陸震鳴，何喆，許泓瑜，史勁松，許正宏

1 江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院 制藥工程研究室，無(wú)錫 214122

2 江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院 生物活性制品加工工程研究室，無(wú)錫 214122

樟芝Antrodia camphorata，又名牛樟菇、牛樟芝，是一種生長(zhǎng)于臺(tái)灣牛樟樹 Cinnamomum kanehirai腐朽內(nèi)壁的藥用絲狀真菌[1]。研究表明，樟芝具有抗腫瘤、保肝、抗炎癥、調(diào)節(jié)免疫等良好生物活性[2]。由于樟芝自然產(chǎn)量極低，子實(shí)體人工栽培技術(shù)尚未產(chǎn)業(yè)化，導(dǎo)致近年來(lái)樟芝子實(shí)體十分昂貴，所以采用生物技術(shù)方法液態(tài)培養(yǎng)獲得樟芝發(fā)酵產(chǎn)物是目前的主要方法。有學(xué)者以生物量或活性物質(zhì)產(chǎn)量為指標(biāo)對(duì)樟芝的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化[3-5]，但是不同研究報(bào)道的樟芝發(fā)酵條件及產(chǎn)量性狀相差較大。發(fā)酵規(guī)模的不同、菌種和接種方法的差異以及發(fā)酵條件和發(fā)酵過(guò)程控制策略的差異等可能是造成不同研究結(jié)果差異明顯的主要原因。

絲狀真菌的發(fā)酵過(guò)程具有影響因素較多、高度非線性和復(fù)雜性等特征[6]。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) (ANN) 為研究非線性問(wèn)題提供了強(qiáng)有力的解決辦法。與回歸方程需要預(yù)先給定函數(shù)不同，ANN是以實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)經(jīng)過(guò)有限次的迭代計(jì)算而獲得的一個(gè)反映實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)內(nèi)在聯(lián)系的數(shù)學(xué)模型，具有極強(qiáng)的非線性處理能力。遺傳算法 (GA) 是借鑒生物界自然選擇和群體進(jìn)化機(jī)制形成一種全局尋優(yōu)算法，通過(guò) GA可以對(duì) ANN模型進(jìn)行全局性的訓(xùn)練，最終得到最佳方案。ANN-GA技術(shù)在故障診斷、生物行為模仿、廢水處理等多個(gè)行業(yè)都已有應(yīng)用報(bào)道[7]，但在絲狀藥食用真菌發(fā)酵研究領(lǐng)域尚未見應(yīng)用報(bào)道。

本研究以樟芝模式菌株 Antrodia camphorata ATCC 200183為研究對(duì)象，考察了樟芝孢子萌發(fā)生長(zhǎng)及菌球形成的過(guò)程。同時(shí)采用旋轉(zhuǎn)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) (RCCD) 考察了孢子濃度培養(yǎng)基組成對(duì)樟芝生物量的顯著影響。進(jìn)一步比較了ANN和響應(yīng)面法 (RSM) 對(duì)樟芝發(fā)酵過(guò)程的建模效果，并用 GA對(duì)ANN模型進(jìn)行結(jié)果尋優(yōu)，從而獲得最優(yōu)培養(yǎng)基組成。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

樟芝Antrodia camphorata ATCC 200183，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖濃度、蛋白胨濃度和黃豆粉濃度按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)值，MgSO41.5 g/L，KH2PO43.0 g/L，pH 4.5。

1.1.3 儀器

BX60型光學(xué)顯微鏡，日本 Olympus公司；冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Labconco公司；2135型組織切片機(jī)，德國(guó) Leica公司；DHZ-DA型恒溫?fù)u床，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 樟芝發(fā)酵方法

孢子接種物的制備：用接種鏟將樟芝菌絲體從PDA斜面上轉(zhuǎn)接入PDA平板，26 ℃培養(yǎng)21 d。取10 mL無(wú)菌發(fā)酵培養(yǎng)基將平板上的樟芝孢子洗下，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并稀釋后作為種子液用于發(fā)酵實(shí)驗(yàn)[8]。

發(fā)酵方法：500 mL三角搖瓶中裝100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后接入一定數(shù)量的樟芝孢子，100 r/min、26 ℃培養(yǎng)8 d。

1.2.2 生物量測(cè)定方法

發(fā)酵結(jié)束的樟芝發(fā)酵產(chǎn)物用 6層紗布過(guò)濾得到菌球，經(jīng)去離子水洗滌后進(jìn)行冷凍干燥，稱重并計(jì)算生物量。

1.2.3 形態(tài)觀察

發(fā)酵過(guò)程中，采用光學(xué)顯微鏡對(duì)發(fā)酵液中樟芝的不同形態(tài)進(jìn)行觀察。樟芝菌球內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察采用切片方法：菌球從發(fā)酵產(chǎn)物中分離后用4 ℃的生理鹽水進(jìn)行漂洗，取一定數(shù)量的樟芝菌球于10%甲醛溶液中固定 24 h后用乙醇進(jìn)行脫水并包埋于石蠟塊中。然后用組織切片機(jī)將其切成5 μm薄片，薄片采用H&E染料染色。H&E染色步驟如下：溶解蠟(二甲苯洗3次，每次3 min；無(wú)水乙醇洗3次，每次3 min；95%乙醇洗2次，每次3 min；70%乙醇洗2次，每次3 min)；Haematoxylin染色3 min；水洗10 min；Eosin染色1 min；70%乙醇洗1次，3 s；95%乙醇洗2次，每次3 s；無(wú)水乙醇洗2次，每次3 s; 二甲苯洗3次，每次3 s；蓋片、陰干后以光學(xué)顯微鏡觀察。

1.2.4 RCCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

前期單因素實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明碳源、氮源、碳氮比和孢子接種濃度是影響樟芝生物量的顯著因素。為了確定樟芝發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基組成，本實(shí)驗(yàn)選用四因素三水平的旋轉(zhuǎn)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表和實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

1.2.5 RSM模型的建立

采用Design Expert 7.1.0軟件對(duì)表1中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，并通過(guò)最小二乘法擬合二次多項(xiàng)方程，建立二次回歸模型[9]。該模型方程為：

其中Y為響應(yīng)值 (生物量)，β0、βi、βii和βij為方程系數(shù)，Xi和Xj為自變量編碼值。多項(xiàng)式模型方程擬合的精度和泛化能力由回歸系數(shù)R2表征。

1.2.6 ANN模型的建立

采用反向傳播 (BP) 方法建立ANN模型。模型中含有輸入層、隱含層和輸出層，以表 1中樟芝孢子濃度和發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖、蛋白胨、黃豆粉的濃度為輸入值，以發(fā)酵終止時(shí)樟芝生物量為輸出值。隱含層和輸出層的傳遞函數(shù)分別為 tansig函數(shù)和purelin函數(shù)，同時(shí)用trainbr算法訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò)，當(dāng)均方誤差 (MSE) 達(dá)到1×10?3時(shí)，網(wǎng)絡(luò)停止訓(xùn)練。

為了評(píng)價(jià)模型的擬合能力和預(yù)測(cè)能力，分別計(jì)算所建立模型的均方根誤差 (RMSE)、方差 (R2) 和預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)誤差 (SEP)[10]：

1.2.7 GA優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用浮點(diǎn)編碼的方式對(duì)發(fā)酵過(guò)程中孢子濃度、葡萄糖含量、蛋白胨含量和黃豆粉含量 4個(gè)因素在其各自取值范圍內(nèi)進(jìn)行ANN模擬推算，并以模型擬合值作為遺傳算法的適應(yīng)性函數(shù)，進(jìn)行選擇、變異、交換操作。樟芝生物量越高，則適應(yīng)度越高。程序通過(guò)MATLAB 7.6軟件和其附帶的GA遺傳算法工具箱編寫完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過(guò)程中樟芝形態(tài)的觀察

樟芝在搖瓶培養(yǎng)過(guò)程中的形態(tài)變化過(guò)程見圖1。圓柱狀的樟芝孢子 (2 μm×5~10 μm) (圖1A) 接入新鮮培養(yǎng)基后開始萌發(fā)并形成絲狀菌絲 (圖1B)，菌絲不斷生長(zhǎng)并相互纏繞形成蓬松的菌絲團(tuán) (圖1C)。菌絲團(tuán)進(jìn)一步形成菌球 (直徑0.5~2.0 mm) (圖1D)，隨后以菌球的形式在搖瓶中至發(fā)酵結(jié)束。通過(guò)切片觀察發(fā)現(xiàn)，菌球內(nèi)外兩層的菌絲密度不同，內(nèi)層的菌絲較外層疏松 (圖 1E)，這可能是由于菌球內(nèi)部傳質(zhì)、傳氧受限所致[11]。樟芝發(fā)酵過(guò)程中孢子、菌絲、菌絲團(tuán)、菌球的形態(tài)變化過(guò)程以及菌球內(nèi)部的不均勻性都說(shuō)明了樟芝發(fā)酵體系的復(fù)雜性，對(duì)其過(guò)程的建模需要采用RSM、ANN等非線性處理工具。

表1 RCCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表與實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Design matrix and results obtained in RCCD

圖1 發(fā)酵過(guò)程中樟芝的不同形態(tài)Fig. 1 Different morphological forms of Antrodia camphorata in submerged culture. (A) Spore. (B) Mycelia. (C) Mycelium regiment. (D) Pellets. (E) Section of Antrodia camphorata pellets.

表2 二次模型的方差分析結(jié)果Table 2 ANOVA of the fitted quadratic model

2.2 響應(yīng)面分析

利用Design-Expert軟件對(duì)表1中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，表 2為回歸分析結(jié)果?；貧w方差分析顯著性檢驗(yàn)表明，該模型回歸顯著 (R2= 0.915 6)，說(shuō)明回歸方程能夠用于表1中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合?！發(fā)ack of fit”值為0.000 4，說(shuō)明模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值不擬合的概率為顯著，因此二次模型可能難以充分描述樟芝的發(fā)酵過(guò)程?！癙rob＞F”值小于0.05說(shuō)明該項(xiàng)在95%的置信區(qū)間內(nèi)顯著。本研究中，X1、X2、X3、X4、X12、X14、X24、X34、X12、X22、X32、X42是顯著項(xiàng)，獲得回歸方程為：

Y=5.68–0.17X1+0.10X2+0.22X3+0.14X4+0.14X1X4+0.15X3X4–0.42X12–0.14X22–0.19X32–0.14X42。

2.3 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模

以表1中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作為BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練樣本，根據(jù)實(shí)驗(yàn)因素的個(gè)數(shù)和優(yōu)化指標(biāo)的個(gè)數(shù)設(shè)計(jì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果，然后用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行訓(xùn)練。為防止過(guò)擬合情況發(fā)生，在滿足訓(xùn)練精度的情況下，中間隱層節(jié)點(diǎn)數(shù)目盡可能少選，本實(shí)驗(yàn)選擇的隱含層節(jié)點(diǎn)數(shù)為 6。隱含層和輸出層的傳遞函數(shù)分別為tansig函數(shù)和purelin函數(shù)，同時(shí)用trainbr算法訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò)，當(dāng)均方誤差達(dá)到1×10?3時(shí)，網(wǎng)絡(luò)停止訓(xùn)練。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣本訓(xùn)練能較快地達(dá)到收斂(圖2)。模型模擬結(jié)果與實(shí)驗(yàn)值的擬合度較好 (圖3)，兩者之間的相對(duì)誤差在 5%以內(nèi)，說(shuō)明建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)性能良好，不需要再添加訓(xùn)練樣本。

2.4 RSM模型和ANN模型的比較

為了對(duì)建立的ANN模型和RSM模型進(jìn)行比較，分別計(jì)算兩種模型的RMSE、R2和SEP。結(jié)果表明ANN模型的 RMSE、R2和 SEP分別為 0.03、0.99和0.53%，而RSM模型的RMSE、R2和SEP分別為0.20、0.91和 4.06%。通常較高的RMSE和R2說(shuō)明模型對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合能力較好，而SEP越低則說(shuō)明模型具有越好的預(yù)測(cè)能力和外推能力。與RSM模型相比，本實(shí)驗(yàn)中ANN模型對(duì)樟芝發(fā)酵過(guò)程的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合的較好，并且具有更好的模型預(yù)測(cè)能力和外推能力。這可能是由于RSM模型建立的數(shù)學(xué)回歸模型屬于二次多項(xiàng)式，因此擬合能力有限，無(wú)法很好地反映樟芝發(fā)酵過(guò)程中各因素與指標(biāo)之間的高度非線性關(guān)系。而ANN模型不需要像回歸方程那樣要預(yù)先給定函數(shù)，而是以實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)經(jīng)過(guò)有限次的迭代計(jì)算而獲得的一個(gè)反映實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)內(nèi)在聯(lián)系的數(shù)學(xué)模型，具有極強(qiáng)的非線性處理能力。因此，本實(shí)驗(yàn)最終采用ANN模型作為GA優(yōu)化的適度值函數(shù)，用于求出各個(gè)因素的最佳組合。

2.5 遺傳算法優(yōu)化

遺傳算法是借鑒生物界自然選擇和群體進(jìn)化機(jī)制所形成的一種隨機(jī)搜索算法，它以其高效、自適應(yīng)及全局搜索的優(yōu)勢(shì)在很多領(lǐng)域中得到應(yīng)用。它的搜索面廣，尋優(yōu)速度快，得到的結(jié)果能以較大概率接近全局最優(yōu)解[12]。因此，通過(guò)遺傳算法可以對(duì)ANN模型進(jìn)行全局性的訓(xùn)練，最終得到最佳方案。本實(shí)驗(yàn)中，遺傳算法尋優(yōu)過(guò)程見圖4。經(jīng)過(guò)61次優(yōu)化計(jì)算，遺傳算法得到的樟芝生物量理論最大值為：6.2 g/L，并獲得發(fā)酵最佳接種量及培養(yǎng)基組成：孢子濃度1.76×105個(gè)/mL，葡萄糖29.1 g/L，蛋白胨9.4 g/L，黃豆粉2.8 g/L。在該培養(yǎng)條件下，經(jīng)過(guò)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到樟芝的生物量為 (6.1±0.2) g/L，說(shuō)明ANN-GA預(yù)測(cè)的培養(yǎng)基組成起到了較好的實(shí)驗(yàn)效果。

圖2 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練過(guò)程Fig. 2 Training course of BP neural network.

圖3 實(shí)驗(yàn)生物量和RSM、ANN模型預(yù)測(cè)生物量的比較Fig. 3 Comparison of experimental biomass and predicted biomass by RSM and ANN.

圖4 遺傳算法中最優(yōu)適度值和平均適度值的變化過(guò)程Fig. 4 Evolution of the best and mean fitness in the GA.

3 結(jié)論

樟芝在生長(zhǎng)過(guò)程中形態(tài)變化的多樣性說(shuō)明其發(fā)酵過(guò)程的復(fù)雜性和非線性。在本文所研究的體系中，成功應(yīng)用ANN-GA方法描述了樟芝發(fā)酵培養(yǎng)基與生物量的關(guān)系，并由此模型預(yù)測(cè)了最佳生物量及培養(yǎng)基配方。ANN-GA方法不僅能有效地提高生物量，顯著地降低培養(yǎng)基成本，而且可大大減少繁瑣的實(shí)驗(yàn)工作量及縮短研究周期，這也為優(yōu)化其他絲狀真菌等的復(fù)雜非線性發(fā)酵過(guò)程提供了方法借鑒。

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