費(fèi)英敏，石彥國(guó)

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，哈爾濱 150076）

醬油是人們生活中不可缺少的一種傳統(tǒng)調(diào)味品，品質(zhì)優(yōu)良的醬油含有人體所必需的多種氨基酸、糖分、維生素及微量元素，能夠促進(jìn)食欲，幫助消化，是對(duì)健康有益的營(yíng)養(yǎng)品。衡量醬油品質(zhì)優(yōu)劣的關(guān)鍵指標(biāo)是氨基酸態(tài)氮，其含量越高，醬油的品質(zhì)越好，味道越鮮美[1]。但配制醬油中多數(shù)添加酸水解植物蛋白液，由于酸水解植物蛋白工藝的局限性，在產(chǎn)品中會(huì)有少量的氯丙醇?xì)埩簦羯a(chǎn)條件波動(dòng)大，氯丙醇?xì)埩袅考哟?，?dǎo)致醬油中氯丙醇超標(biāo)，因此限制了醬油的出口[2]。

大豆分離蛋白是純植物、天然的產(chǎn)品，蛋白質(zhì)含量90%以上，是極佳的優(yōu)質(zhì)蛋白源，富含20種氨基酸，包括人體生長(zhǎng)所需的全部8種必需氨基酸，營(yíng)養(yǎng)豐富。大豆蛋白經(jīng)水解后，其功能特點(diǎn)可明顯改變。由于水解生成的小肽以及氨基酸易被人體消化吸收，因此更適于病人、老年人及兒童食用。大豆蛋白水解的肽及氨基酸混合物進(jìn)入人體后，具有降低膽固醇的作用，亦有利于腸道內(nèi)的乳酸菌、雙歧桿菌的生長(zhǎng)[3]。同時(shí)水解產(chǎn)物因其口味，可作調(diào)味液增強(qiáng)劑添加到醬油、豆醬及蠔油等湯料中[4]。大豆蛋白添加到醬油中可提高醬油的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，提高總氮的含量，降低生產(chǎn)成本。但普通的大豆分離蛋白黏度大，有一定的凝膠特性，而醬油中需要具有溶解性好、分散性強(qiáng)的特性蛋白。本研究的目的是應(yīng)用蛋白酶酶解大豆分離蛋白，確定合適的酶解程度，使酶解產(chǎn)物具有良好的溶解性、分散性。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白：哈高科大豆食品有限責(zé)任公司；

Ⅰ型、Ⅱ型酶制劑：德國(guó)酶制劑公司；釀造醬油：哈爾濱正陽(yáng)河醬油廠。

1.2 儀器與設(shè)備

SHZ-82型調(diào)溫空氣浴震蕩器：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；GJJ-270型均質(zhì)機(jī)：上海申鹿均質(zhì)機(jī)有限公司；KT260型定氮儀：瑞士FOSS公司；JJ-2B型高速組織搗碎機(jī)：金壇市天瑞儀器有限公司；YC-015微型實(shí)驗(yàn)室噴霧干燥機(jī)：上海雅程儀器設(shè)備有限公司；美國(guó)HP1050型高壓液相色譜儀（HPLC）。

1.3 工藝流程及操作要點(diǎn)

大豆分離蛋白酶解的工藝流程：

大豆分離蛋白凝乳→調(diào)節(jié)pH值→加酶制劑酶解→滅酶→噴霧干燥→成品

大豆分離蛋白酶解的操作要點(diǎn)：準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的大豆分離蛋白凝乳，用蒸餾水配制成一定濃度的溶液，用酸堿調(diào)節(jié)pH值，加入2.5‰Ⅰ型酶制劑和0.5‰Ⅱ型酶制劑，在一定溫度下水浴酶解，酶解過(guò)程中用酸堿調(diào)節(jié)使其pH值保持恒定，反應(yīng)完成后90℃條件下滅酶5min，然后將其進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥時(shí)進(jìn)風(fēng)溫度180℃，出風(fēng)溫度80℃。

配制醬油制作基本配方：釀造醬油96%，酶解大豆蛋白2%，添加劑2%。

配制醬油制作的操作要點(diǎn)：將選定的釀造醬油先加熱至80～85℃進(jìn)行滅菌，冷卻至50℃左右再加入酶解大豆蛋白進(jìn)行配制（勾兌），進(jìn)行配制前需先將酶解大豆蛋白用50℃左右的熱水進(jìn)行溶解，再用攪拌器3000r/min攪拌3min使之成為均勻的乳狀液。2h后感官檢測(cè)配制醬油的澄清度及沉淀狀況。

1.4 測(cè)定指標(biāo)

1.4.1 氨基酸態(tài)氮的測(cè)定[5]按照GB/T18186-2000第六章檢驗(yàn)。

1.4.2 分散穩(wěn)定性的測(cè)定[6]稱取5g酶解后并經(jīng)噴霧干燥的樣品，溶于95mL水中，25℃條件下用磁力攪拌器攪拌1h。取10mL于離心管中，在2500r/min下離心10min。讀出析出水的毫升數(shù)X，其計(jì)算公式為：分散穩(wěn)定性=[（10-X）/10]×100%

1.4.3 澄清度、穩(wěn)定性檢驗(yàn) 取2.0mL配制醬油樣品于25mL具塞試管中，加水至刻度，充分振蕩，靜置30min后觀察色澤及沉淀情況。

1.4.4 氨基酸組分分析[7]

（1）FMOC柱前衍生

準(zhǔn)確稱取樣品0.5mg，酸解，先用OPA衍生一級(jí)氨基酸，在室溫下需30s，繼之用FMOC衍生二級(jí)氨基酸，室溫下大約2min。用3-巰基異丙醇代替β-巰基乙醇，使異吲哚衍生物疏水性降低，使出峰時(shí)間在14.5min之內(nèi)，過(guò)量的FMOC及其分解產(chǎn)物的出峰時(shí)間在最后被洗脫出的二級(jí)氨基酸之后，不干擾分析結(jié)果。樣品最終定容至10mL，離心后取樣10μL上色譜柱。

（2）色譜條件

色譜柱：C184.6×200mm5μm柱。流動(dòng)相：A：20mmol/L乙酸鈉，0.018%三乙醇胺，0.3%四氫呋喃(pH7.2)；B：100mmol/L乙酸鈉∶乙腈∶甲醇(1∶2∶2)。梯度洗脫：0min時(shí)A為100%，0～23min，B由0%上升至60%，24min時(shí)B為100%，25min時(shí)B為0%。流速：1mL/min。柱溫：40℃。二極管陳列檢測(cè)器檢測(cè)一級(jí)氨基酸：檢測(cè)λ228nm，參比λ390nm；檢測(cè)二極氨基酸：檢測(cè)λ262nm，參比λ324nm.。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同酶解時(shí)間對(duì)游離氨基酸態(tài)氮和分散穩(wěn)定性的影響

圖1 不同時(shí)間對(duì)酶解效果的影響

由圖1可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，游離氨基酸態(tài)氮含量和分散穩(wěn)定性逐漸提高，至5h左右達(dá)到最大并趨于穩(wěn)定。這主要是因?yàn)槊附庵?，底物濃度高，在加酶量一定的情況下，酶解速率高；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)底物逐漸被轉(zhuǎn)化之后，酶解速率便開(kāi)始下降。同時(shí)，溫度使酶蛋白變性是隨時(shí)間累加的，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，部分酶發(fā)生失活也是導(dǎo)致酶解后程速率下降的一個(gè)原因。

2.2 不同酶解溫度對(duì)游離氨基酸態(tài)氮和分散穩(wěn)定性的影響

圖2 不同溫度對(duì)酶解效果的影響

由圖2可知，溫度對(duì)酶解效果有顯著影響。隨溫度升高，游離氨基酸態(tài)氮含量和分散穩(wěn)定性逐漸提高，50℃達(dá)到最大，繼續(xù)升高溫度，酶解效果降低。這是因?yàn)槊概c大多數(shù)化學(xué)反應(yīng)有相同之處,在較低溫度下，當(dāng)溫度升高時(shí)，反應(yīng)速率加快，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率逐漸上升；但是隨著溫度繼續(xù)升高，酶蛋白會(huì)逐漸變性而失活，引起酶反應(yīng)速率下降，導(dǎo)致蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率下降。

2.3 不同pH值對(duì)游離氨基酸態(tài)氮和分散穩(wěn)定性的影響

圖3 不同pH值對(duì)酶解效果的影響

由圖3可知，pH值對(duì)酶解效果有顯著影響。在pH值為7時(shí)游離氨基酸態(tài)氮含量和分散穩(wěn)定性最高。pH值對(duì)酶催化反應(yīng)速率的影響主要有兩方面，首先過(guò)酸或過(guò)堿可以使酶的空間構(gòu)象改變，使酶失活；其次pH值直接影響著酶及蛋白質(zhì)分子某些解離基團(tuán)的解離狀態(tài)，只有在特定的pH值條件下，酶及底物蛋白質(zhì)的解離基團(tuán)才能處于最易于結(jié)合并轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的解離狀態(tài)。

2.4 不同酶解條件產(chǎn)物調(diào)配將有的結(jié)果分析

表1 不同酶解條件的大豆蛋白產(chǎn)物調(diào)配的醬油質(zhì)量結(jié)果

由表1可知，酶解程度不同的產(chǎn)物加入到醬油中對(duì)醬油的品質(zhì)影響顯著，其中在酶解溫度為50℃、pH值為7.0、酶解時(shí)間為5h條件下的酶解產(chǎn)物和釀造醬油調(diào)配出的配制醬油質(zhì)量最好，醬油澄清不渾濁，且放置一定時(shí)間后無(wú)沉淀生成。

所以，選擇酶解溫度為50℃、pH值為7.0、酶解時(shí)間為5h條件下的大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物作為調(diào)配配制醬油的基料。

2.5 最優(yōu)條件酶解產(chǎn)物氨基酸成分分析

表2 最優(yōu)條件酶解產(chǎn)物氨基酸成分分析

從表2中可以得知：在大豆分離蛋白最優(yōu)酶解條件的水解產(chǎn)物中，共檢出18種常見(jiàn)的氨基酸，其中谷氨酸含量最高，約占氨基酸總量的15.89%，18種氨基酸中有8種人體必需氨基酸，分別為：色氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸，約占氨基酸總量的28.46%。因此，可以認(rèn)為大豆分離蛋白水解產(chǎn)物中含有多種人體必需氨基酸，且含量較高，具有極好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

3 結(jié)論

通過(guò)酶解大豆分離蛋白來(lái)提高大豆分離蛋白的溶解性、分散穩(wěn)定性和游離氨基酸態(tài)氮含量，能夠達(dá)到良好的氨基酸平衡。通過(guò)試驗(yàn)可以得出，酶解溫度為50℃、pH值為7.0、酶解時(shí)間為5h條件下的大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物最適合應(yīng)用到配制醬油中，可以保證醬油的各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求。

［1］佟志揚(yáng).醬油中氨基酸態(tài)氮檢測(cè)及分析[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志.2010（2）:429．

［2］李國(guó)基.蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中氯丙醇的形成機(jī)理[J].中國(guó)釀造.1997（5）:26-29．

［3］Ader Nissen J.Enzymatic hydrolysis of protein for inreased solubility[J].J Agric Food Chem,1976,24（6）:1090-1096.

［4］張國(guó)治,陳潔,王放.水解植物蛋白及其在食品中的應(yīng)用[J].中國(guó)釀造,1995（5）:27-28．

［5］GB 18186—2000釀造醬油

［6］張鵬.大豆蛋白肽的制備和應(yīng)用研究[J].沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué).2007:51-53．

［7］陸暉,閆曉梅,張雙全.羊胎盤(pán)活細(xì)胞素微量元素和氨基酸組成的分析[J].南京師大學(xué)報(bào).2001（1）:79-80.