張春雷,周小梅,張書楠,呂 琪,陳桂冰,李慶寬

(1.深圳市中醫(yī)院醫(yī)學檢驗科,廣東深圳 518020;2.中南大學湘雅醫(yī)學院2005級醫(yī)學檢驗系,湖南長沙 410078）

抗雙鏈DNA(double stranded DNA,dsDNA)抗體是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(system ic lupus ery thematosus,SLE)患者的特征性標志抗體[1-2],對于SLE的診斷和治療有著非常重要的作用,美國風濕病學會已將其列為SLE診斷標準之一,其特異性達到了(95～100)%。抗dsDNA抗體滴度的高低與SLE的活動密切相關[3-4],抗體滴度高提示SLE處于活動期。該抗體直接與腎小球細胞中DNA結合或與循環(huán)血液中DNA結合形成免疫復合物,沉積于腎小球基底膜,抗dsDNA抗體檢測是目前SLE患者診斷及治療最常用的指標之一。檢測抗dsDNA抗體的方法較多,常用的有間接免疫熒光法(indirect immunofluorescent assay,IIFA)、酶聯免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、免疫印跡法(immunobiotting test,IBT)等,本課題將以上3種檢測方法進行比較,具體報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2009年4月至2010年4月在深圳市中醫(yī)院就診,確診為SLE的患者血清標本70人份(清晨空腹抽血,分離血清并置2～8℃冰箱備檢)作為實驗組,患者的選擇符合美國風濕協會關于SLE的診斷標準,其中男12例,女58例,年齡 16～70歲,平均 34.5歲。將血常規(guī)、肝腎功能檢查結果正常的健康體檢者的血清標本650人份作為健康對照組,其中,男305例,女 345例,年齡 20～ 50歲。

1.2 主要試劑與儀器 綠蠅短膜蟲dsDNA IIFA試劑盒(30T)、抗dsDNA抗體(IgG)ELISA檢測試劑盒(96T)、抗核抗體譜IBT試劑盒(64T)均購自德國歐蒙醫(yī)學診斷技術有限公司;主要采用ZEISS型熒光顯微鏡(德國)、TS-8型轉移脫色搖床(上海)及 ELX-800型酶標儀(美國)進行實驗。

1.3 方法 同時采用IIFA、ELISA和IBT法對實驗組及健康對照組血清標本進行抗dsDNA抗體的檢測。3種方法嚴格按照試劑盒使用說書進行操作,將試劑盒所帶的陽性對照、陰性對照與待測標本同時測量。IIFA定性檢測:熒光顯微鏡下觀察到試劑盒檢測薄片綠蠅短膜蟲動基體出現蘋果綠熒光為陽性。ELISA半定量檢測:以標準品2(濃度100 IU/m L)為測定臨界值,與待測樣本同時測量,選擇酶標儀比色波長為450 nm,參考波長為630 nm,加終止液后30m in之內比色,其中測定結果大于或等于100 IU/m L為陽性,小于100 IU/m L為陰性。IBT定性檢測:反應膜在特定位置出現肉眼可見的、與質控帶顏色相同的顯色條帶為陽性,否則為陰性。

1.4 統(tǒng)計學處理 多樣本率的比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

健康對照組與實驗組檢測結果見表1。實驗組IIFA法檢出的24例抗dsDNA抗體陽性標本中,ELISA、IBT法檢測均為陽性;IBT法檢測的31例抗dsDNA抗體陽性標本中,ELISA法檢測也為陽性。ELISA和IBT檢出陽性率與IIFA方法比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表1 IIFA、ELISA及IBT法檢測實驗組與健康對照組中抗dsDNA抗體的結果比較[n(%)]

3 討 論

實驗結果提示ELISA檢測抗dsDNA抗體敏感性最高,可進行半定量檢測,有助于對SLE的診斷及病情活動程度的監(jiān)控[5-6]。同時,ELISA檢測不需要特殊設備,適合基層醫(yī)院及標本量較多的實驗室進行篩查,具有較好的市場前景。本實驗健康對照組ELISA檢測中有29例抗dsDNA抗體陽性,而臨床追蹤調查并未發(fā)現有相應的臨床表現,這可能是因為ELISA檢測的影響因素較多,譬如標本稀釋、抗原板的洗滌、酶標儀的校準等均可造成結果誤差;其次,由于ELISA檢測采用生物提取dsDNA作為實驗基質,在制備過程中,DNA的內部結構位點可能存在人為暴露,會因單鏈DNA(single-stranded DNA,ssDNA)抗體的存在而產生非特異性反應[7-8]。盡管如此,由于ELISA檢測的高度敏感性,結合患者的臨床表現,它仍不失為一種較好的篩查方法。

IIFA檢測抗dsDNA抗體是采用綠蠅短膜蟲作為抗原基質進行檢測的,其動基體只由高純度的環(huán)狀dsDNA構成,除此之外,不含有其他細胞核抗原,因此具有高度特異性,被認為是檢測細胞內抗原自身抗體的金標準[9-10],是一種較好的確證方法。實驗中,IIFA、ELISA及IBT 3種方法均顯示抗dsDNA抗體陽性的標本有24例,與患者臨床跟蹤調查結果一致。然而IIFA結果的判斷有一定的主觀性,易受檢測人員技術水平及主觀因素影響,且熒光顯微鏡價格昂貴,基層醫(yī)院難以開展,本實驗提示IIFA的敏感性相對較低,不能準確定量。因此,IIFA檢測在臨床診斷和治療方面,難以起到準確的監(jiān)測作用[11]。

IBT檢測抗dsDNA抗體操作簡便、省時、特異性好、用血量少、無需特殊設備、重復性好,可同時完成對14種自身抗體的識別和過篩,對提高自身免疫疾病的診斷水平有很大的幫助,適合于各大醫(yī)院推廣應用。然而IBT檢測中,由于一張硝酸纖維膜上有數種成分顯示,多個條帶相距很近,每次電泳時不同蛋白質在凝膠中遷移的速率不同以及蛋白質區(qū)帶在電泳時形成的斜率,給這些條帶的識別帶來一定困難,特別是對臨界陽性的標本,不同操作者對結果的判斷也不盡相同,很容易造成誤判或假陽性,IBT試劑在生產過程中可能發(fā)生抗原轉印不充分或轉印時發(fā)生抗原丟失,影響結果判定,導致假陰性[12]。

在臨床工作中,根據實際情況采用聯合檢測[13],并結合患者的臨床表現來判斷結果。同時,提高ELISA檢測的特異性以及IIFA檢測的敏感性是當前研究的重點,目前利用熒光PCR檢測dsDNA含量的方法受到了越來越多的重視[14-15],在今后的檢驗工作中將扮演越來越重要的角色。

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