羅開(kāi)華，樊崢，李宏濱，劉一葦

中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

主要組織相容性抗原復(fù)合物Ⅰ類分子 (Major histocompatibility complex class Ⅰ，MHC Ⅰ) 分為典型 MHC Ⅰ類分子 (MHC Ⅰa) 和非典型MHC Ⅰ類分子 (MHC Ⅰb)[1-2]。MHC Ⅰa分子表達(dá)在大多數(shù)體細(xì)胞表面，它們將抗原多肽呈遞給 T細(xì)胞參與天然免疫反應(yīng)。MHC Ⅰb分子的功能與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)，主要通過(guò)與免疫抑制受體的相互作用來(lái)調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性。在人體中，MHC Ⅰb主要分為3類基因：HLA-E、HLA-F和HLA-G[3-5]。

HLA-E在機(jī)體組織中廣泛表達(dá)，它結(jié)合的多肽大部分來(lái)自其他MHC分子的前導(dǎo)序列。HLA-E通過(guò)與NK細(xì)胞和T細(xì)胞亞群表面表達(dá)的CD94/NKG2受體相互作用產(chǎn)生免疫抑制效應(yīng)[6-10]。HLA-G 是一種在母嬰絨毛膜外滋養(yǎng)層細(xì)胞 (EVTs) 表面大量表達(dá)的基因，它通過(guò)與免疫細(xì)胞表面表達(dá)的免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄分子2 (Immunoglobulin-like transcript 2，ILT2) 和ILT4抑制受體相互作用從而誘導(dǎo)母嬰免疫耐受[11-13]。與其他的 MHC Ⅰ類分子相比，HLA-F基因在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中是高度保守的，因此 HLA-F可能在免疫系統(tǒng)中具有重要功能[14-15]。絕大多數(shù)MHCⅠ類分子與 β2-微球蛋白 (β2-microglobulin，β2m) 和抗原多肽形成 MHC∶β2m∶多肽的三元復(fù)合物，抗原多肽是T細(xì)胞受體 (T cell receptor，TCR)的結(jié)合識(shí)別部位，特異的抗原多肽將誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)。HLA-F與β2m形成一個(gè)二元復(fù)合物，并不結(jié)合抗原多肽，因此HLA-F不能引起T細(xì)胞針對(duì)特定抗原的免疫反應(yīng)[16-17]。雖然 HLA-F被證明與ILT2、ILT4和開(kāi)放構(gòu)象的MHC具有相互作用，但其功能仍然未被完全闡明[18]。

CD8α的二元復(fù)合物CD8αα是免疫共受體分子，MHC Ⅰ類分子只有同時(shí)結(jié)合TCR和CD8αα才能激活 T細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)[19]。MHC Ⅰ類分子的三元復(fù)合物能夠與CD8αα結(jié)合，而HLA-F是否與CD8αα相互作用尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究對(duì)HLA-F和CD8α基因序列進(jìn)行同義突變，重組后的基因以蛋白包涵體形式表達(dá)，通過(guò)稀釋法復(fù)性后用凝膠過(guò)濾層析和離子交換法純化，通過(guò)凝膠過(guò)濾層析和Native-PAGE研究HLA-F與CD8αα相互作用。

1 材料與方法

1.1 N端序列突變及突變序列擴(kuò)增

從質(zhì)粒載體中擴(kuò)增出不含信號(hào)序列和跨膜結(jié)構(gòu)域的HLA-F序列 (成熟蛋白1-280aa) 和CD8α (成熟蛋白1-114aa) 及全長(zhǎng)β2m序列。攜帶HLA-F基因全序列的 pOTB7載體和含全序列的 β2m、CD8α的pCMV-SPORT6質(zhì)粒購(gòu)于Proteintech公司。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，直接將HLA-F與CD8α編碼序列重組進(jìn)入pET21a (Invitrogen，美國(guó)) 質(zhì)粒無(wú)法獲得目的蛋白的大量表達(dá)。分析發(fā)現(xiàn)HLA-F和CD8α序列的N端編碼區(qū)含有大腸桿菌稀有密碼子。稀有密碼子對(duì)大腸桿菌表達(dá)具有重要影響，突變稀有密碼子能顯著提高外源蛋白的表達(dá)水平[20]。按圖1所示，設(shè)計(jì)N端同義突變引物，PCR擴(kuò)增出突變序列，將突變后的序列重組到pET21a質(zhì)粒中，篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序。

1.2 目的蛋白的表達(dá)及細(xì)胞破碎

分別將攜帶HLA-F、CD8α及β2m的pET21a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21感受態(tài)細(xì)胞。挑取平板上的單菌落接種于5 mL含氨芐青霉素 (Amp) 的LB 培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)后接種于500 mL含Amp的LB進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，37 ℃振蕩3 h后加入IPTG (德國(guó)，Merck) 至終濃度為0.001 mol/L，誘導(dǎo)表達(dá)15 h后取樣，SDS-PAGE 檢測(cè)。4 000 r/min離心10 min收集菌體，超聲破碎后 12 000 r/min離心 10 min，SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白表達(dá)量及在上清和沉淀中的分布。

圖1 CD8α和HLA-F基因N端突變前后序列比對(duì)結(jié)果Fig. 1 Sequences alignment figure of CD8α and HLA-F with their N terminal mutation.

1.3 包涵體的提取與溶解

SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)目的蛋白均以包涵體形式表達(dá)。分別將 HLA-F、CD8α及 β2m誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液4 000 r/min離心10 min收集菌體，加入50 mL PBS (pH 7.4，137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，4.3 mmol/L Na2HPO4，1.4 mmol/L KH2PO4) 吹打重懸離心沉淀物。超聲破碎 (400 W 100次)，12 000 r/min離心 10 min收集沉淀。用包涵體洗滌液 (0.5% Triton-100，50 mmol/L Tris (pH 8.0)，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，10 mmol/L二硫蘇糖醇) 反復(fù)洗滌純化顆粒沉淀物。稱量包涵體沉淀，用包涵體溶解液溶解沉淀 (pH 8.0，6 mol/L鹽酸胍，10%甘油，50 mmol/L Tris，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，10 mmol/L二硫蘇糖醇) 使包涵體蛋白濃度達(dá)到30 g/L。SDS-PAGE檢測(cè)和分析提取的包涵體蛋白。

1.4 包涵體蛋白復(fù)性

溶解的HLA-F、β2m和CD8α包涵體蛋白分別采用稀釋法復(fù)性。把120 mg β2m滴入500 mL復(fù)性緩沖液 (pH 8.0，400 mmol/L L-精氨酸，100 mmol/L Tris，2 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L氧化型谷胱甘肽，5 mmol/L 還原型谷胱甘肽)，4 ℃攪拌1 h后滴入360 mg的HLA-F。攪拌12 h后靜置24 h，將復(fù)性液用切向流系統(tǒng) (Millipore，法國(guó)) 濃縮，隨后用截留分子量5 kDa的超濾離心管離心濃縮。

1.5 復(fù)性蛋白的純化

濃縮后的蛋白復(fù)性緩沖液在超濾離心管中置換成分子篩緩沖液 (pH 8.0，10 mmol Tris，150 mmol NaCl，1 mmol/L EDTA)。換液后的HLA-F，CD8αα溶液分別經(jīng)Superdex200凝膠層析柱 (GE，美國(guó)) 純化。收集分離的蛋白在超濾離心管中濃縮后換成離子交換緩沖液 (10 mmol Tris) 通過(guò)Q XL離子交換層析柱 (GE，美國(guó)) 進(jìn)一步純化。

1.6 HLA-F與CD8αα相互作用

離子交換分離產(chǎn)物超濾濃縮后置換成分子篩緩沖液，凝膠過(guò)濾層析分別分析HLA-F和CD8αα?；厥者^(guò)濾產(chǎn)物濃縮至500 μL，將HLA-F和CD8αα混勻，靜置15 min后用凝膠柱層析分析。HLA-F、CD8αα及HLA-F/CD8αα混合物凝膠過(guò)濾層析圖采用UNICORN軟件 (GE，美國(guó)) 分析和比較。將離子交換純化濃縮后的 HLA-F和 CD8αα按1∶1比例混合靜置 15 min，10% Native-PAGE (pH 8.8) 120 V電泳約 2.5 h，采用考馬斯亮藍(lán)對(duì)Native膠染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列擴(kuò)增及PCR突變結(jié)果

從質(zhì)粒載體中成功擴(kuò)增出 HLA-F (831 bp)、CD8α (342 bp)、β2m (300 bp) 片段。用突變引物擴(kuò)增CD8α直接得到突變產(chǎn)物，HLA-F突變引物PCR出現(xiàn)了 3條條帶，回收測(cè)序后發(fā)現(xiàn)分子量最大的條帶是正確突變產(chǎn)物，將正確突變產(chǎn)物擴(kuò)增后與突變PCR產(chǎn)物對(duì)比電泳如圖2所示。

對(duì)PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆結(jié)果測(cè)序后發(fā)現(xiàn)目的基因序列成功重組進(jìn)入pET21a質(zhì)粒。

2.2 目的蛋白的成功表達(dá)

攜帶重組pET21a質(zhì)粒的大腸桿菌BL21菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，目的蛋白得到成功表達(dá)。如圖3所示，IPTG誘導(dǎo)前后目的蛋白表達(dá)量出現(xiàn)了顯著變化。除β2m外HLA-F和CD8α在IPTG誘導(dǎo)前都無(wú)目的蛋白表達(dá)。

圖2 HLA-F突變引物PCRFig. 2 The PCR amplification figure of HLA-F with mutated primer. First PCR amplified out three bands, correct sequence was amplified from longer sequence after sequencing. 1?3: correct sequence; 4?6: first step PCR result.

圖3 IPTG誘導(dǎo)前后HLA-F、β2m和CD8α蛋白電泳圖Fig. 3 The expression of HLA-F, CD8α and β2m were induced by IPTG. 1: HLA-F before IPTG added; 2: HLA-F after IPTG added; 3: β2m before IPTG added; 4: β2m after IPTG added; 5: CD8α before IPTG added; 6: CD8α after IPTG added.

2.3 包涵體蛋白的提取結(jié)果

包涵體蛋白電泳結(jié)果 (圖 4) 顯示成功提取了目的蛋白。由圖中可以看出盡管經(jīng)過(guò)了反復(fù)洗滌純化，包涵體電泳條帶仍含有大量的菌體蛋白。

2.4 HLA-F、CD8αα純化及相互作用結(jié)果

分子篩純化和離子交換純化結(jié)果顯示蛋白復(fù)性成功。如圖5顯示產(chǎn)物以單峰洗脫，SDS-PAGE也證明得到了純度較高的HLA-F和CD8αα，其中左圖33 kDa處為 HLA-F，11 kDa處為 β2m；右圖為CD8αα，分子量為13 kDa。相對(duì)于HLA-F，CD8αα帶電荷較少，在鹽濃度較低條件洗脫。

HLA-F、CD8αα與HLA-F/CD8αα混合物凝膠過(guò)濾層析結(jié)果如圖6所示。

如果HLA-F和CD8αα發(fā)生相互作用，則新形成的 HLA-F/CD8αα復(fù)合物在凝膠層析時(shí)保留時(shí)間將縮短?；旌衔锏纳V圖將會(huì)出現(xiàn)復(fù)合物色譜峰或者原來(lái)HLA-F色譜峰向左偏移，而柱上保留較長(zhǎng)的CD8αα峰將不會(huì)出現(xiàn)明顯的變化。以純化的CD8αα和混合物中CD8αα峰的相對(duì)位置之差作為內(nèi)參，第一個(gè)色譜峰相對(duì)于HLA-F的峰出現(xiàn)了0.5 mL的偏移。由此推測(cè)HLA-F與CD8αα可能具有相互作用。

圖4 CD8α、HLA-F與β2m包涵體蛋白電泳圖Fig. 4 The SDS-PAGE figure of CD8α, HLA-F and β2m inclusion body proteins. 1: CD8α iinclusion body; 2: HLA-F inclusion body; 3: β2m inclusion body.

圖5 CD8αα與HLA-F的離子交換純化結(jié)果Fig. 5 The purification of HLA-F and CD8αα. left: ion exchange figure of HLA-F; right: ion exchange figure of CD8αα.

圖6 HLA-F、CD8αα以及HLA-F/CD8αα凝膠過(guò)濾層析結(jié)果比較圖Fig. 6 The Gel-Filtration figure of HLA-F, CD8αα and HLA-F/CD8αα. Peak 72.46 mL is of HLA-F; peak 92.65 mL is CD8αα; peak 71.50 mL and 92.26 mL are the peaks of HLA-F/ CD8αα mixture. CD8αα peak move from 92.65 mL to 92.26 mL while the HLA-F peak move from 72.46 mL to 71.50 mL. Taking CD8αα peak as internal reference, the retention time of HLA-F becomes shorter after mixed with CD8αα.

圖7 HLA-F、CD8αα以及HLA-F/CD8αα的非變性蛋白電泳圖Fig. 7 The Native-PAGE figure of CD8αα, HLA-F and CD8αα/HLA-F. Purified CD8αα and HLA-F were mixed at the ratio of 1:1. Native-PAGE was performed in 10% gel at pH 8.8. 1: CD8αα; 2: HLA-F; 3: mixture of CD8αα and HLA-F. There is a new band appear in mixture lane.

另外，通過(guò)Native-PAGE檢測(cè)，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述推測(cè)。如圖7所示，在pH 8.8 的Native膠上CD8αα所帶電荷少，電泳速度較HLA-F慢，混合物在HLA-F與CD8αα條帶之間位置處出現(xiàn)了新的條帶。新出現(xiàn)的條帶可能是由HLA-F與CD8αα相互作用產(chǎn)生的復(fù)合物。

3 討論

稀有密碼子對(duì)外源基因在大腸桿菌體的表達(dá)具有重大的影響，尤其是序列N端稀有密碼子會(huì)抑制外源蛋白的表達(dá)。這可能由于核糖體無(wú)法在稀有密碼子區(qū)域引發(fā)蛋白合成有關(guān)，也有可能與mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)[21]。這個(gè)特點(diǎn)可能是原核生物對(duì)外源核酸序列的一種自我保護(hù)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)對(duì)基因N端序列稀有密碼子進(jìn)行突變后顯著提高了外源蛋白在大腸桿菌的表達(dá)水平。

溶解包涵體時(shí)，包涵體的溶解性與所用變性劑的強(qiáng)度具有十分顯著的關(guān)系，之所以采用鹽酸胍作為變性劑是因?yàn)橹暗膶?shí)驗(yàn)表明：尿素不能完全溶解CD8α包涵體，所得的包涵體溶解液混濁。鹽酸胍變性能力較尿素強(qiáng)能夠完全溶解包涵體沉淀。此外pH值和變性劑濃度對(duì)包涵體的溶解有較大影響[21]。同樣，pH值對(duì)蛋白復(fù)性也有很大的影響。CD8α復(fù)性過(guò)程中需要嚴(yán)格控制pH，因?yàn)閺?fù)性液的pH接近CD8α的等電點(diǎn) (pI=8.43)，濃縮和換液過(guò)程必須緩慢進(jìn)行，溶液pH的快速變化容易導(dǎo)致復(fù)性蛋白發(fā)生絮凝和沉淀。

凝膠過(guò)濾層析分析HLA-F與CD8αα相互作用時(shí)，混合物的峰扣除了內(nèi)參后偏移量不大。分析認(rèn)為可能是由于superdex 200分子篩柱對(duì)4~7 kDa蛋白質(zhì)分子的分辨率有限，故偏移的幅度較小。Native-PAGE膠圖中，混合物電泳條帶出現(xiàn)彌散，一方面是由于上樣量偏大所致；另一方面可能由于蛋白結(jié)合是動(dòng)態(tài)平衡的過(guò)程，復(fù)合物在電泳過(guò)程發(fā)生部分解離，解離的CD8αα移動(dòng)變慢使復(fù)合物條帶上方出現(xiàn)彌散。HLA-F條帶變化也證明了這個(gè)推測(cè)，由復(fù)合條帶十分靠近 HLA-F，解離的 HLA-F使HLA-F條帶變濃。

HLA-F與其他MHC分子的關(guān)鍵不同點(diǎn)在于它與β2m形成二元復(fù)合物，MHC結(jié)合的多肽參與細(xì)胞免疫識(shí)別過(guò)程。抗原多肽被 T細(xì)胞受體 (TCR) 識(shí)別而引發(fā)特異的免疫反應(yīng)，其中CD8αα參與該識(shí)別過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)HLA-F與CD8αα可能具有相互作用，沒(méi)有結(jié)合抗原多肽HLA-F與CD8αα發(fā)生相互作用必然會(huì)影響CD8αα與其他結(jié)合多肽的MHC分子的結(jié)合，從而影響抗原多肽的呈遞。從本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)HLA-F可能參與免疫T細(xì)胞TCR識(shí)別抗原的調(diào)節(jié)過(guò)程。此結(jié)論需要進(jìn)一步深入研究和量化分析。

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