楊曉鵬，劉波，宋淼,2，鞏新，唱韶紅，薛奎晶,2，吳軍

1 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京 100071

2 沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，沈陽 110016

近年來，藥用蛋白市場的需求越來越大，在這些蛋白中糖蛋白占絕大多數(shù)，例如各種治療性抗體、細(xì)胞因子等。糖蛋白是糖基與蛋白共價(jià)相連構(gòu)成的結(jié)合蛋白，糖蛋白的糖基與蛋白的功能、穩(wěn)定性均有著密切的聯(lián)系[1]。糖蛋白根據(jù)糖基和蛋白質(zhì)的連接方式不同，可分為2大類，即O-連接和N-連接糖蛋白。其中，對(duì)N-連接糖蛋白的糖基化修飾研究得比較透徹，其修飾序列極端保守，即在Asn-X-Thr/Ser (X為除Pro外的任意氨基酸) 的Asn殘基上。

目前重組糖蛋白藥物的生產(chǎn)主要是哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。但該系統(tǒng)培養(yǎng)成本高、生產(chǎn)周期長[2]。因此，利用酵母細(xì)胞來替代哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白藥物已日益受到人們的重視。酵母表達(dá)系統(tǒng)具有原核細(xì)胞系統(tǒng)生長速度快、便于基因操作和可工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又具有真核細(xì)胞大部分的翻譯后加工修飾能力，因而廣泛用于各種蛋白的表達(dá)[3]。巴斯德畢赤酵母屬于甲基營養(yǎng)型酵母，是第2代酵母表達(dá)系統(tǒng)的代表，作為成熟的表達(dá)系統(tǒng)，它還具有表達(dá)量高、較穩(wěn)定、可分泌、易純化及成本低等優(yōu)點(diǎn)[4-7]，但目前主要應(yīng)用于非糖蛋白的生產(chǎn)，這是因?yàn)楫?dāng)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)用于多數(shù)重組糖蛋白藥物的生產(chǎn)時(shí)，還存在一些問題，其中最關(guān)鍵的是畢赤酵母對(duì)糖蛋白的過度糖基化修飾，即形成不同于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的雜合型或復(fù)雜型糖基結(jié)構(gòu)，而是高甘露糖型糖基或過度糖基化結(jié)構(gòu)[8-9]，這種高甘露糖型糖基結(jié)構(gòu)的糖蛋白在人體中容易被清除、半衰期較短、且易產(chǎn)生較高的免疫原性；同時(shí)對(duì)某些蛋白過度的糖基化修飾也會(huì)造成產(chǎn)物的分子量不均一，或者一些活性位點(diǎn)的遮蔽[10]，影響其功能和活性。這些都限制了畢赤酵母在糖蛋白類藥物生產(chǎn)方面的應(yīng)用。

酵母和哺乳動(dòng)物N-糖基化修飾途徑在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的起始步驟都是相同的，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，在寡糖轉(zhuǎn)移酶作用下，Glc3Man9GlcNAc2被連接到新生肽鏈的專一序列上，即Asn-X-Thr/Ser的Asn殘基上，隨后在葡萄糖苷酶Ⅰ、Ⅱ和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)甘露糖苷酶 I (MnsI)的作用下，蛋白的糖基最終被加工成 Man8GlcNAc2糖基，并轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體。在高爾基體內(nèi)，酵母和哺乳動(dòng)物糖基修飾過程明顯不同，在酵母高爾基體中，由于存在一個(gè)關(guān)鍵起始酶 α-1,6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶(Och1p)，Man8GlcNAc2糖基在它的作用下接受第一個(gè) α-1,6-甘露糖，形成 Man9GlcNAc2糖基，該糖基是 α-1,2、α-1,3甘露糖轉(zhuǎn)移酶及一些磷酸甘露糖轉(zhuǎn)移酶的底物，在這些甘露糖轉(zhuǎn)移酶的作用下，蛋白的糖基可以被加至數(shù)十至上百個(gè)甘露糖，形成高甘露糖，發(fā)生過度糖基化修飾[10]；而在哺乳動(dòng)物高爾基體內(nèi)，蛋白的糖基在 α-1,2甘露糖苷酶 I (MDSI)的作用下，Man8GlcNAc2糖基會(huì)被剪切去除 3個(gè)α-1,2連接的甘露糖，而形成Man5GlcNAc2糖基，這一糖基是哺乳動(dòng)物細(xì)胞合成雜合型和復(fù)雜型糖基的前體，也是哺乳動(dòng)物表達(dá)的甘露糖型糖蛋白的主要糖型，如牛核糖核酸酶B (Ribonuclease B)。而這種糖基在酵母中并不存在，所以這一結(jié)構(gòu)也是酵母和哺乳動(dòng)物N-糖基化修飾過程的“分界線”。

我們前期已經(jīng)敲除了 Och1這一形成高甘露糖型糖基結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵酶基因，獲得了過度糖基化缺失的畢赤酵母菌株GJK01 (ura3、och1)[11]。本研究擬通過選擇不同物種來源MDSI及其定位信號(hào)，并實(shí)現(xiàn)其在GJK01 (ura3、och1) 中的融合表達(dá)，以獲得從酵母糖基向哺乳動(dòng)物糖基改造的第一個(gè)關(guān)鍵糖型，即Man5GlcNAc2結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株

α-1,6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶 (Och1p) 基因缺陷的畢赤酵母 GJK01 (ura3、och1) 菌株由本室構(gòu)建。HSA/GM-CSF表達(dá)載體 pHIL-D2/HSA/GM-CSF、PGE1203-URA3 均由本室構(gòu)建保存[11]。載體pPICZαA、pIB2、畢赤酵母GS115均購自Invitrogen公司。HepG2細(xì)胞由本室保存。

1.1.2 試劑和儀器

培養(yǎng)基和試劑：酵母抽提物、蛋白胨均為Oxoid公司產(chǎn)品；無氨基酸酵母氮源 (Yeast nitrogen base without amino acids，YNB) 為Difco公司產(chǎn)品；所用限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶和去磷酸化酶(CIAP) 均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；牛核糖核酸酶B (RNase B)、氫化硼氰化鈉 (NaBH3CN) 均為Sigma產(chǎn)品；Sephadex-G10 柱色譜填料 (AB)；DNA 3100 測序儀 (ABI)；8-氨基芘基-1,3,6-三磺酸(8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate，APTS) (Molecular probes)；碳黑柱 (Alltech associates)。

1.2 α-1,2-甘露糖苷酶 (MDSI) 表達(dá)載體的構(gòu)建

1.2.1 PGE-URA3-GAP1載體構(gòu)建

GAP啟動(dòng)子基因的獲取：以pGAP01和pGAP02為引物，以畢赤酵母表達(dá)載體pIB2為模板，PCR擴(kuò)增500 bp GAP啟動(dòng)子基因片段；CY CTT終止子基因的獲?。阂詐CYCTT01和pCYCTT02為引物，以畢赤酵母表達(dá)載體 pPICZαA為模板，PCR擴(kuò)增300 bp的CYCTT終止子基因片段；然后通過引物pGAP01和pCYCTT02，利用PCR方法融合GAP和CYCTT，獲得GAP表達(dá)盒，片段大小約800 bp。利用Kpn Ⅰ/XbaⅠ酶切該片段，并與經(jīng)過同樣酶切的pGE1203-URA3進(jìn)行連接，獲得含GAP表達(dá)盒的載體 pGEURA3-GAP。利用一對(duì)互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸引物1203MSC5、1203MSC3，退火形成雙鏈，構(gòu)建至pGEURA3-GAP載體中，獲得含有多克隆位點(diǎn)Ssp I-Sse838 I-Swa I的載體，命名為 pGEURA3-GAP1載體。

1.2.2 載體PGE-URA3-GAP1-signal-MDSI的構(gòu)建

定位信號(hào)的克?。阂葬劸平湍富蚪M為模板，以pMnsI5、pMnsI3為引物，PCR擴(kuò)增90 bp的MnsI定位信號(hào)，以pSCsec12-5、pSCsec12-3為引物，PCR擴(kuò)增300 bp 的Sec12定位信號(hào)；以乳酸克魯維酵母基因組為模板，以pKLsec12-5、pKLsec12-3為引物，PCR擴(kuò)增300 bp的Sec12定位信號(hào)。將擴(kuò)增得到的3種定位信號(hào)基因片段分別用Sse8387Ⅰ/SspⅠ酶切，構(gòu)建至同樣酶切的pGE-URA3-GAP1載體中，獲得3種pGE-URA3-GAP1-signal載體。

MDSI基因的克?。簭娜说母伟┘?xì)胞HepG2中提取總RNA，以pHmdsi(Δ185)、pHMDSI3為引物，RT-PCR擴(kuò)增1 800 bp人源的編碼缺失N端185個(gè)氨基酸但包含完整C端催化區(qū)的MDSI基因片段，記為 HMDSI(Δ185)；從植物擬南芥葉片中提取總RNA，以 pATMDSI5(Δ48)、pATMDSI3為引物，RT-PCR擴(kuò)增1 700 bp擬南芥的編碼缺失N端48個(gè)氨基酸但包括完整C端催化區(qū)的MDSI基因片段，記為ATMDSI(Δ48)。利用Sse8387Ⅰ/SwaⅠ酶切位點(diǎn)將2種基因片段分別構(gòu)建至3種pGE-URA3-GAP1-signal載體中，獲得 6種載體 PGE-URA3-GAP1-signal-MDSI。

1.2.3 表達(dá)載體PGE-URA3-PNOI-GAP-signal-MDSI的構(gòu)建

為了實(shí)現(xiàn)MDSI表達(dá)載體在酵母基因組中的定點(diǎn)整合，本研究選取了磷酸甘露糖轉(zhuǎn)移酶PNO1基因開放讀碼框ORF上游同源序列作為整合位點(diǎn)。因此，以畢赤酵母GS115基因組為模板，以PNOI5-5、Pno為引物，PCR擴(kuò)增PNO1基因ORF上游序列，片段大小為1 000 bp左右，電泳回收，然后，再以回收產(chǎn)物與PNOI3-3為引物，以畢赤酵母GS115基因組為模板，PCR擴(kuò)增2 000 bp左右基因片段，電泳回收，回收產(chǎn)物利用 KpnⅠ/XbaⅠ酶切位點(diǎn)克隆至pGE-URA3-GAP載體中，獲得pGE-URA3-PNOI載體；NotⅠ酶切 6個(gè)基因載體 PGE-URA3-GAP-signal-MDSI，將獲得的帶有MDSI基因的表達(dá)盒克隆到限制性內(nèi)切酶 NotⅠ酶切并 CIAP去磷酸化的pGE-URA3-PNOI載體中，獲得表達(dá)載體 PGEURA3-PNOI-GAP1-signal-MDSI。

表1 α-1,2-甘露糖苷酶 (MDSI) 表達(dá)載體的構(gòu)建引物Table 1 Primer used for constructing α-1,2-mannosidase I (MDSI) expression plasmid

1.3 HSA/GM-CSF (His6-tag) 在過度糖基化缺陷菌GJK01 (ura3、och1) 中的表達(dá)及鑒定

制備GJK01 (ura3、och1) 的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，將 pHIL-D2/HSA/GM-CSF(His6-tag) 以限制性內(nèi)切酶NotⅠ線性化后電轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中，將電擊后的菌液涂布于含有尿嘧啶和精氨酸的 MD 培養(yǎng)基(YNB 1.34%，生物素4×10?5%，葡萄糖2%，瓊脂1.5%，精氨酸100 μg/mL，尿嘧啶 100 μg/mL) 上。5~8 d后，隨機(jī)挑取克隆接種到2 mL YPD培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)48 h后，以5%的接種量接種到BMGY培養(yǎng)基中，24 h后加入0.5%甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，每12 h補(bǔ)加1次甲醇，誘導(dǎo)72 h后離心取上清，上清用于融合蛋白的表達(dá)分析，篩選HSA/GM-CSF(His6-tag)在缺陷菌GJK01 (ura3、och1) 中的表達(dá)株。

1.4 MDSI在GJK01(ura3、och1、pHIL-D2/HSA/ GM-CSF(His6-tag) 中表達(dá)及鑒定

制備HSA/GM-CSF(His6-tag) 在GJK01 (ura3、och1) 中的表達(dá)株的感受態(tài)細(xì)胞，將 6種 PGEURA3-PNOI-GAP1-signal-MDSI分別以位于 PNOI基因 ORF上游手臂上的限制性內(nèi)切酶 BamHⅠ酶切，線性化后分別電轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中，將電擊后的菌液涂布于含有精氨酸的 MD培養(yǎng)基 (YNB 1.34%，生物素4×10?5%，葡萄糖2%，瓊脂1.5%，精氨酸 100 μg/mL) 上。5~8 d后，對(duì)長出的URA3+菌進(jìn)行基因組鑒定，鑒定引物為MDSI釣取引物。將鑒定得到的MDSI轉(zhuǎn)入的陽性菌接種到2 mL YPD培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)48 h后，以5%的接種量接種到BMGY培養(yǎng)基中，24 h后加入0.5%甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，每 12 h補(bǔ)加一次甲醇，誘導(dǎo)72 h后離心取上清，上清備用。

1.5 HSA/GM-CSF(His6-tag) 的純化

收集培養(yǎng)上清，利用鎳親和層析方法純化末端帶有6個(gè)His標(biāo)簽的報(bào)告蛋白HSA/GM-CSF。流動(dòng)相為20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，pH 7.5，洗脫液另含0.5 mol/L咪唑。在280 nm處紫外吸收峰值收集純化產(chǎn)物，10%的SDS-PAGE鑒定表達(dá)產(chǎn)物。

1.6 HSA/GM-CSF(His6-tag) 的糖基分析

1.6.1 HSA/GM-CSF(His6-tag) 糖基的釋放

蛋白在0.5% SDS和1% β-巰基乙醇變性緩沖液中100 ℃變性10 min，然后在含有50 mmol/L磷酸鈉 (pH 7.5)、1% NP-40、N-糖苷酶F (PNGase F)的溶液中37 ℃酶切16 h，使HSA/GM-CSF(His6-tag)釋放糖基。

1.6.2 HSA/GM-CSF(His6-tag)糖基的純化

用80%乙腈、0.1%三氟醋酸活化碳黑柱，20%乙腈、0.05%三氟醋酸洗脫，所得糖鏈真空冷凍抽干備用。

1.6.3 APTS標(biāo)記糖鏈

取糖鏈樣品，加0.02 mol/L的APTS溶液1 μL[溶于1.2 mol/L檸檬酸]，1 mol/L 的NaBH3CN溶液1 μL (溶于DMSO)?；靹?，封管，置37 ℃水浴反應(yīng)18 h。

1.6.4 APTS標(biāo)記糖鏈Sephadex G10純化

據(jù)文獻(xiàn)[12]報(bào)道該方法簡單，可除去約 90%的單體 APTS，同時(shí)能保留約 70%以上的標(biāo)記物復(fù)合物。樣品經(jīng)G10兩次純化后真空抽干。

1.6.5 3100 DNA測序儀分析APTS標(biāo)記糖鏈[17]

5 μL純水溶解G10純化且冷凍抽干的APTS標(biāo)記糖鏈。最終待測樣品中含1 μL樣品，8 μL去離子甲酰胺和1 μL ROX修飾內(nèi)標(biāo)混合物，其中ROX內(nèi)標(biāo)混合物是指由羅丹明修飾的6-、30-寡核苷酸 (由5′-TAC-3′重復(fù)序列組成，由 Invitrogen公司 PAGE純化得到)。上樣后利用標(biāo)準(zhǔn)的 36 cm 毛細(xì)管及POP-6膠 (ABI) 分離，并利用GeneScan 3.7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 HSA/GM-CSF(His6-tag) 在P. pastoris GJK01 (ura3、och1) 中表達(dá)

為了分析外源的MDSI在GJK01 (ura3、och1)中的活性，本研究以HSA/GM-CSF(His6-tag) 作為報(bào)告蛋白。為此，必須獲得HSA/GM-CSF(His6-tag) 在GJK01 (ura3、och1) 中的表達(dá)菌株。將表達(dá)質(zhì)粒pHIL-D2/HSA/GM-CSF(His6-tag) 轉(zhuǎn)入畢赤酵母GJK01 (ura3、och1) 后，隨機(jī)挑取克隆，接種至BMGY進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，取培養(yǎng)上清進(jìn)行SDS-PAGE分析，1、2、4、5、7號(hào)克隆在分子量接近97 kDa處出現(xiàn)一條蛋白條帶 (圖 1)，而非糖基化的HSA/GM-CSF(His6-tag) 分子量為85 kDa，提示該條帶為糖基化的HSA/GM-CSF(His6-tag)。

圖1 HSA-GM/CSF(His6-tag) 在 P. pastoris GJK01 (ura3、och1) 中表達(dá)的SDS-PAGE圖譜Fig. 1 The SDS-PAGE for identification of HSA/GM-CSF expressed in P. pastoris GJK01 (ura3, och1). M: molecular weight marker; 1, 2, 4, 5, 7: positive transformants; 3, 6, 8, 9: negative transformants.

2.2 α-1,2-甘露糖苷酶 (MDSI) 表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化 GJK01 (ura3、och1、pHIL-D2/HSA/ GM-CSF(His6-tag) 基因組鑒定

構(gòu)建的 α-1,2-甘露糖苷酶 (MDSI) 表達(dá)載體(圖2)，包含PNOI基因ORF上下游各1 000 bp的同源臂、GAP啟動(dòng)子、目的基因及其定位信號(hào)、CYCTT終止子。其中，兩種不同來源的 MDSI基因：人源的編碼缺失N端185個(gè)氨基酸但包含完整C端催化區(qū)的 MDSI基因[HMDSI(Δ185)]和擬南芥的編碼缺失N端48個(gè)氨基酸但包含完整C端催化區(qū)的MDSI基因[ATMDSI(Δ48)]；3種不同的定位信號(hào)：釀酒酵母 MnsI (ScMnsI) 的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)、釀酒酵母Sec12 (Scsec12) 的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)以及乳酸克魯維酵母Sec12 (KLSec12) 的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)，分別組合，構(gòu)成6種表達(dá)載體 (表2)。

圖2 PGE-GAP-URA3-PNOI-signal-MDSI的構(gòu)建Fig. 2 Construction of the plasmid PGE-GAP-URA3-PNOI-signal-MDSI.

表2 MDSI表達(dá)載體Table 2 MDSI expression plasmid

定位信號(hào)擴(kuò)增的片段，瓊脂糖核酸電泳如圖3A所示，在90 bp左右、300 bp左右有特異的擴(kuò)增產(chǎn)物片段，分別與ScMnsI、Scsec12、KLSec12的定位信號(hào)大小一致；MDSI基因克隆的片段，瓊脂糖核酸電泳如圖3B、圖3C所示，在1 800 bp左右、1 700 bp左右有特異的擴(kuò)增片段，分別與 HMDSI (Δ185)、ATMDSI(Δ48)大小一致。最終獲得的表達(dá)載體PGE-URA3-PNOI-GAP1-signal-MDSI經(jīng)Not I酶切分析，發(fā)現(xiàn)有約2.5~3.0 kb的基因表達(dá)盒片段與理論值一致 (圖 4)。并且經(jīng)過測序分析顯示表達(dá)載體 PGE-URA3-PNOI-GAP1-signal-MDSI構(gòu)建成功。

將3種定位信號(hào) (ScMnsI的定位信號(hào)、Scsec12的定位信號(hào)、KLSec12的定位信號(hào)) 與 2種來源的MDSI (人源的及擬南芥來源) 表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化GJK01(ura3、och1、pHIL-D2/HSA/GM-CSF(His6-tag)菌，對(duì)轉(zhuǎn)化菌基因組進(jìn)行PCR鑒定，篩選MDSI基因整合到酵母染色體上的重組菌，1 800 bp左右的條帶與MDSI大小一致 (圖5)。

圖3 定位信號(hào)及MDSI基因PCR擴(kuò)增分析Fig. 3 PCR analysis of signal and MDSI. M: DL2000 DNA marker. (A) 1: ScmnsI; 2: Scsec12; 3: KLsec12. (B) HMDSI(Δ185). (C) ATMDSI(Δ48).

圖4 PGE-GAP-URA3-PNOI-signal-MDSI載體質(zhì)粒的Not I酶切圖譜Fig. 4 Characterization of PGE-GAP-URA3-PNOI-signal-MDSI digestion by Not I. M:15 kb DNA marker; 1: Scsec12-ATMDSI(Δ48); 2: KLsec12-ATMDSI(Δ48); 3: Scsec12-HMDSI(Δ185); 4: KLsec12-HMDSI(Δ185); 5: ScMnsI-ATMDSI (Δ48); 6: ScMnsI-HMDSI(Δ185).

圖5 MDSI轉(zhuǎn)化GJK01 (ura3、och1、pHIL-D2/HSA/ GM-CSF(His6-tag) 的PCR鑒定Fig. 5 PCR identification of MDSI transformed in GJK01(ura3, och1, pHIL-D2/HSA/GM-CSF(His6-tag). 1?4: GJK01(ura3, och1, pHIL-D2/HSA/GM-CSF(His6-tag) transformed with MDSI; 5: positive control; M: 2000 plus DNA marker.

2.3 HSA/GM-CSF(His6-tag) 糖鏈的制備與分析

利用PNGaseF酶對(duì)MDSI轉(zhuǎn)化GJK01/ (ura3、och1、pHIL-D2/HSA/GM-CSF(His6-tag)) 基因組鑒定正確的克隆中表達(dá)的報(bào)告蛋白 HSA/GM-CSF (His6-tag) 進(jìn)行酶切，利用 SDS-PGAE對(duì)酶切的報(bào)告蛋白分析，發(fā)現(xiàn)HSA/GM-CSF的糖基經(jīng)PNGaseF酶切后，分子量減小，說明其N-糖鏈被PNGaseF酶切除 (圖6)。

圖6 PNGaseF酶切報(bào)告蛋白 HSA/GM-CSF (His6-tag)的SDS-PAGE圖譜Fig. 6 The SDS-PAGE for characterization of HSA/GM-CSF digested by PNGaseF. 1, 3: HSA/GM-CSF expressed in GJK01 (ura3, och1, ScmnsI, ATMDSI, pHIL-D2/HSA/GM-CSF) digestion by PNGaseF; 2, 4: HSA/GM-CSF expressed in GJK01 (ura3, och1, ScmnsI, ATMDSI, pHIL-D2/HSA/GM-CSF); M: molecular weight marker.

PNGaseF酶切報(bào)告蛋白HSA/GM-CSF(His6-tag)后，樣品經(jīng)碳黑柱純化獲得糖鏈，APTS標(biāo)記糖鏈。由于單體 APTS的存在會(huì)影響糖鏈分析，所以再用Sephadex G10柱純化標(biāo)記糖鏈，以去除單體APTS。然后利用3100 DNA測序儀分析APTS標(biāo)記、純化的報(bào)告蛋白糖鏈，并利用GeneScan 3.7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，分析結(jié)果如圖7所示。

從圖 7A 中可以看出，α-1,6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶(Och1p)基因缺陷的畢赤酵母GJK01 (ura3、och1) 表達(dá)的報(bào)告蛋白 HSA/GM-CSF(His6-tag)的糖基是Man12GlcNAc2~Man16GlcNAc2高甘露糖型糖基，其中Man14GlcNAc2、Man15GlcNAc2占絕大部分。而將釀酒酵母 MnsI基因內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)與編碼擬南芥MDSI(Δ48)基因進(jìn)行融合，并將這一融合基因整合到GJK01基因組誘導(dǎo)表達(dá)后，糖基分析發(fā)現(xiàn)擬南芥MDSI能在酵母GJK01 (ura3、och1) 宿主菌中發(fā)揮了較好的生物活性，能夠?qū)⒔湍窯JK01中表達(dá)的報(bào)告蛋白的糖基Man12GlcNAc2~Man16GlcNAc2絕大部分剪切成 Man5GlcNAc2~Man9GlcNAc2結(jié)構(gòu) (圖7B)，這與哺乳動(dòng)物來源的牛核糖核酸酶 B的Man5GlcNAc2~Man9GlcNAc2甘露糖型糖基一致 (圖7C)。通過本研究，我們利用釀酒酵母MnsI內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)與外源擬南芥 MDSI(Δ48)基因的融合表達(dá)，在GJK01 (ura3、och1) 基礎(chǔ)上，構(gòu)建了具有合成Man5GlcNAc2哺乳動(dòng)物甘露糖型糖蛋白能力的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)。這為在酵母體內(nèi)合成類似于哺乳動(dòng)物雜合型或復(fù)雜型糖基奠定了基礎(chǔ)。

3 討論

酵母糖基工程改造是在酵母中模擬哺乳動(dòng)物的糖基修飾過程，即阻斷酵母形成高甘露糖型糖基，引入外源的參與糖基修飾的酶基因，并將其定位在適當(dāng)位置，使其發(fā)揮活性對(duì)糖基進(jìn)行修飾，從而獲得類似于哺乳動(dòng)物雜合型或復(fù)雜型糖基的過程。哺乳動(dòng)物中的糖苷酶或糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)糖基修飾是逐個(gè)順序完成的。Man5GlcNAc2是雜合型糖基修飾酶N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶 (GnTI) 的底物，在GnTI的作用下，Man5GlcNAc2上添加一個(gè)N-乙酰葡萄糖胺，形成 GlcNAcMan5GlcNAc2雜合型糖基。因而獲得Man5GlcNAc2糖基是酵母糖基化改造中的關(guān)鍵一步，沒有Man5GlcNAc2結(jié)構(gòu)，GnTI就很難發(fā)揮作用進(jìn)而會(huì)影響到后續(xù)酶的進(jìn)一步加工。酵母糖基工程改造是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)工程，這其中涉及到諸多因素。

圖7 DSA-FACE分析報(bào)告蛋白HSA/GM-CSF(His6-tag)的N-糖基結(jié)構(gòu)Fig. 7 Analysis of N-Glycan on HSA/GM-CSF(His6-tag) by DSA-FACE. (A) N-Glycan of GJK01(ura3, och1, pHIL-D2/HSA/GM-CSF(His6-tag)). (B) N-Glycan of GJK01(ura3, ochI, ScmnsI-ATmdsI pHIL-D2/HSA/GM-CSF(His6-tag)). (C) N-Glycan of RNaseB M5?M9: Man5GlcNAc2?Man9GlcNAc2; M12?M16: Man12GlcNAc2?Man16GlcNAc2.

例如要實(shí)現(xiàn)外源基因的高效表達(dá)，需解決以下3個(gè)方面的問題。第一，基因來源的選擇，作為異源表達(dá)必須考慮外源基因在酵母中的活性問題，即酵母內(nèi)環(huán)境、pH值、最適溫度等等。我們優(yōu)先選擇了哺乳動(dòng)物自身來源的基因以獲得哺乳動(dòng)物的糖基結(jié)構(gòu)，如本研究中的 MDSI基因。但由于人體溫度在37 ℃左右，與酵母生長溫度25 ℃~30 ℃存在差異，因此又選擇了植物來源的基因，其生存環(huán)境溫度范圍很廣，包含了酵母生長溫度。參與糖基化修飾的酶都是II型膜蛋白 (如MDSI)，II型膜蛋白的共同特點(diǎn)是，具有N端的氨基端細(xì)胞質(zhì)尾、穿膜錨定區(qū)、莖區(qū)以及C端的催化區(qū)[13]。本研究中我們保留了不同長度的莖區(qū)和完整的C端催化區(qū)。其次，外源基因的準(zhǔn)確定位問題。糖蛋白的糖基是蛋白經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，內(nèi)側(cè)、中間和外側(cè)高爾基體過程中逐個(gè)順序添加上去的，因此，模擬哺乳動(dòng)物的糖基修飾過程，將酶定位在準(zhǔn)確位置是必要的。為了將MDSI定位于糖基化修飾的初始環(huán)境中，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或內(nèi)側(cè)高爾基體，本研究選擇釀酒酵母MnsI、Sec12的定位信號(hào)和乳酸克魯維酵母Sec12的定位信號(hào)。第三，啟動(dòng)子問題，我們選擇了GAP啟動(dòng)子。一般用于畢赤酵母表達(dá)的醇氧化酶 (AOX) 啟動(dòng)子屬于強(qiáng)啟動(dòng)子，它需要甲醇誘導(dǎo)，存在一定的毒性隱患，不便于操作；GAP啟動(dòng)子不需要甲醇誘導(dǎo)，是一種中等強(qiáng)度的組成型啟動(dòng)子，是一種成熟的用于酵母表達(dá)的啟動(dòng)子，例如人殼多糖酶基因在GAP調(diào)控下連續(xù)表達(dá)超過1個(gè)月，表達(dá)量穩(wěn)定在300 mg/L[14]。同時(shí)，GAP啟動(dòng)子在AOX啟動(dòng)報(bào)告蛋白 (HSA/GM-CSF)之前，就啟動(dòng)MDSI基因的表達(dá)，使得MDSI能更好地修飾隨后表達(dá)的報(bào)告蛋白。

本室在構(gòu)建酵母缺陷菌時(shí)，利用了URA3作為營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記，URA3是一種常用的篩選標(biāo)記，可以用來進(jìn)行正負(fù)篩選。缺陷菌GJK01為URA3缺陷型[11]，本研究構(gòu)建的表達(dá)載體以URA3為篩選標(biāo)記，當(dāng)MDSI表達(dá)載體被轉(zhuǎn)入工程菌GJK01中時(shí)，在目的基因 MDSI被整合至基因組的同時(shí)，URA3也被整合至基因組，重組酵母菌可以在無尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長，得到URA3+MDSI菌株；進(jìn)一步可以利用5-氟乳清酸 (5-FOA) 使URA3+菌株發(fā)生第2次重組，即URA3基因重新被剔除出基因組，從而再次獲得URA3的缺陷菌株，該篩選標(biāo)記將運(yùn)用于下一次基因的敲除。如本實(shí)驗(yàn)前期利用URA3基因已經(jīng)成功敲除了畢赤酵母的 Och1p[11]和乳酸克魯維酵母的Och1p和Mnn1p (α-1,3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶)[15]。

HSA/GM-CSF(His6-tag) 是本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的HSA與GM-CSF的融合蛋白，GM-CSF即粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，由127個(gè)氨基酸組成，有2個(gè)N-糖基化位點(diǎn) (Asn27、Asn37)，天然的GM-CSF約有 34%的糖基化[16]。為了對(duì)糖基進(jìn)行有效分析，本研究采用了基于 DNA測序儀熒光輔助糖電泳(DNA sequencer assisted FACE，DSA-FACE)[14]的方法，現(xiàn)在用于糖基分析的方法大都是熒光輔助糖電泳 (FACE)、質(zhì)譜 (MS)、核磁共振 (NMR)，這些方法需要大量的樣品，而且很難做到高通量。DSA-FACE是借助于 DNA測序儀的一種新型的熒光毛細(xì)管電泳方法，在常規(guī)的FACE的基礎(chǔ)上建立起來的一種高靈敏度的糖分析方法。它用毛細(xì)管電泳代替了傳統(tǒng)的PAGE膠，用熒光檢測器代替了紫外燈下的熒光觀察，從而在分離能力、靈敏度上都有了很大提高。DSA-FACE方法借助DNA測序儀，如ABI 3100，可以實(shí)現(xiàn)了96個(gè)樣品的同步分析，因而可以滿足糖工程和糖組學(xué)高流通量篩選的要求。

REFERENCES

[1] Helenius A, Aebi M. Intracellular functions of N-linked glycans. Science, 2001, 291(5512): 2364?2369.

[2] Hamilton SR, Bobrowicz P, Brobrowicz B, et al. Production of complex human glycoproteins in yeast. Science, 2003, 301(5637): 1244?1246.

[3] Cregg JM, Cereghino JL, Shi JY, et al. Recombinant protein expression in Pichia pastoris. Mol Biotechnol, 2000, 16(1): 23?52.

[4] Hitzeman RA, Hagie FE, Levine HL, et al. Expression of a human gene for interferon in yeast. Nature, 1981, 293(5835): 717?722.

[5] OuYang LM, Zhang HZ, Zhang ST, et al. Advances in the studies of Pichia pastoris as a heterologous gene expression system. Prog Biochem Biophys, 2000, 27(2): 151?154.歐陽立明, 張惠展, 張嗣良, 等. 巴斯德畢赤酵母的基因表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2000, 27(2): 151?154.

[6] Peng Y, Yang XC, Kang LY. Factors affecting expression of heterologous protein in methylotrophic yeast. Biotechnol Inf, 2000, 4: 33?36.彭毅, 楊希才, 康良儀. 影響甲醇酵母中外源蛋白表達(dá)的因素. 生物技術(shù)通報(bào), 2000, 4: 33?36.

[7] Bretthauer RK, Castellino FJ. Glycosylation of Pichia pastoris-derived proteins. Biotechnol Appl Biochem, 1999, 30: 193?200.

[8] Hubbard SC, Ivatt RJ. Synthesis and processing of asparagine-linked oligosaccharides. Anna Rev Biochem, 1981, 50 (7): 555?583.

[9] Wildt S, Gerngross TU. The humanization of N-glycosylation pathways in yeast. Nature Microbiol, 2005, 3(2): 119?128.

[10] Walsh G. Biopharmaceutical benchmarks-2003. Nature Biotechnol, 2003, 21(8): 865?870.

[11] Wang Y, Liu B, Wu J, et al. A Pichia pastoris with α-1,6-mannosyltransferase deletion and its use in expression of HSA/GM-CSF Chimera. Chin J Biotech, 2007, 23(5): 907?914.王越, 劉波, 吳軍, 等. α-1,6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因敲除的畢赤酵母菌株構(gòu)建及其用于融合蛋白HSA/GM-CSF 表達(dá)的研究. 生物工程學(xué)報(bào), 2007, 23(5): 907?914.

[12] Laroy W, Contreras R, Callewaert N. Glycome mapping on DNA sequencing equipment. Nature Protocols, 2006, 1(1): 397?405.

[13] Paulson JC, Collcy KJ. Glycosyltransferases. Biological Chemistry, 1989, 264: 17615.

[14] Dorr R T. Clinical properties of yeast-derived versus Escherichia coil-derived granulocyte-macrophage colonytimulating factor. Clin Ther, 1993, 15(1): 19?29.

[15] Liu B, Gong X, Wu J, et al. Disruption of the OCHI and MNN1 genes decerease N-glycosylation on glycoprotein expressed in Kluyxeromyces lactis. J Biotechonol, 2009, 143(2): 95?102.

[16] Goodrick JC, Xu M, Finnegan R, et al. High-level expression and stabilization of recombinant human chitinase produced in a continuous constitutive Pichia pastoris expression system. Biotechnol Bioeng, 2001, 74(6): 492?497.

[17] Liu B, Song M, Wu J, et al. A Novel method for the Oligosaccharides from glycoproteins using DSA-FACE. Lett Biotechnol, 2008, 19(6): 885?888.劉波, 宋淼, 吳軍, 等. 一種利用DSA-FACE分析寡糖鏈的方法. 生物技術(shù)通訊, 2008, 19(6): 885?888.