)現(xiàn)一系列纖維素酶[26]，為纖維素高效利用菌株構(gòu)建提供了材料。另外，自然界中挖掘的元件異源表達(dá)時(shí)有時(shí)候活性不高，選擇性不夠，需要進(jìn)一步通過(guò)蛋白質(zhì)工程和酶工程改造或者根據(jù)其功能設(shè)計(jì)新型元件使其更高效[27-28]。2) 組裝生物燃料相關(guān)元件并協(xié)調(diào)其功能。DNA組裝技術(shù)為代謝途徑快速組裝提供了很好的方案[29]。通過(guò)在E. coli中表達(dá)含有多種結(jié)構(gòu)域的蛋白支架 (Protein scaffold)，加州大學(xué)學(xué)者成功地將代謝途徑相關(guān)的酶錨定在蛋白支架上，代謝流得到協(xié)調(diào)，目標(biāo)產(chǎn)物生產(chǎn)能力提高77倍[30]。但是，蛋白質(zhì)支架技術(shù)在其他宿主特別是真核生物以及其在不同途徑中的有效性，目前尚不清楚，所以必須發(fā)展新技術(shù)調(diào)控代謝流。3) 提高宿主對(duì)燃料分子的耐受性。生物燃料分子的毒性直接影響細(xì)胞生長(zhǎng)及代謝，從而限制產(chǎn)量進(jìn)一步提高，所以增加宿主產(chǎn)物耐受性對(duì)獲得高產(chǎn)很有必要。傳統(tǒng)馴化篩選策略雖然能獲得耐受性好的菌株，但比較耗時(shí)耗力，且菌株遺傳性狀不夠穩(wěn)定，易于產(chǎn)生回復(fù)突變。近幾年發(fā)展的全局轉(zhuǎn)錄工程通過(guò)改造轉(zhuǎn)錄因子，獲得了穩(wěn)定的乙醇高耐受性菌株，值得借鑒[31]。另外，有學(xué)者通過(guò)人工轉(zhuǎn)錄因子技術(shù)，使E. coli對(duì)丁醇的耐受性提高到1.5%[32]。如果能夠在這三方面整體突破，將會(huì)獲得高產(chǎn)量脂肪類生物燃料生產(chǎn)菌株。

圖3 脂肪族生物燃料合成生物學(xué)改造方向Fig. 3 The future aspects for enhancing fatty biofuel production.

目前，合成生物學(xué)宿主一般采用遺傳操作平臺(tái)成熟的模式生物。然而，它們的脂肪酸代謝能力還遠(yuǎn)低于產(chǎn)油微生物。另外，模式生物工程菌株可能存在如產(chǎn)物耐受性低、原料適應(yīng)范圍窄、抗逆性弱等性狀缺陷。而產(chǎn)油微生物脂肪酸生物合成能力強(qiáng)，并且還存在高效異戊二烯途徑，如果實(shí)現(xiàn)類胡蘿卜素、甾醇等聯(lián)產(chǎn)就有可能顯著降低生物燃料成本[33]。因此，選擇合適的宿主，構(gòu)建其遺傳操作平臺(tái)，充分利用微生物代謝產(chǎn)物聯(lián)產(chǎn)策略，可能是進(jìn)一步提高微生物生物燃料生產(chǎn)競(jìng)爭(zhēng)力的重要途徑[34]。

總之，脂肪族生物燃料由于其熱值高、不易揮發(fā)等良好性能受到廣泛關(guān)注。但目前還面臨菌株生產(chǎn)能力低、耐受性和原料適應(yīng)性差等問(wèn)題[34]。合成生物學(xué)理念和技術(shù)將促進(jìn)脂肪族生物燃料生物制造快速發(fā)展，為生物能源產(chǎn)業(yè)提供技術(shù)支撐。

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Advanced biofuel-oriented engineering of fatty acid pathway：a review

Yongjin J. Zhou1,3, and Zongbao K. Zhao1,2
1 Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China
2 Dalian National Laboratory for Clean Energy, Dalian 116023, China
3 Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

Biofuel is in high demand as an alternative energy source for petroleum and diesel. Fatty acid-based biofuel has higher energy density and better compatibility with existing infrastructures. Microbial fatty acid biosynthetic pathway is important to develop biofuel. In this article, recent progresses on the modification and reconstruction of fatty acid metabolism for the production of biofuel were reviewed, with a focus on micro-diesel, long chain fatty alcohol and alkane. Problems, solutions and directions for further development of fatty acid-based biofuel were also discussed in the respect of synthetic biology.

synthetic biology, advanced biofuel, fatty acid metabolism, biodiesel

隨著經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，全球?qū)δ茉葱枨髣≡?。傳統(tǒng)化石能源日益枯竭難以支撐經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展，并且化石能源使用產(chǎn)生的溫室氣體對(duì)環(huán)境產(chǎn)生了巨大危害[1]，所以迫切需要發(fā)展替代石化能源的可再生能源。與石化燃料相比，生物燃料源于可再生的生物質(zhì)資源，其燃燒產(chǎn)生的CO2可經(jīng)植物光合作用重新轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)綠色、可持續(xù)循環(huán)[2]。發(fā)展生物燃料對(duì)經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展以及國(guó)家安全具有重要意義。得到了國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)界和政府部門的重視，取得了很多令人振奮的成果。

April 7, 2011; Accepted: June 10, 2011

Supported by:National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2011CB 707405).

Zongbao K. Zhao. Tel: +86-411-84379211; E-mail: zhaozb@dicp.ac.cn

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2011CB707405) 資助。