葛洪 張占軍 房詩宏 張媛媛

棉籽粕是棉籽提取棉籽油后的副產(chǎn)品，粗蛋白質(zhì)含量可高達(dá)53%，僅次于豆粕，是重要的植物性蛋白質(zhì)資源之一[1]。棉籽粕是廣泛應(yīng)用于飼料工業(yè)的蛋白源。但由于棉籽粕中含有游離棉酚等抗?fàn)I養(yǎng)因子、氨基酸比例不均衡、棉籽結(jié)構(gòu)致密造成的適口性差和消化率偏低等因素限制了其應(yīng)用[2]。目前，應(yīng)用發(fā)酵技術(shù)處理棉籽粕，是有效提高棉籽粕品質(zhì)的方法之一。在發(fā)酵過程中還可以產(chǎn)生直接被動(dòng)物吸收的小肽和其他多種生物活性物質(zhì)，這對動(dòng)物的生長十分有利。同時(shí)，在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生呈味物質(zhì)，這對于幼齡動(dòng)物，具有明顯的誘食效果。此外，由于部分碳水化合物被降解，棉籽粕致密結(jié)構(gòu)變得疏松，適口性將顯著提高。

響應(yīng)面優(yōu)化法是20世紀(jì)90年代初從西方興起的一種試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法,它包括了試驗(yàn)設(shè)計(jì)、建模、檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷挠行?、篩選最佳組合條件等眾多試驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)技術(shù),通過對方程的回歸擬合和響應(yīng)曲面、等高線的繪制，可方便地求出相應(yīng)于各因素水平的響應(yīng)值[3-4]。應(yīng)用響應(yīng)面法對工藝條件進(jìn)行設(shè)計(jì)和優(yōu)化,可獲得最佳工藝，了解生產(chǎn)過程中各因素的影響和交互作用,為試驗(yàn)的改進(jìn)和生產(chǎn)工藝標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供可靠的數(shù)據(jù)[5]。

本研究利用熱帶假絲酵母、紅曲霉和枯草芽孢桿菌對棉籽粕進(jìn)行混合菌固體發(fā)酵，以棉籽粕中游離棉酚為評價(jià)指標(biāo)，在發(fā)酵時(shí)間、接種量、發(fā)酵溫度等單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化棉籽粕多菌種固體發(fā)酵的工藝條件，旨在為進(jìn)一步開發(fā)和利用棉籽粕資源及工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 棉籽粕

由德州中鈿生物科技有限公司提供，粗蛋白含量49.90%，游離棉酚含量842 mg/kg(數(shù)據(jù)由本實(shí)驗(yàn)室按照飼料中粗蛋白測定方法GB/T 6432—94及飼料中游離棉酚測定方法GB13086—91測定)；麩皮為市售。

1.1.2 菌種

紅曲霉由本實(shí)驗(yàn)室從紅曲米中自主篩選得到；枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)及熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3 培養(yǎng)基

1.1.3.1 斜面培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基:牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂15～20 g、水1 000 ml，pH值7.0～7.2。

YPD培養(yǎng)基：酵母膏10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g，加水1 000 ml。

1.1.3.2 液體種子培養(yǎng)基(LB液體培養(yǎng)基)

牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、水1 000 ml，pH值7.0～7.2。

1.1.3 .3三角瓶棉籽粕發(fā)酵培養(yǎng)基

棉籽粕44%、麩皮10%、尿素2%、水分44%（即按料液比1∶1，g/ml），裝量50 g/250 ml，封口，121℃滅菌15 min。

1.1.4 主要儀器和設(shè)備

島津UV-260型分光光度計(jì)（日本島津有限公司）、恒溫?fù)u床（伊孚森INFORS生物技術(shù)有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（德國MEMMERT進(jìn)口培養(yǎng)箱）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；凱氏定氮儀（KDY-9820，北京市通潤源機(jī)電技術(shù)有限公司）；控溫型遠(yuǎn)紅外消煮爐（四平電子研究所）；分析天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；3-氨基-1-丙醇[阿拉丁試劑有限公司（進(jìn)口分裝）]，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 液體種子制備

將活化好的紅曲霉菌種從斜面培養(yǎng)基接種到裝有100 ml豆芽汁種子培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，在恒溫?fù)u床中30℃培養(yǎng)5 d后轉(zhuǎn)移到冰箱中備用；將活化好的枯草芽孢桿菌菌種從斜面培養(yǎng)基接種到裝有100 ml LB液體種子培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，恒溫?fù)u床中30℃培養(yǎng)18 h后轉(zhuǎn)移到冰箱中備用；將活化好的熱帶假絲酵母從斜面培養(yǎng)基接種到裝有100 ml豆芽汁種子培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，在恒溫?fù)u床中30℃培養(yǎng)20 h后轉(zhuǎn)移到冰箱中備用。

1.2.2 測定項(xiàng)目與方法

飼料中粗蛋白測定方法采用GB/T 6432—94；飼料中游離棉酚測定采用GB13086—91。1.2.3混菌三角瓶發(fā)酵單因素試驗(yàn)

采用紅曲霉、枯草芽孢桿菌及熱帶假絲酵母比例為1∶1∶1的混合菌種進(jìn)行三角瓶棉籽粕發(fā)酵試驗(yàn)，分別采用不同的接種量、不同的發(fā)酵溫度、不同的發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)。發(fā)酵產(chǎn)品60℃下烘干后，測定發(fā)酵產(chǎn)品中的粗蛋白及游離棉酚含量。

1.2.4 混菌三角瓶發(fā)酵優(yōu)化試驗(yàn)

采用Design Expert 7.0.0軟件對影響發(fā)酵去除游離棉酚的幾個(gè)因素的參數(shù)作響應(yīng)面優(yōu)化，以便改進(jìn)棉籽粕固體發(fā)酵工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對棉籽粕發(fā)酵脫除棉酚的影響

2.1.1 接種量對棉籽粕發(fā)酵脫除棉酚的影響

在采用紅曲霉、枯草芽孢桿菌及熱帶假絲酵母比例為1∶1∶1的混合菌種進(jìn)行三角瓶棉籽粕發(fā)酵試驗(yàn)時(shí)，固定發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間72 h的條件下，分別按5%、10%、15%、20%和25%的接種量接種至三角瓶進(jìn)行棉籽粕固體發(fā)酵并測定其游離棉酚的含量，結(jié)果見圖1。

圖1 接種量對棉籽粕發(fā)酵脫除棉酚的影響

由圖1可見，在接種量較低時(shí)，菌種濃度過低致使發(fā)酵不完全，導(dǎo)致游離棉酚含量較高。當(dāng)接種量增大到10%時(shí)，游離棉酚下降最多，此時(shí)游離棉酚只有(126.26±16.73)mg/kg。此后隨著接種量的增大，游離棉酚并未呈顯著的下降，當(dāng)接種量達(dá)25%時(shí)，游離棉酚含量反而增加，可能是由于濕度過大，影響了發(fā)酵的進(jìn)行。因此，在優(yōu)化試驗(yàn)中，選擇10%接種量為優(yōu)化中心點(diǎn)。

2.1.2 發(fā)酵溫度對棉籽粕發(fā)酵脫除棉酚的影響

在采用紅曲霉、枯草芽孢桿菌及熱帶假絲酵母比例為1∶1∶1的混合菌種進(jìn)行三角瓶棉籽粕發(fā)酵試驗(yàn)時(shí)，改變發(fā)酵溫度，而固定發(fā)酵時(shí)間72 h和采用10%的接種量的條件下，接種至三角瓶進(jìn)行棉籽粕混合菌種固體發(fā)酵并測定游離棉酚的含量，結(jié)果見圖2。

圖2 發(fā)酵溫度對棉籽粕發(fā)酵脫除棉酚的影響

從圖2可以看出，隨著發(fā)酵溫度的升高，棉籽粕中游離棉酚逐漸減少，至30℃時(shí)游離棉酚最低，此后溫度升高，游離棉酚含量不再減少反而有所升高。綜合能耗情況，選擇30℃為溫度優(yōu)化中心點(diǎn)。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對棉籽粕發(fā)酵脫除棉酚的影響

在采用紅曲霉、枯草芽孢桿菌及熱帶假絲酵母比例為1∶1∶1的混合菌種進(jìn)行三角瓶棉籽粕發(fā)酵試驗(yàn)時(shí)，固定發(fā)酵溫度30℃和采用10%的接種量的條件下，觀察不同發(fā)酵時(shí)間后發(fā)酵底物中游離棉酚的含量，結(jié)果見圖3。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對棉籽粕發(fā)酵脫除棉酚的影響

由圖3可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵進(jìn)行的越徹底，游離棉酚含量下降的越明顯，但方差分析表明，發(fā)酵時(shí)間為72 h和84 h游離棉酚下降差異并不顯著，考慮到成本因素，選取72 h為發(fā)酵時(shí)間優(yōu)化中心點(diǎn)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

響應(yīng)面法以最經(jīng)濟(jì)的方式、較少的試驗(yàn)次數(shù)和較短的時(shí)間對所選的試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行全面研究[6]。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取接種量(X1)、發(fā)酵溫度(X2)和發(fā)酵時(shí)間(X3)3個(gè)因素作為響應(yīng)變量，以游離棉酚含量為響應(yīng)值，利用Design-Expert 7.0.0 Trial軟件按照Box-Behnken原理[7]進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，優(yōu)化棉籽粕固體發(fā)酵工藝，以1、0、-1分別代表自變量的3個(gè)水平，試驗(yàn)因素及水平編碼如表1所示。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平

具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2，設(shè)計(jì)了17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其中12個(gè)析因點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)進(jìn)行了5次以估計(jì)誤差。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)模型及試驗(yàn)值

2.2.2 多菌種固體發(fā)酵工藝回歸模型的建立及方差分析

利用Design-Expert 7.0.0軟件對表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到游離棉酚含量對以上3個(gè)因素的回歸方程為：

游離棉酚含量=121.32-76.68X1-86.48X2-63.56X3-50.32X1X2-33.78X1X3+4.48X2X3+111.00+191.40+64.85，對回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

由表3可以看出:模型F值為157.10，P＜0.000 1，表明模型是高度顯著的[8]；模型的失擬項(xiàng)P=0.060 4＞0.05，表明失擬不顯著，即該模型是穩(wěn)定的[9]，能較好地預(yù)測實(shí)際發(fā)酵后游離棉酚的下降情況。模型一次項(xiàng)X1、X2及X3均極顯著，且顯著順序是X2(發(fā)酵溫度)＞X1(接種量)＞X3(發(fā)酵時(shí)間)；二次項(xiàng)均極顯著，交互項(xiàng)除X2X3外均極顯著，表明各具體試驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。

表3 回歸模型方差分析

2.2.3 響應(yīng)面分析及優(yōu)化

通過Design-Expert 7.0.0軟件進(jìn)行各因素間交互作用對游離棉酚值的響應(yīng)面分析。利用軟件做出中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)所得的響應(yīng)面曲面圖(見圖4～圖6)。響應(yīng)面圖形是特定的響應(yīng)值Y對應(yīng)的因素X1、X2、X3構(gòu)成的一個(gè)三維空間在二維平面上的等高圖，可以直觀地反映各因素的交互作用以及對響應(yīng)值的影響[10]。從響應(yīng)面分析圖4～圖6中可以看出響應(yīng)值與影響因素的關(guān)系。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[11]。比較3組等高線圖可直觀地看出：X1X2、X1X3之間的交互作用顯著,等高線呈橢圓形，而X2X3等高線呈圓形，說明其交互作用不顯著，這與方差分析結(jié)果一致。從響應(yīng)面圖可以看出此試驗(yàn)?zāi)Ｐ投寄軌蜻_(dá)到極值點(diǎn)，且穩(wěn)定點(diǎn)是最小值，即為發(fā)酵后游離棉酚含量最少的點(diǎn)。

圖5 接種量(X1)和發(fā)酵時(shí)間(X3)交互作用的等高線和響應(yīng)面圖

圖6 發(fā)酵溫度(X2)和發(fā)酵時(shí)間(X3)交互作用的等高線和響應(yīng)面圖

為進(jìn)一步確定使游離棉酚含量最少的最佳點(diǎn)，通過Design-Expert軟件，設(shè)置游離棉酚含量最小值為目標(biāo)，優(yōu)化最終發(fā)酵工藝條件X1為0.65、X2為0.20、X3為0.34，此條件下游離棉酚含量最低為81.04 mg/kg。根據(jù)變量賦值公式χ=(Xi-X0)/ΔX可求得最終棉籽粕固體發(fā)酵工藝條件為：接種量13.25%、發(fā)酵溫度31℃、發(fā)酵時(shí)間76.08 h。

2.2.4 模型的驗(yàn)證

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，在上述優(yōu)化條件下共重復(fù)4次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，同時(shí)考慮到實(shí)際操作方便，此工藝條件進(jìn)一步簡化為接種量13%、發(fā)酵溫度31℃、發(fā)酵時(shí)間76 h。以此條件進(jìn)行多菌種固體發(fā)酵后測定游離棉酚的含量，測得此條件下實(shí)際游離棉酚含量為(82.03±3.14)mg/kg，與模型預(yù)測值78.89 mg/kg相比無明顯差異，證明了方程的可靠性和響應(yīng)面分析方法的有效性。

3 結(jié)論

采用試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design-Expert 7.0.0，通過Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到了多菌種固體發(fā)酵棉籽粕與接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間關(guān)系的回歸模型,經(jīng)驗(yàn)證該模型是合理可靠的,能夠較好地預(yù)測經(jīng)發(fā)酵后棉籽粕中游離棉酚的降低量。同時(shí)利用模型的響應(yīng)面及等高線，對影響游離棉酚下降的關(guān)鍵因素及其相互作用進(jìn)行了探討,得到的棉籽粕固體發(fā)酵工藝條件為：接種量13%、發(fā)酵溫度31℃、發(fā)酵時(shí)間76 h。進(jìn)一步試驗(yàn)證明，采用響應(yīng)面分析法對棉籽粕多菌種固體發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化是非常有效的。該研究結(jié)果為棉籽粕的固體發(fā)酵工藝開發(fā)提供了一定的理論基礎(chǔ)和參考價(jià)值。

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