葉玲玲，許建，李世崇，劉紅，劉興茂，王啟偉，陳昭烈

1 軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所，北京 100071

2 中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，北京 100021

生物技術(shù)藥物是 21世紀生物技術(shù)領(lǐng)域中引人關(guān)注的研究和產(chǎn)業(yè)熱點。目前，采用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白藥物已經(jīng)成為生物制藥產(chǎn)業(yè)的主流，其市場份額已超過全球生物技術(shù)藥物銷售額的 2/3[1-2]。在以哺乳動物細胞為生產(chǎn)系統(tǒng)的重組蛋白藥物的生產(chǎn)中，獲得高效、穩(wěn)定表達外源目的蛋白的細胞系是其中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)[3-4]。

逆轉(zhuǎn)錄病毒表達系統(tǒng)通常由包膜蛋白載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和包裝細胞系組成。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶的外源目的基因整合到宿主細胞時，具有傾向發(fā)生于染色體開放區(qū)和轉(zhuǎn)錄活躍位點的明顯特點[5-6]。這一基因整合特性能有效地將外源目的基因整合入靶細胞基因組并使之穩(wěn)定高效地表達。同時，由于逆轉(zhuǎn)錄病毒可以與多種細胞表面蛋白結(jié)合而進入細胞，其宿主細胞范圍很廣，具有感染終末分化細胞的能力，使其成為基因治療研究、RNA干擾和基因功能研究中廣泛采用的基因轉(zhuǎn)移載體[7-9]。

2005年，Bleck采用逆轉(zhuǎn)錄病毒表達系統(tǒng)構(gòu)建了抗體表達水平達到1.6 g/L的CHO細胞系[10]。這一結(jié)果提示逆轉(zhuǎn)錄病毒表達系統(tǒng)有望成為構(gòu)建高效、穩(wěn)定表達外源蛋白的工程細胞系的新的技術(shù)途徑?；诖?，本研究以增強型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP) 基因的表達水平和穩(wěn)定性為指標，考察逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pQCXIN介導的外源基因在HEK293細胞和CHO-K1細胞的表達效率，并采用 pQCXIN載體構(gòu)建了高效表達人重組活性蛋白 C (Recombinant human activated protein C，rhAPC) 的HEK293細胞系。

1 材料與方法

1.1 細胞和質(zhì)粒

HEK293細胞和質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)、大腸桿菌DH5α均購自美國Invitrogen公司；CHO-K1細胞購自美國ATCC；逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pQCXIN、包膜蛋白載體pVSV-G和病毒包裝細胞GP2-293均購自美國 Clontech公司；質(zhì)粒 pcDNA3.1/EGFP和pcDNA3.1/rhPC由本實驗室構(gòu)建。

1.2 試劑和培養(yǎng)基

限制性內(nèi)切酶及DNA連接酶購自美國NEB公司；DNA Marker、質(zhì)粒提取試劑盒和DNA純化回收試劑盒購自美國 Qiagen公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自美國 Invitrogen公司；G418購自德國Merck公司；DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國HyClone公司；蛋白C標準品和蛋白C兔多克隆抗體購自美國Sigma公司；HRP標記山羊抗兔IgG購自上海萊博生物公司。

1.3 攜帶外源基因的pQCXIN逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體的構(gòu)建

EGFP cDNA和 rhAPC cDNA分別從質(zhì)粒pcDNA3.1/EGFP和 pcDNA3.1/rhPC中經(jīng) AgeⅠ/ PacⅠ雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳分離、膠回收純化，雙粘端連入逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體 pQCXIN，構(gòu)建攜帶EGFP基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pQCXIN/EGFP和攜帶 rhAPC基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pQCXIN/rhAPC。

1.4 攜帶外源基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備和滴定

GP2-293細胞在含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2貼壁生長于75 cm2培養(yǎng)瓶中，當細胞的匯合度達到 90%時，分別用pQCXIN/EGFP和 pVSV-G、pQCXIN/rhPC 和pVSV-G進行雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。二質(zhì)粒摩爾比為1∶1，總量20 μg，轉(zhuǎn)染后5 h后更換新鮮的含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基，48 h后收獲細胞培養(yǎng)上清。細胞培養(yǎng)上清經(jīng)0.45 μm濾膜濾器過濾除去細胞碎片后，50 000×g、4 ℃超速離心1.5 h，倒掉上清，按100倍濃縮加入含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮沉淀，?70 ℃超低溫冷柜保存。病毒滴定參照文獻進行，并將病毒滴度定義為 GTU/mL (Gene transfer unit per ml)[11]。濃縮后的病毒滴度為1×107~2×107GTU/mL。

1.5 HEK293細胞和CHO-K1細胞的轉(zhuǎn)染及篩選

1.5.1 陽離子脂質(zhì)體介導的細胞轉(zhuǎn)染

參照 LipofectamineTM2000說明書，轉(zhuǎn)染前1天分別將HEK293細胞和CHO-K1細胞以7.5×105細胞/孔接種6孔板，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)至細胞形成 80%~90%的匯合細胞層，轉(zhuǎn)染前更換不含血清的 DMEM/F12培養(yǎng)基。取 10 μg質(zhì)粒pcDNA3.1/EGFP或 pcDNA3.1/rhPC用不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋至 250 μL；用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋10 μL LipofectamineTM2000至250 μL。將上述兩種液體移入同一EP管中混勻，室溫避光放置20 min后分別加入對應的6孔板中搖勻，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)6 h后補加含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.5.2 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的細胞感染

重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染前1天分別將HEK293細胞和CHO-K1細胞以7.5×105細胞/孔接種6孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)至細胞形成80%~90%的匯合細胞層，感染前更換含1%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基。取200 μL逆轉(zhuǎn)錄病毒pQCXIN/EGFP或 pQCXIN/rhAPC分別加入對應的6孔板中搖勻，37 ℃、5% CO2培養(yǎng) 6 h后更換含 10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.5.3 轉(zhuǎn)染陽性細胞的篩選和單克隆化

轉(zhuǎn)染24 h后，用0.25% (W/V) 胰蛋白酶消化HEK293細胞并將各孔細胞分別接種至 24孔板，4~5 h細胞貼壁后，培養(yǎng)基換為含0.6 g/L G418和10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基。3~4 d換液1次。直到2周后陽性克隆長出。胰酶消化，擴大培養(yǎng)，用于外源基因表達強度分析；或采用有限稀釋法將細胞接種于 96孔板克隆生長、篩選 rhAPC高效表達HEK293細胞系。

1.6 測定和分析方法

采用 Cedex AS20細胞密度和活力自動分析系統(tǒng) (Innovatis，Germany) 計數(shù)活細胞密度。采用流式細胞儀 (BD FACSCalibur，USA) 分析質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞和病毒感染細胞 EGFP的相對熒光強度(Relative fluorescence intensity，RFI)，每個檢測樣品的細胞總數(shù)設(shè)定為30 000。轉(zhuǎn)染陽性細胞的rhAPC表達水平分析參照文獻采用ELISA法進行[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 pQCXIN逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體的構(gòu)建和鑒定

選用 AgeⅠ和 PacⅠ位點作為EGFP cDNA和rhAPC cDNA的克隆位點，分別將EGFP cDNA和rhAPC cDNA連入pQCXIN中，正確質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖1A、1B所示，命名為 pQCXIN/EGFP和 pQCXIN/ rhAPC。所構(gòu)建的表達載體經(jīng) AgeⅠ、PacⅠ酶切鑒定，分別出現(xiàn)與預期一致、長度約為700 bp和1 300 bp的片段 (圖2)。該結(jié)果經(jīng)進一步的測序分析得到證實。

2.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體介導的EGFP表達效率

圖1 pQCXIN逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體的結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Diagrams of recombinant retroviral vectors. (A) pQCXIN/EGFP retroviral vector. (B) pQCXIN/rhAPC retroviral vector.

圖2 pQCXIN逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體的酶切鑒定Fig. 2 Identification of recombinant retroviral vectors by enzyme digestion. 1: pQCXIN/rhAPC retroviral vector digested with Age I and Pac I; 2: pQCXIN/EGFP retroviral vector digested with Age I and Pac I; M: DNA marker.

分別用pcDNA3.1/EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK293細胞和CHO-K1細胞，以及用經(jīng)由pQCXIN/EGFP和pVSV-G共轉(zhuǎn)染GP2-293細胞制備的攜帶EGFP基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒分別感染的 HEK293細胞和CHO-K1細胞，經(jīng)過400 mg/L G418加壓篩選2周，收集細胞進行流式分析，考察逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體介導的EGFP表達效果。HEK293細胞經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或病毒感染后，EGFP表達陽性細胞比例基本相同，約占細胞總數(shù)的 80%左右 (圖 3A、B)；病毒感染CHO-K1的 EGFP表達陽性細胞比例則明顯高于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的 CHO-K1細胞 (圖 3C、D)。定量分析EGFP表達陽性細胞的相對熒光強度，病毒感染HEK293細胞和CHO-K1細胞的RFI均約為對應質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞的2倍 (圖3E)。

2.3 逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體反復感染HEK293細胞的EGFP表達

將經(jīng)由 pQCXIN/EGFP和 pVSV-G共轉(zhuǎn)染GP2-293細胞制備的攜帶 EGFP基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒一次感染后的HEK293細胞的RFI值設(shè)定為1，并據(jù)此考察逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體多輪反復感染HEK293細胞的EGFP表達。圖4為HEK293細胞經(jīng) 2~4輪逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體反復感染后流式細胞分析的RFI相對值。RFI的相對值隨逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體感染次數(shù)的增加而升高，4輪病毒感染HEK293細胞的RFI值較1次病毒感染HEK293細胞的RFI值約提高2倍 (圖4)。結(jié)果提示，多輪反復感染逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體能通過增加HEK293細胞中EGFP基因的拷貝數(shù)提高EGFP的表達效率。

2.4 逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體介導的 EGFP表達穩(wěn)定性

表1為質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體感染的HEK293細胞在撤除 G418篩選壓力后連續(xù)傳代過程中的RFI值變化。經(jīng)過6次連續(xù)傳代，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞的RFI值由290.47降至88.89，下降幅度為 69.4%；經(jīng)過 1到 4輪病毒感染 HEK293細胞的RFI值的下降幅度分別為44.5%、22.4%、37.5%和 21.5%。結(jié)果提示，逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體介導的外源基因表達的穩(wěn)定性優(yōu)于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的外源基因表達。

圖3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或病毒感染介導的EGFP在HEK293細胞和CHO-K1細胞表達的流式細胞分析Fig. 3 Analysis the effect of EGFP expression in both HEK293 and CHO-K1 cells via plasmid transfection or virus infection. (A) Plasmid transfected HEK293 cells. (B) Virus infected HEK293 cells. (C) Plasmid transfected CHO-K1 cells. (D) Virus infected CHO-K1 cells. (E) RFI in both HEK293 and CHO-K1 cells via plasmid transfection or virus infection. Results are expressed as the mean value of duplicate samples from different experiment. EGFP: enhanced green fluorescent protein.

圖4 HEK293細胞經(jīng)多輪反復逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染的EGFP表達情況Fig. 4 EGFP expression of the HEK293 cells with repeated virus infection. Results are expressed as the mean value of duplicate samples from different experiment.

2.5 逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體介導的rhAPC高效表達

分別用經(jīng)由pQCXIN/rhAPC和pVSV-G共轉(zhuǎn)染GP2-293細胞制備的攜帶rhAPC基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染 HEK293細胞和 pcDNA3.1/rhAPC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞。經(jīng)過400 mg/L G418加壓篩選2周，病毒感染和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞的rhAPC表達水平分別為326.4 ng/(106cells·d) 和8.6 ng/(106cells·d)，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導的rhAPC效率明顯高于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染介導的rhAPC表達 (表2)。在96孔板采用有限稀釋法對病毒感染HEK293細胞進行克隆并經(jīng)ELISA篩選，獲得了3株rhAPC表達水平為10~15 μg/(106cells·d) 的HEK293細胞系。

3 討論

HEK293細胞為來源于人胚胎的轉(zhuǎn)化細胞系，其不僅體外培養(yǎng)性狀良好，且不存在嚙齒類病毒感染的潛在威脅。此外，HEK293細胞具有CHO細胞缺乏的γ-羧基化修飾和有效水解原肽以及表達完全人型塘基化的重組蛋白的能力。HEK293細胞的上述優(yōu)點使其成為日益受到重視的生物技術(shù)藥物生產(chǎn)系統(tǒng)，采用HEK293細胞生產(chǎn)的重組蛋白藥物和重組腺病毒載體也已分別獲得FDA和SFDA的批準上市[3]。

表1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或病毒感染的HEK293細胞在連續(xù)傳代過程中的RFI值變化Table 1 Change of RFI of both plasmid transfected and virus infected HEK293 cells during continuous passage

表2 ELISA檢測病毒感染和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK293細胞的rhAPC表達水平Table 2 rhAPC expression in HEK293 cells infected by retrovirus or transfected by recombinant plasmid by ELISA

哺乳動物細胞的基因組非常龐大，其中包含為數(shù)眾多的外源基因整合位點，如CHO細胞基因組中大概有15 000個整合位點，但其中能使外源基因高效表達的轉(zhuǎn)錄活躍位點為數(shù)不多，大約只有15個位點[13]。通常的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染等方法只能將外源目的基因隨機整合到宿主細胞基因組內(nèi)，因此，即使經(jīng)過大量的篩選，獲得高效表達外源目的基因的細胞系的幾率仍非常低。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶的外源目的基因整合到宿主細胞時，整合位點通常位于DNase I高敏感性區(qū)域內(nèi)的染色體開放區(qū)和轉(zhuǎn)錄活性區(qū)，這些區(qū)域與DNA的復制、轉(zhuǎn)錄和重組密切相關(guān)[14]。本研究的結(jié)果證實，對比質(zhì)粒轉(zhuǎn)染介導的外源基因表達，逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體在介導外源基因表達的效率和穩(wěn)定性方面均有明顯的優(yōu)勢。此外，逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體介導的外源基因表達還可通過病毒的多輪感染有效地提高整合于宿主細胞轉(zhuǎn)錄活性區(qū)的外源基因的拷貝數(shù)。這一基因整合特性為外源目的基因的高效表達提供了可能，并由此大大提高了獲得到外源基因高效表達細胞系的幾率。雖然，逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體介導外源基因高效表達需要以操作相對繁瑣的高滴度病毒制備為前提，但仍不失為一種有發(fā)展?jié)摿蛻们熬暗?、能有效提高外源基因在哺乳動物細胞表達效率的技術(shù)途徑。

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