陸震鳴,何喆,許泓瑜,史勁松,許正宏
1 江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院 制藥工程研究室,無錫 214122
2 江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院 生物活性制品加工工程研究室,無錫 214122
樟芝Antrodia camphorata,又名牛樟菇、牛樟芝,是一種生長于臺灣牛樟樹 Cinnamomum kanehirai腐朽內(nèi)壁的藥用絲狀真菌[1]。研究表明,樟芝具有抗腫瘤、保肝、抗炎癥、調(diào)節(jié)免疫等良好生物活性[2]。由于樟芝自然產(chǎn)量極低,子實(shí)體人工栽培技術(shù)尚未產(chǎn)業(yè)化,導(dǎo)致近年來樟芝子實(shí)體十分昂貴,所以采用生物技術(shù)方法液態(tài)培養(yǎng)獲得樟芝發(fā)酵產(chǎn)物是目前的主要方法。有學(xué)者以生物量或活性物質(zhì)產(chǎn)量為指標(biāo)對樟芝的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化[3-5],但是不同研究報道的樟芝發(fā)酵條件及產(chǎn)量性狀相差較大。發(fā)酵規(guī)模的不同、菌種和接種方法的差異以及發(fā)酵條件和發(fā)酵過程控制策略的差異等可能是造成不同研究結(jié)果差異明顯的主要原因。
絲狀真菌的發(fā)酵過程具有影響因素較多、高度非線性和復(fù)雜性等特征[6]。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) (ANN) 為研究非線性問題提供了強(qiáng)有力的解決辦法。與回歸方程需要預(yù)先給定函數(shù)不同,ANN是以實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)經(jīng)過有限次的迭代計(jì)算而獲得的一個反映實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)內(nèi)在聯(lián)系的數(shù)學(xué)模型,具有極強(qiáng)的非線性處理能力。遺傳算法 (GA) 是借鑒生物界自然選擇和群體進(jìn)化機(jī)制形成一種全局尋優(yōu)算法,通過 GA可以對 ANN模型進(jìn)行全局性的訓(xùn)練,最終得到最佳方案。ANN-GA技術(shù)在故障診斷、生物行為模仿、廢水處理等多個行業(yè)都已有應(yīng)用報道[7],但在絲狀藥食用真菌發(fā)酵研究領(lǐng)域尚未見應(yīng)用報道。
本研究以樟芝模式菌株 Antrodia camphorata ATCC 200183為研究對象,考察了樟芝孢子萌發(fā)生長及菌球形成的過程。同時采用旋轉(zhuǎn)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) (RCCD) 考察了孢子濃度培養(yǎng)基組成對樟芝生物量的顯著影響。進(jìn)一步比較了ANN和響應(yīng)面法 (RSM) 對樟芝發(fā)酵過程的建模效果,并用 GA對ANN模型進(jìn)行結(jié)果尋優(yōu),從而獲得最優(yōu)培養(yǎng)基組成。
1.1.1 菌種
樟芝Antrodia camphorata ATCC 200183,本實(shí)驗(yàn)室保藏。
1.1.2 培養(yǎng)基
斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g/L,葡萄糖20 g/L,瓊脂20 g/L,pH自然。
發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖濃度、蛋白胨濃度和黃豆粉濃度按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)值,MgSO41.5 g/L,KH2PO43.0 g/L,pH 4.5。
1.1.3 儀器
BX60型光學(xué)顯微鏡,日本 Olympus公司;冷凍干燥機(jī),美國Labconco公司;2135型組織切片機(jī),德國 Leica公司;DHZ-DA型恒溫?fù)u床,太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。
1.2.1 樟芝發(fā)酵方法
孢子接種物的制備:用接種鏟將樟芝菌絲體從PDA斜面上轉(zhuǎn)接入PDA平板,26 ℃培養(yǎng)21 d。取10 mL無菌發(fā)酵培養(yǎng)基將平板上的樟芝孢子洗下,采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并稀釋后作為種子液用于發(fā)酵實(shí)驗(yàn)[8]。
發(fā)酵方法:500 mL三角搖瓶中裝100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基,滅菌后接入一定數(shù)量的樟芝孢子,100 r/min、26 ℃培養(yǎng)8 d。
1.2.2 生物量測定方法
發(fā)酵結(jié)束的樟芝發(fā)酵產(chǎn)物用 6層紗布過濾得到菌球,經(jīng)去離子水洗滌后進(jìn)行冷凍干燥,稱重并計(jì)算生物量。
1.2.3 形態(tài)觀察
發(fā)酵過程中,采用光學(xué)顯微鏡對發(fā)酵液中樟芝的不同形態(tài)進(jìn)行觀察。樟芝菌球內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察采用切片方法:菌球從發(fā)酵產(chǎn)物中分離后用4 ℃的生理鹽水進(jìn)行漂洗,取一定數(shù)量的樟芝菌球于10%甲醛溶液中固定 24 h后用乙醇進(jìn)行脫水并包埋于石蠟塊中。然后用組織切片機(jī)將其切成5 μm薄片,薄片采用H&E染料染色。H&E染色步驟如下:溶解蠟(二甲苯洗3次,每次3 min;無水乙醇洗3次,每次3 min;95%乙醇洗2次,每次3 min;70%乙醇洗2次,每次3 min);Haematoxylin染色3 min;水洗10 min;Eosin染色1 min;70%乙醇洗1次,3 s;95%乙醇洗2次,每次3 s;無水乙醇洗2次,每次3 s; 二甲苯洗3次,每次3 s;蓋片、陰干后以光學(xué)顯微鏡觀察。
1.2.4 RCCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
前期單因素實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明碳源、氮源、碳氮比和孢子接種濃度是影響樟芝生物量的顯著因素。為了確定樟芝發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基組成,本實(shí)驗(yàn)選用四因素三水平的旋轉(zhuǎn)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表和實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。
1.2.5 RSM模型的建立
采用Design Expert 7.1.0軟件對表1中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,并通過最小二乘法擬合二次多項(xiàng)方程,建立二次回歸模型[9]。該模型方程為:
其中Y為響應(yīng)值 (生物量),β0、βi、βii和βij為方程系數(shù),Xi和Xj為自變量編碼值。多項(xiàng)式模型方程擬合的精度和泛化能力由回歸系數(shù)R2表征。
1.2.6 ANN模型的建立
采用反向傳播 (BP) 方法建立ANN模型。模型中含有輸入層、隱含層和輸出層,以表 1中樟芝孢子濃度和發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖、蛋白胨、黃豆粉的濃度為輸入值,以發(fā)酵終止時樟芝生物量為輸出值。隱含層和輸出層的傳遞函數(shù)分別為 tansig函數(shù)和purelin函數(shù),同時用trainbr算法訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò),當(dāng)均方誤差 (MSE) 達(dá)到1×10?3時,網(wǎng)絡(luò)停止訓(xùn)練。
為了評價模型的擬合能力和預(yù)測能力,分別計(jì)算所建立模型的均方根誤差 (RMSE)、方差 (R2) 和預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)誤差 (SEP)[10]:
1.2.7 GA優(yōu)化
本實(shí)驗(yàn)采用浮點(diǎn)編碼的方式對發(fā)酵過程中孢子濃度、葡萄糖含量、蛋白胨含量和黃豆粉含量 4個因素在其各自取值范圍內(nèi)進(jìn)行ANN模擬推算,并以模型擬合值作為遺傳算法的適應(yīng)性函數(shù),進(jìn)行選擇、變異、交換操作。樟芝生物量越高,則適應(yīng)度越高。程序通過MATLAB 7.6軟件和其附帶的GA遺傳算法工具箱編寫完成。
樟芝在搖瓶培養(yǎng)過程中的形態(tài)變化過程見圖1。圓柱狀的樟芝孢子 (2 μm×5~10 μm) (圖1A) 接入新鮮培養(yǎng)基后開始萌發(fā)并形成絲狀菌絲 (圖1B),菌絲不斷生長并相互纏繞形成蓬松的菌絲團(tuán) (圖1C)。菌絲團(tuán)進(jìn)一步形成菌球 (直徑0.5~2.0 mm) (圖1D),隨后以菌球的形式在搖瓶中至發(fā)酵結(jié)束。通過切片觀察發(fā)現(xiàn),菌球內(nèi)外兩層的菌絲密度不同,內(nèi)層的菌絲較外層疏松 (圖 1E),這可能是由于菌球內(nèi)部傳質(zhì)、傳氧受限所致[11]。樟芝發(fā)酵過程中孢子、菌絲、菌絲團(tuán)、菌球的形態(tài)變化過程以及菌球內(nèi)部的不均勻性都說明了樟芝發(fā)酵體系的復(fù)雜性,對其過程的建模需要采用RSM、ANN等非線性處理工具。
表1 RCCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表與實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Design matrix and results obtained in RCCD
圖1 發(fā)酵過程中樟芝的不同形態(tài)Fig. 1 Different morphological forms of Antrodia camphorata in submerged culture. (A) Spore. (B) Mycelia. (C) Mycelium regiment. (D) Pellets. (E) Section of Antrodia camphorata pellets.
表2 二次模型的方差分析結(jié)果Table 2 ANOVA of the fitted quadratic model
利用Design-Expert軟件對表1中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,表 2為回歸分析結(jié)果?;貧w方差分析顯著性檢驗(yàn)表明,該模型回歸顯著 (R2= 0.915 6),說明回歸方程能夠用于表1中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合?!發(fā)ack of fit”值為0.000 4,說明模型預(yù)測值與實(shí)際值不擬合的概率為顯著,因此二次模型可能難以充分描述樟芝的發(fā)酵過程?!癙rob>F”值小于0.05說明該項(xiàng)在95%的置信區(qū)間內(nèi)顯著。本研究中,X1、X2、X3、X4、X12、X14、X24、X34、X12、X22、X32、X42是顯著項(xiàng),獲得回歸方程為:
Y=5.68–0.17X1+0.10X2+0.22X3+0.14X4+0.14X1X4+0.15X3X4–0.42X12–0.14X22–0.19X32–0.14X42。
以表1中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作為BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練樣本,根據(jù)實(shí)驗(yàn)因素的個數(shù)和優(yōu)化指標(biāo)的個數(shù)設(shè)計(jì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果,然后用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行訓(xùn)練。為防止過擬合情況發(fā)生,在滿足訓(xùn)練精度的情況下,中間隱層節(jié)點(diǎn)數(shù)目盡可能少選,本實(shí)驗(yàn)選擇的隱含層節(jié)點(diǎn)數(shù)為 6。隱含層和輸出層的傳遞函數(shù)分別為tansig函數(shù)和purelin函數(shù),同時用trainbr算法訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò),當(dāng)均方誤差達(dá)到1×10?3時,網(wǎng)絡(luò)停止訓(xùn)練。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,樣本訓(xùn)練能較快地達(dá)到收斂(圖2)。模型模擬結(jié)果與實(shí)驗(yàn)值的擬合度較好 (圖3),兩者之間的相對誤差在 5%以內(nèi),說明建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)性能良好,不需要再添加訓(xùn)練樣本。
為了對建立的ANN模型和RSM模型進(jìn)行比較,分別計(jì)算兩種模型的RMSE、R2和SEP。結(jié)果表明ANN模型的 RMSE、R2和 SEP分別為 0.03、0.99和0.53%,而RSM模型的RMSE、R2和SEP分別為0.20、0.91和 4.06%。通常較高的RMSE和R2說明模型對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合能力較好,而SEP越低則說明模型具有越好的預(yù)測能力和外推能力。與RSM模型相比,本實(shí)驗(yàn)中ANN模型對樟芝發(fā)酵過程的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合的較好,并且具有更好的模型預(yù)測能力和外推能力。這可能是由于RSM模型建立的數(shù)學(xué)回歸模型屬于二次多項(xiàng)式,因此擬合能力有限,無法很好地反映樟芝發(fā)酵過程中各因素與指標(biāo)之間的高度非線性關(guān)系。而ANN模型不需要像回歸方程那樣要預(yù)先給定函數(shù),而是以實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)經(jīng)過有限次的迭代計(jì)算而獲得的一個反映實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)內(nèi)在聯(lián)系的數(shù)學(xué)模型,具有極強(qiáng)的非線性處理能力。因此,本實(shí)驗(yàn)最終采用ANN模型作為GA優(yōu)化的適度值函數(shù),用于求出各個因素的最佳組合。
遺傳算法是借鑒生物界自然選擇和群體進(jìn)化機(jī)制所形成的一種隨機(jī)搜索算法,它以其高效、自適應(yīng)及全局搜索的優(yōu)勢在很多領(lǐng)域中得到應(yīng)用。它的搜索面廣,尋優(yōu)速度快,得到的結(jié)果能以較大概率接近全局最優(yōu)解[12]。因此,通過遺傳算法可以對ANN模型進(jìn)行全局性的訓(xùn)練,最終得到最佳方案。本實(shí)驗(yàn)中,遺傳算法尋優(yōu)過程見圖4。經(jīng)過61次優(yōu)化計(jì)算,遺傳算法得到的樟芝生物量理論最大值為:6.2 g/L,并獲得發(fā)酵最佳接種量及培養(yǎng)基組成:孢子濃度1.76×105個/mL,葡萄糖29.1 g/L,蛋白胨9.4 g/L,黃豆粉2.8 g/L。在該培養(yǎng)條件下,經(jīng)過3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到樟芝的生物量為 (6.1±0.2) g/L,說明ANN-GA預(yù)測的培養(yǎng)基組成起到了較好的實(shí)驗(yàn)效果。
圖2 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練過程Fig. 2 Training course of BP neural network.
圖3 實(shí)驗(yàn)生物量和RSM、ANN模型預(yù)測生物量的比較Fig. 3 Comparison of experimental biomass and predicted biomass by RSM and ANN.
圖4 遺傳算法中最優(yōu)適度值和平均適度值的變化過程Fig. 4 Evolution of the best and mean fitness in the GA.
樟芝在生長過程中形態(tài)變化的多樣性說明其發(fā)酵過程的復(fù)雜性和非線性。在本文所研究的體系中,成功應(yīng)用ANN-GA方法描述了樟芝發(fā)酵培養(yǎng)基與生物量的關(guān)系,并由此模型預(yù)測了最佳生物量及培養(yǎng)基配方。ANN-GA方法不僅能有效地提高生物量,顯著地降低培養(yǎng)基成本,而且可大大減少繁瑣的實(shí)驗(yàn)工作量及縮短研究周期,這也為優(yōu)化其他絲狀真菌等的復(fù)雜非線性發(fā)酵過程提供了方法借鑒。
REFERENCES
[1] Wu SH, Ryvarden L, Chang TT. Antrodia camphorata (“niu-chang-chih”), new combination of a medicinal fungus in Taiwan. Bot Bull Acad Sin, 1997, 38: 273?275.
[2] Ao ZH, Xu ZH, Lu ZM, et al. Niuchangchih (Antrodia camphorata) and its potential in treating liver diseases. J Ethnopharmacol, 2009, 121(2): 194?212.
[3] Yang FC, Huang HC, Yang MJ. The influence of environmental conditions on the mycelial growth of Antrodia cinnamomea in submerged cultures. Enzyme Microb Technol, 2003, 33(4): 395?402.
[4] Chang CY, Lee CL, Pan TM. Statistical optimization of medium components for the production of Antrodia cinnamomea AC0623 in submerged cultures. Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 72(4): 654?661.
[5] Lin ES, Chen YH. Factors affecting mycelial biomass and exopolysaccharide production in submerged cultivation of Antrodia cinnamomea using complex media. Biores Technol, 2007, 98(13): 2511?2517.
[6] Singh V, Khan M, Khan S, et al. Optimization of actinomycin V production by Streptomyces triostinicus using artificial neural network and genetic algorithm. Appl Microbiol Biotechnol, 2009, 82(2): 379?385.
[7] Almeida JS. Predictive non-linear modeling of complex data by artificial neural networks. Curr Opin Biotechnol, 2002, 13(1): 72?76.
[8] Sun MH, Liu XZ. Carbon requirements of some nematophagous, entomopathogenic and mycoparasitic Hyphomycetes as fungal biocontrol agents. Mycopathologia, 2006, 161(5): 295?305.
[9] Kumar P, Satyanarayana T. Optimization of culture variables for improving glucoamylase production by alginate-entrapped Thermomucor indicae-seudaticae using statistical methods. Bioresource Technol, 2007, 98(6): 1252?1259.
[10] Wang X, Xu P, Yuan Y, et al. Modeling for gellan gum production by Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461 in a simplified medium. Appl Environ Microbiol, 2006, 72(5): 3367?3374
[11] Xu Q, Huang H, Li S, et al. Strategy of pellet formation of filamentous fungi in submerged fermentation. Food Sci Technol, 2009, 34(2): 13?17.徐晴, 黃和, 李霜, 等. 深層發(fā)酵中絲狀真菌菌球形態(tài)控制的策略. 食品科技, 2009, 34(2): 13?17.
[12] Wang Y, Piao MZ, Sun YH. Genetic algorithm for fermentation kinetics of submerged fermentation by Morchella. Chin J Biotech, 2008, 24(8): 1454?1457.王瑩, 樸美子, 孫永海. 基于遺傳算法的羊肚菌液體發(fā)酵動力學(xué)模型的建立. 生物工程學(xué)報, 2008, 24(8): 1454?1457.