邢宇，張麗葉，叢威，岳雷，陳崇安，馬吉銀

1 北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029

2 中國(guó)科學(xué)院過程工程研究所生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190

3 寧夏伊品生物科技股份有限公司，銀川 750100

谷氨酸發(fā)酵過程中，流加糖工藝必不可少。流加糖工藝成功的關(guān)鍵在于如何確保糖代謝速率與流加糖速率的平衡，它包括菌體耗糖速度、流加量、流加時(shí)間、流加次數(shù)、流加濃度等[1]。目前，流加糖工藝主要有恒速流加補(bǔ)料、恒糖濃度流加補(bǔ)料、溶氧控制的脈沖流加補(bǔ)料等。恒速流加補(bǔ)料工藝即在整個(gè)發(fā)酵過程中保持補(bǔ)料液流速恒定，此種補(bǔ)料方式下葡萄糖濃度易出現(xiàn)產(chǎn)酸期偏低，發(fā)酵后期偏高的情況；恒糖濃度流加補(bǔ)料工藝則根據(jù)上一時(shí)間間隔的耗糖量，預(yù)測(cè)下一時(shí)段的耗糖量，從而將流速調(diào)至適宜水平，由于葡萄糖濃度需離線測(cè)量，且各時(shí)段補(bǔ)糖量是以前一時(shí)段消耗量為依據(jù)，糖濃度控制存在滯后性；溶氧控制的脈沖流加補(bǔ)料工藝，是根據(jù)溶氧值變化隨時(shí)調(diào)整流加速率，溶氧值上升表明糖濃度偏低，應(yīng)增加流加量，使溶氧值保持在合適范圍內(nèi)，同樣存在滯后性[2-3]。目前，在谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中應(yīng)用較為廣泛的是恒定葡萄糖濃度流加補(bǔ)料工藝[4]。

發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酸的生物反應(yīng)式為[5]：

菌 體 生 長(zhǎng) 階 段 ： 2C6H12O6+NH3+3.5O2→C8H13O4N+4CO2↑+7H2O；

菌 體 產(chǎn) 酸 階 段 ： C6H12O6+NH3+1.5O2→C5H9O4N+CO2↑+3H2O。

可以看出，谷氨酸發(fā)酵過程中糖消耗與氨消耗成一定比例關(guān)系。通過考察發(fā)酵過程中菌體在產(chǎn)酸期糖、氨消耗情況，獲得兩者間比例關(guān)系。據(jù)此以pH反饋信號(hào)為控制條件，以一定比例的糖氨混合溶液為補(bǔ)料液，將營(yíng)養(yǎng)物利用與pH反饋相偶聯(lián)，使得pH反饋系統(tǒng)向發(fā)酵罐中流加氨的同時(shí)實(shí)現(xiàn)糖的補(bǔ)加[6-8]。在產(chǎn)酸過程中，菌體消耗葡萄糖，生成谷氨酸，導(dǎo)致pH下降，此時(shí)pH反饋系統(tǒng)自動(dòng)補(bǔ)加氨以控制發(fā)酵液pH，由于該工藝以糖氨混合溶液作為補(bǔ)料液，因此在補(bǔ)加氨的同時(shí)會(huì)補(bǔ)加一定量的葡萄糖以維持葡萄糖濃度的相對(duì)穩(wěn)定。菌體產(chǎn)酸旺盛時(shí)，氨補(bǔ)加量增加，相應(yīng)的葡萄糖補(bǔ)加增多；而當(dāng)菌體產(chǎn)酸能力下降時(shí)，發(fā)酵液pH變化減緩，pH反饋控制系統(tǒng)停止補(bǔ)堿，此時(shí)葡萄糖補(bǔ)加過程也同時(shí)終止。

本研究結(jié)合谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)菌株，考察基于pH的反饋補(bǔ)料工藝控制糖濃度的適用性，并與恒定葡萄糖濃度補(bǔ)料工藝進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 菌種

谷氨酸棒桿菌 Corynebacterium glutamicum FM，由寧夏伊品生物科技股份有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基組成

種子培養(yǎng)基 (g/L)：K2HPO41.5，MgSO40.7，糖蜜1.2，玉米漿25，尿素5，Mn2+、Fe2+0.002，葡萄糖30[9]。于118 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：K2HPO41.5，MgSO40.7，糖蜜10，玉米漿0.6，Mn2+、Fe2+0.002，KCl 0.5，葡萄糖110。于118 ℃滅菌20 min。

1.3 試劑與實(shí)驗(yàn)設(shè)備

K2HPO4、MgSO4購(gòu)于天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；KCl購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸錳、硫酸鐵、尿素購(gòu)于天津凱通化學(xué)試劑有限公司；糖蜜、玉米漿購(gòu)于寧夏伊品生物工程股份有限公司；葡萄糖購(gòu)于秦皇島驪驊淀粉股份有限公司)。

10 L-三聯(lián)發(fā)酵罐 (上海國(guó)強(qiáng)生化工程裝備有限公司)；YZ1515X蠕動(dòng)泵 (保定蘭格恒流泵有限公司)；LS-B50L立式壓力蒸汽滅菌鍋 (上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司)；BX41數(shù)碼攝像顯微鏡 (OLYMPUS)；SBA-40C生物傳感分析儀(山東省科學(xué)院生物研究所)；FE-20pH 計(jì)(METTLER-TOLEDO)；TDL-5-A離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.4 發(fā)酵過程控制條件

1.4.1 種子培養(yǎng)

按照 1% (V/V) 的接種量將種子接入種子培養(yǎng)基，恒定 pH 6.8，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速控制相對(duì)溶氧＞15%，32 ℃~33 ℃培養(yǎng)5~7 h。

1.4.2 10L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)

種子液按10% (V/V) 接種量轉(zhuǎn)入10 L發(fā)酵罐中。發(fā)酵過程中用22.82 g/100 mL的氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH，發(fā)酵初期，由于菌種對(duì)pH較為敏感，pH過高會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)，因此pH設(shè)定較低；菌體經(jīng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后向產(chǎn)酸期轉(zhuǎn)型的過程中，逐步提高pH控制水平，以利于菌體轉(zhuǎn)型；進(jìn)入產(chǎn)酸期，考慮到pH對(duì)谷氨酸脫氫酶、氨基轉(zhuǎn)移酶活性的影響，將pH逐步降至7.6左右促進(jìn)產(chǎn)酸；發(fā)酵結(jié)束前，為使后續(xù)提取工藝順利進(jìn)行，調(diào)節(jié)pH下降至 7.3左右，具體參數(shù)設(shè)定如表1所示。發(fā)酵過程中溫度采用程序升溫，0~10 h時(shí)溫度為 (34±0.02) ℃；10~23 h為(36±0.02) ℃；23 h至發(fā)酵結(jié)束為 (37±0.02) ℃。發(fā)酵液中溶氧水平保持在10%以上，通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)數(shù)和通氣量控制，罐壓維持在0.05 MPa左右。

表1 谷氨酸發(fā)酵過程中pH控制參數(shù)Table 1 The pH-control in glutamic acid fermetation

1.5 補(bǔ)料方式

1.5.1 恒定葡萄糖濃度補(bǔ)料

當(dāng)菌體濃度達(dá)到一定水平、葡萄糖濃度降至20 g/L左右，開始補(bǔ)料。補(bǔ)料過程中，每間隔 2 h測(cè)定一次葡萄糖濃度，根據(jù)發(fā)酵液中葡萄糖濃度的變化情況，計(jì)算上一時(shí)段葡萄糖消耗速率，并以此為依據(jù)預(yù)測(cè)下一時(shí)段的需糖量，同時(shí)對(duì)補(bǔ)料泵轉(zhuǎn)速進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。

1.5.2 pH反饋補(bǔ)料

將恒定葡萄糖濃度補(bǔ)料工藝與 pH反饋控制策略相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)補(bǔ)料過程中碳源和氮源同時(shí)補(bǔ)加。其操作方法是將116 ℃滅菌后的糖液 (680 g/L) 與濃氨水 (22.82 g/100 mL) 按照一定比例混合 (該比例通過恒定葡萄糖濃度補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)確定)，混合所得糖氨混合溶液中糖濃度為450 g/L (與工業(yè)生產(chǎn)過程中流加糖濃度相當(dāng))，氨濃度為6.021 g/100 mL。發(fā)酵進(jìn)入產(chǎn)酸階段后，以pH為反饋條件控制糖氨混合液的流加，實(shí)現(xiàn)pH控制的同時(shí)完成補(bǔ)糖操作。

1.6 離線參數(shù)測(cè)定

谷氨酸、乳酸含量通過SBA-40C生物傳感儀分析測(cè)定[10]；菌體濃度采用分光光度法在620 nm下測(cè)定；還原糖采用菲林法測(cè)定[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵產(chǎn)酸期葡萄糖與氨消耗關(guān)系

考慮到補(bǔ)料方式對(duì)谷氨酸轉(zhuǎn)化率的影響，為獲得適用于pH反饋方式下的糖氨混合比，本文采用恒定葡萄糖濃度補(bǔ)料方式進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵。以葡萄糖為碳源、以氨水為無機(jī)氮源和pH調(diào)節(jié)劑，計(jì)量產(chǎn)酸期氨消耗量和葡萄糖消耗量，并以此為基礎(chǔ)計(jì)算兩者之間的比例關(guān)系。三批次谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸期補(bǔ)料時(shí)段中氨消耗量與葡萄糖消耗量關(guān)系如圖 1所示，實(shí)驗(yàn)獲得糖氨消耗關(guān)系為y=7.4744 x (式中x、y分別表示氨消耗量、葡萄糖消耗量)，R2=0.9989，糖氨消耗比例為7.4744 g糖/g氨，按此比例配制糖氨混合溶液，作為后續(xù)pH反饋補(bǔ)料方式下的補(bǔ)料液。嚴(yán)格意義上，此比例關(guān)系僅適用于該菌種產(chǎn)酸期，不涉及發(fā)酵0~10 h的菌體生長(zhǎng)階段。之所以如此，是因?yàn)樯a(chǎn)之初培養(yǎng)基中的初始糖濃度完全可滿足菌體生長(zhǎng)期需求。隨著菌種進(jìn)入產(chǎn)酸期，菌體對(duì)糖的需求增加，葡萄糖濃度逐步降低，當(dāng)糖濃度降至一定水平時(shí)，需補(bǔ)加葡萄糖以維持菌體正常產(chǎn)酸。目前工業(yè)生產(chǎn)中，糖濃度一般維持在15~20 g/L之間，因此本文的pH反饋補(bǔ)料工藝在糖濃度降到20 g/L時(shí)開始進(jìn)行。

圖 1 三批次谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸期氨消耗量與葡萄糖消耗量關(guān)系

Fig. 1 Relationship between the consumption amounts of ammonia and glucose in 3 batches fermentation.

2.2 補(bǔ)料方式對(duì)葡萄糖濃度影響

采用恒定葡萄糖濃度補(bǔ)料工藝與 pH反饋補(bǔ)料工藝分別進(jìn)行三批次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)比兩種補(bǔ)料工藝對(duì)谷氨酸發(fā)酵過程中葡萄糖濃度的影響。其中，在控制補(bǔ)料操作開始即發(fā)酵10 h前，保持發(fā)酵過程中溫度、pH、溶氧情況一致。

由于補(bǔ)料開始前，各控制參數(shù)一致，菌體對(duì)糖的消耗情況也基本相同，當(dāng)葡萄糖濃度降至20 g/L左右 (發(fā)酵10 h時(shí))，分別采用兩種補(bǔ)料工藝開始補(bǔ)料。如圖 2所示，恒定葡萄糖濃度補(bǔ)料方式下，葡萄糖濃度在5~29 g/L之間波動(dòng)，補(bǔ)料過程中易出現(xiàn)糖濃度過高或不足的情況，葡萄糖濃度的波動(dòng)造成發(fā)酵體系的不穩(wěn)定，不利于菌體代謝。相比之下，pH反饋補(bǔ)料方式在補(bǔ)料階段使葡萄糖濃度維持在設(shè)定值附近，穩(wěn)定在12~21 g/L之間。pH反饋補(bǔ)料工藝由于采用糖氨混合溶液作為補(bǔ)料液，其中的碳源、氮源配比恰好滿足菌體維持生長(zhǎng)和產(chǎn)酸的需求，使進(jìn)入發(fā)酵體系的碳源、氮源及時(shí)被菌體代謝消耗，并可根據(jù)菌體產(chǎn)酸情況對(duì)葡萄糖補(bǔ)加量進(jìn)行及時(shí)調(diào)節(jié)，從而避免了葡萄糖濃度大幅波動(dòng)，有效地維持葡萄糖濃度穩(wěn)定。

2.3 補(bǔ)料方式對(duì)谷氨酸產(chǎn)酸過程的影響

在葡萄糖濃度穩(wěn)定的基礎(chǔ)上，考察了兩種補(bǔ)料方式對(duì)谷氨酸產(chǎn)酸速率的影響。圖3是谷氨酸濃度的變化。葡萄糖濃度的穩(wěn)定控制使菌體所處發(fā)酵環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定，減輕了環(huán)境因素對(duì)菌體造成的不利影響，從而使菌體產(chǎn)酸能力提升。采用恒定葡萄糖濃度補(bǔ)料進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)酸期平均產(chǎn)酸速率為4.56 g/(L·h)；而采用pH反饋補(bǔ)料時(shí)平均產(chǎn)酸速率為5.36 g/(L·h)，提高了17.5%。

圖2 補(bǔ)料方式對(duì)葡萄糖濃度的影響Fig. 2 Effect of glucose-fed methods on glucose concentration. (A) Constant glucose concentration fed-batch method. (B) pH feedback-controlled substrate feeding method. The first arrow indicates the start of glucose addition and the second arrow stands for the end of glucose feeding.

圖3 補(bǔ)料方式對(duì)谷氨酸濃度的影響Fig. 3 Effect of glucose-fed methods on glutamic acid concentration. (A) Constant glucose concentration fed-batch method. (B) pH feedback-controlled substrate feeding method. The first arrow indicates the start of glucose addition and the second arrow stands for the end of glucose feeding.

2.4 補(bǔ)料方式對(duì)谷氨酸轉(zhuǎn)化率的影響

pH反饋補(bǔ)料方式下，由于發(fā)酵液中葡萄糖濃度得到有效控制，有利于菌種對(duì)葡萄糖的消耗利用，同時(shí)因葡萄糖濃度對(duì)乳酸生成有一定影響，故以乳酸為主的發(fā)酵副產(chǎn)物濃度下降，提高了葡萄糖的轉(zhuǎn)化率 (以谷氨酸量為分子，以總加糖量為分母)。如圖 4所示，恒定葡萄糖濃度補(bǔ)料工藝下，葡萄糖轉(zhuǎn)化率為48.33%；采用pH反饋補(bǔ)料工藝時(shí)，葡萄糖轉(zhuǎn)化率提高到了52.71%。

圖4 補(bǔ)料方式對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig. 4 Effect of glucose-fed methods on conversion rate. (A) Constant glucose concentration fed-batch method. (B) pH feedback-controlled substrate feeding method. The first arrow indicates the start of glucose addition and the second arrow stands for the end of glucose feeding.

表2 兩種補(bǔ)料方式下，發(fā)酵結(jié)果比較Table 2 Results of fermentation experiment under two kind of glucose-fed methods

表2是兩種補(bǔ)料方式下，分別進(jìn)行三批次發(fā)酵結(jié)果匯總。通過表 2可以看出，與恒定葡萄糖濃度補(bǔ)料工藝相比，pH反饋控制補(bǔ)料工藝總加糖量相當(dāng)，轉(zhuǎn)化率提升明顯，兩種補(bǔ)料方式下，因補(bǔ)料結(jié)束即停止發(fā)酵，發(fā)酵液殘?zhí)菨舛扰c產(chǎn)酸期糖濃度水平相當(dāng)，其中兩批次 pH反饋補(bǔ)料發(fā)酵在補(bǔ)料結(jié)束后，繼續(xù)流加氨水1 h，因而殘?zhí)菨舛嚷杂邢陆?；其次?pH反饋補(bǔ)料過程中葡萄糖濃度的穩(wěn)定控制使乳酸含量下降；再者pH反饋補(bǔ)料方式使發(fā)酵速率提高，發(fā)酵時(shí)間明顯縮短 2 h以上，且菌體產(chǎn)酸情況穩(wěn)定。

3 結(jié)論

采用恒定葡萄糖濃度補(bǔ)料方式獲得谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸階段的糖氨比例，配制糖氨混合液，用于pH反饋補(bǔ)料，能將谷氨酸發(fā)酵過程中葡萄糖濃度控制在相對(duì)窄的范圍。

穩(wěn)定的葡萄糖濃度不僅提高了葡萄糖轉(zhuǎn)化率和谷氨酸產(chǎn)酸速率，而且縮短了發(fā)酵周期。恒定葡萄糖濃度補(bǔ)料工藝時(shí)，谷氨酸葡萄糖轉(zhuǎn)化率為48.33%，平均產(chǎn)酸速率 4.56 g/(L·h)；而采用本文設(shè)計(jì)的pH反饋補(bǔ)料工藝，葡萄糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到52.71%，平均產(chǎn)酸速率提高至5.36 g/(L·h)，發(fā)酵周期縮短了2 h以上。

pH反饋補(bǔ)料工藝操作簡(jiǎn)單，利于工業(yè)應(yīng)用。

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