王慶奎 趙海運(yùn) 陳成勛 呂志敏 邢克智

中草藥多糖是一種免疫增強(qiáng)劑，能夠增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物的非特異性免疫功能，提高機(jī)體抗病力，與抗生素和化學(xué)消毒劑相比具有無藥物殘留、無污染以及病原菌不產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)[1]。茯苓為中國(guó)傳統(tǒng)中草藥，為多孔菌科植物茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，《神農(nóng)本草經(jīng)》中又名茯菟。茯苓味甘、淡，性平，歸心、肺、脾、腎經(jīng)，具有利水滲濕，健脾和中，具有寧心安神之功效[2]。茯苓多糖(pachyman)是茯苓的主要活性成分，含量可達(dá)茯苓干重的84%，具有抗腫瘤[3]、抗病毒[4]、抗炎[5]、抗衰老[6]和增強(qiáng)免疫力[7]作用。茯苓多糖經(jīng)化學(xué)修飾后能增強(qiáng)其生物學(xué)活性[8-9]。

目前，茯苓多糖對(duì)人類和畜禽動(dòng)物的影響及其機(jī)制研究得較多，而在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的研究報(bào)道較少[10-11]。本試驗(yàn)研究茯苓多糖對(duì)點(diǎn)帶石斑魚(Epinephelus malabaricus)非特異性免疫力的影響，為茯苓多糖在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用提供參考。

1 試驗(yàn)材料及方法

1.1 試驗(yàn)材料

健康點(diǎn)帶石斑魚幼魚由天津市海發(fā)珍品實(shí)業(yè)有限公司提供。茯苓多糖購(gòu)自山東圣旺藥業(yè)股份有限公司，多糖含量50%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法

在基礎(chǔ)餌料中分別添加0、50、200、350、500 mg/kg的茯苓多糖，制成5種試驗(yàn)餌料?；A(chǔ)餌料配方和營(yíng)養(yǎng)水平見表1，復(fù)合維生素和復(fù)合礦物質(zhì)按暖水性魚類營(yíng)養(yǎng)需求添加[12]。各原料粉碎后過60目篩，逐級(jí)擴(kuò)大法混合均勻，揉成面團(tuán)后用絞肉機(jī)擠成直徑2 mm的面條，風(fēng)干后搓碎，-18℃保存?zhèn)溆?。將馴化1周后的點(diǎn)帶石斑魚幼魚[(83.25±8.94)g]隨機(jī)分配到30個(gè)水族箱（860 mm×620 mm×455 mm）中，每箱30尾。每種餌料投喂6箱。每種餌料每7 d尾靜脈采血1次，每次取3箱，每箱15尾，采血前停食1 d。測(cè)定血液中的非特異性免疫指標(biāo)。

試驗(yàn)魚采用微流水(3.6 L/min)養(yǎng)殖。試驗(yàn)期間水質(zhì)條件：水溫26～28℃，鹽度28～30，溶解氧＞5.6 mg/l，-N＜1.1 mg/l，NO2-N＜0.3 mg/l。日換水3次，換水時(shí)清除糞便。日投餌2次，每次飽食投喂。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及測(cè)定方法

試驗(yàn)魚用MS-222麻醉后，用一次性無菌注射器尾柄采血，一部分置離心管中離心得血清，-86℃保存，另一部分用肝素鈉抗凝，計(jì)數(shù)血液中的白細(xì)胞數(shù)和白細(xì)胞吞噬能力。測(cè)定血清中酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)、溶菌酶(lysozyme,LZM)活力，總蛋白(total protein,TP)、白蛋白(albumin,A)含量，補(bǔ)體C3和C4含量。ACP、TP和A均用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。白蛋白/球蛋白（A/G）=A/(TP-A)[13]。

表1 基礎(chǔ)餌料配方（%）

1.3.1 LZM的測(cè)定

將活化后的溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus）用PBS（pH值6.4）調(diào)濃度為OD570≈0.3，取150 L菌懸液均勻涂布在固體培養(yǎng)基上。在培養(yǎng)基上等間距放置直徑4.32 mm滅菌濾紙片，向?yàn)V紙片中心滴加濃度分別為375、750、1 125、1 500、1 875、2 250 U/ml的溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μl，置28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h后測(cè)量抑菌圈直徑。以抑菌圈直徑為X值，溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為Y值求回歸方程。取10 μl血漿加在濾紙片上，按上述方法孵育，測(cè)量抑菌圈直徑。將抑菌圈直徑代入回歸方程，算出血漿中溶菌酶活力。

1.3.2 血液白細(xì)胞計(jì)數(shù)

抗凝血用白細(xì)胞稀釋液稀釋100倍后，在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。白細(xì)胞稀釋液配制：98 ml蒸餾水加入1%亞甲藍(lán)3滴、冰醋酸2 ml，配制成100 ml白細(xì)胞稀釋液。血液白細(xì)胞數(shù)(個(gè)/L)=5個(gè)大方格中白細(xì)胞數(shù)×50 000×1 000×稀釋倍數(shù)。

1.3.3 血液白細(xì)胞吞噬能力

在200 μl抗凝血中加50 μl濃度為4×107cfu/ml枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）懸液，混勻后28℃孵育30 min，每10 min搖勻1次。孵育結(jié)束后涂血涂片，吉姆薩染液染色后油鏡下每尾魚計(jì)數(shù)100個(gè)白細(xì)胞吞噬情況。按下列公式計(jì)算吞噬率（PR）和吞噬指數(shù)（PI）。

吞噬率（%）=（吞噬枯草芽孢桿菌的白細(xì)胞數(shù)/白細(xì)胞數(shù)）×100；

吞噬指數(shù)=被吞噬的枯草芽孢桿菌數(shù)／吞噬枯草芽孢桿菌的白細(xì)胞數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，數(shù)據(jù)用Excel和SPSS13.0軟件處理，做單因素方差分析，若差異顯著(P＜0.05)時(shí)用Duncan's法作多重比較。表中數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（n=5）。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清ACP活力（見表2）

茯苓多糖對(duì)點(diǎn)帶石斑魚血清中ACP活力影響不明顯，僅50 mg/kg組在喂食21 d后顯著高于對(duì)照組。

表2 點(diǎn)帶石斑魚血清ACP活力(U/100 ml)

2.2 血清A/G值（見表3）

試驗(yàn)組飼喂茯苓多糖14 d A/G值低于對(duì)照組，除50 mg/kg組與對(duì)照組相比差異不顯著外，其它組與對(duì)照組相比差異均顯著。飼喂茯苓多糖7 d、21 d和28 d血清A/G值與對(duì)照組相比差異不顯著。

表3 點(diǎn)帶石斑魚血清A/G值

2.3 血清補(bǔ)體C3和C4含量（見表4）

飼喂茯苓多糖能提高補(bǔ)體C3含量，50 mg/kg組在第21 d顯著高于對(duì)照組，200 mg/kg組在第21 d、28 d顯著高于對(duì)照組，350 mg/kg組在第14 d、28 d顯著高于對(duì)照組。500 mg/kg組在飼喂28 d內(nèi)與對(duì)照組差異不顯著。茯苓多糖對(duì)補(bǔ)體C4含量影響不明顯，僅200 mg/kg組在第21 d顯著高于對(duì)照組。

表4 點(diǎn)帶石斑魚血清中補(bǔ)體C3、C4含量(g/l)

2.4 血清LZM活力（見圖1）

茯苓多糖對(duì)點(diǎn)帶石斑魚血清LZM活力影響不顯著（P＞0.05）。

圖1 茯苓多糖對(duì)點(diǎn)帶石斑魚血清LZM的影響

2.5 血液白細(xì)胞數(shù)（見表5）

表5 茯苓多糖對(duì)點(diǎn)帶石斑魚血液白細(xì)胞數(shù)的影響(×1011個(gè)/ml)

飼喂茯苓多糖7 d能提高血液白細(xì)胞數(shù)，50、200和500 mg/kg組白細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組。50 mg/kg組白細(xì)胞數(shù)在第14 d顯著高于對(duì)照組。在第21 d、28 d茯苓多糖對(duì)白細(xì)胞數(shù)影響不顯著。

2.6 血液白細(xì)胞吞噬能力（見表6）

茯苓多糖能提高血液白細(xì)胞PR，其中50 mg/kg組在第21 d、28 d PR顯著高于對(duì)照組，200 mg/kg組在第7 d顯著高于對(duì)照組，350 mg/kg組在第21 d、28 d顯著高于對(duì)照組。茯苓多糖能降低血液白細(xì)胞PI，各組PI在第7 d、21 d均顯著低于對(duì)照組。

表6 茯苓多糖對(duì)點(diǎn)帶石斑魚血液白細(xì)胞吞噬能力的影響

3 結(jié)論

飼喂茯苓多糖能降低點(diǎn)帶石斑魚血清A/G值、提高血清補(bǔ)體C3含量、提高血液白細(xì)胞數(shù)和白細(xì)胞PR，茯苓多糖對(duì)血清ACP活力、LZM活力和補(bǔ)體C4含量影響不明顯，但能降低血液白細(xì)胞PI。建議點(diǎn)帶石斑魚飼料中茯苓多糖添加量為50～200 mg/kg，連續(xù)喂食28 d。

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