陳要朋,劉鐵牛,黃 麗

（解放軍第303醫(yī)院 檢驗科,廣西 南寧 530021）

目前,在新兵體檢中各醫(yī)院都采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）做為HBsAg的檢測方法,但由于不同酶聯(lián)免疫吸附試驗的試劑存在不同的靈敏度差異,加之各種人為因素的影響,不同體檢單位對HBsAg弱陽性標(biāo)本發(fā)出不同的檢測報告,因而造成接送兵單位的矛盾以及人力物力的浪費,終極鑒定醫(yī)院,應(yīng)該采用什么樣的檢測方法對于弱陽性標(biāo)本進(jìn)到終極鑒定都值得我們研究和商確。

1 弱陽性反應(yīng)的概念

ELISA檢測HBsAg是一種定性檢測,其報告結(jié)果是以Cut off為界,大于Cutoff值的報為“陽性”,反之則為“陰性”。對于強反應(yīng)性和明顯陰性的標(biāo)本,檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性較好,但是在檢測過程中不可避免的會出現(xiàn)一些處于Cutoff值周圍的弱反應(yīng)性結(jié)果,即臨界結(jié)果。這部分結(jié)果常易出現(xiàn)低值弱陽性誤報為陰性的現(xiàn)象,或是處于Cutoff值以下附近的陰性結(jié)果誤報為陽性的現(xiàn)象,即假陰性和假陽性,造成實驗性誤（漏）診的發(fā)生,使不同的檢測單位甚至同一檢測單位內(nèi)結(jié)果不具有可比性,給接送兵單位的工作帶來極大的困難。因此找到理想解決方法是ELISA檢測HBsAg有待于解決的重要問題。

2 弱陽性反應(yīng)的臨床意義

2.1 近年來,臨床上ELISA檢測HBsAg呈弱反應(yīng)性的標(biāo)本日益增多,其原因可能是多方面的:①血清HBsAg含量呈低水平存在,低于所用方法的測定下限,如感染的“窗口期”、急性期后或恢復(fù)期、自限性感染末期的攜帶者等;②HBsAg隱匿在HBsAg/抗-HBs復(fù)合物中;③病毒整合后基因替代突變?nèi)笔Щ蛑嘏?④HBV變異株產(chǎn)生HBsAg缺陷,抗原免疫源性改變;⑤鉤狀效應(yīng)（hook effect）;⑥丙型肝炎病毒（HCV）與丁型肝炎病毒（HDV）重疊感染對HBV復(fù)制和（或）HBsAg的表達(dá)的抑制作用;⑦測定方法所用抗體對HBV不同基因型檢測敏感性的不同;⑧干擾因素:內(nèi)源性干擾因素如類風(fēng)濕因子、補體、異嗜性抗體、治療性抗體、溶菌酶等,外源性干擾因素如溶血、細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存時間過長、凝固不全等。另外,標(biāo)本及操作因素等多方面原因也會造成假陽性[1]。

2.2 HBsAg存在于HBV的外殼部分,是乙肝患者血清中首先出現(xiàn)的病毒標(biāo)志物,可用于乙肝的早期診斷和普查,在急性肝炎潛伏期即可出現(xiàn)陽性,也有利于肝移植后乙型肝炎復(fù)發(fā)的早期發(fā)現(xiàn)。但是在HBV感染人群中,有一部分血清HB-sAg呈低水平狀態(tài)存在,并且部分感染者存在病毒復(fù)制,此類標(biāo)本在進(jìn)行檢測時,因檢測方法靈敏度的差異,“灰區(qū)”設(shè)置的局限性,極易出現(xiàn)弱陽性或是假陰性的現(xiàn)象。因此,對以低水平存在的血液HBsAg進(jìn)行有效而準(zhǔn)確的檢測具有重要的臨床和流行病學(xué)意義。

2.3 有研究發(fā)現(xiàn),產(chǎn)生HBsAg弱陽性的現(xiàn)象可能是患者免疫功能受損后,機體與HBV或其應(yīng)答產(chǎn)物產(chǎn)生新的免疫平衡反應(yīng),一般情況下不具嚴(yán)重致病性,但部分滴度低的HB-sAg陽性者仍存在HBV復(fù)制,因此在機體免疫功能受損時可導(dǎo)致肝臟病情加重,甚至癌變。此外,輸血傳播乙肝病毒（HBV）的危險是輸血常見的不良反應(yīng)和并發(fā)癥。HBsAg為HBV感染的最主要檢測指標(biāo)和最直接證據(jù)之一,是采供血機構(gòu)篩查獻(xiàn)血者血液的必檢項目。一般ELISA試劑盒檢測靈敏度為1.0 ng/ml,而質(zhì)佳的試劑盒可達(dá)到0.1-0.5 ng/m l,而一般認(rèn)為0.1 ng/m l HBsAg即有傳染性,因此該標(biāo)準(zhǔn)用于血液篩查會造成部分低水平HBV感染者不能檢出,存在著潛在的經(jīng)輸血傳播HBV的風(fēng)險[2,3]。

2.4 HBsAg的檢測結(jié)果對于獻(xiàn)血、征兵、升學(xué)、就業(yè)、臨床診斷都具有重要意義,其結(jié)果的準(zhǔn)確性顯得尤為重要。對于體檢人群HBsAg的報告更應(yīng)謹(jǐn)慎,弱反應(yīng)標(biāo)本產(chǎn)生的假陽性結(jié)果造成的誤診,可能會影響體檢人群身心健康。因此,日常工作中要重視對弱反應(yīng)性標(biāo)本的結(jié)果報告解釋問題,建議被檢者進(jìn)行動態(tài)觀察檢測,并要進(jìn)行兩對半、抗HBc IgM、HBV DNA和肝功能檢測,結(jié)合臨床表現(xiàn),如反應(yīng)性有趨強或其他相關(guān)指標(biāo)也出現(xiàn)陽性反應(yīng),則可明確感染狀態(tài)[4]。

3 ELISA的實驗原理及干擾因素

ELISA檢測HBsAg的原理是以已知抗體（抗HBs）包被載體,然后將含有抗原的待檢標(biāo)本加入,共同孵育后,抗原結(jié)合于包被抗體上,再加入酶（常使用HRP）標(biāo)記特異抗體（酶標(biāo)抗HBs）,酶標(biāo)抗體連接到抗原上,最后加入底物溶液,根據(jù)顏色反應(yīng)來判定抗原含量。其優(yōu)點在于它操作簡單、適合于大批量標(biāo)本的測定,且成本低廉,靈敏度也很好。但其檢測時易受試劑、標(biāo)本、操作等諸多因素影響,因此,控制好實驗過程中的各個環(huán)節(jié),是保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的重要條件。

3.1 儀器和試劑

要保證實驗中用到的各種儀器設(shè)備處于良好的工作狀態(tài)。所用試劑須是正規(guī)廠家生產(chǎn)的具有批檢合格報告的試劑,且在試劑有效期內(nèi)使用。不同廠家生產(chǎn)的試劑存在較大差異,應(yīng)選擇特異性好,靈敏度高,且穩(wěn)定的檢測試劑盒。試劑盒拆封前應(yīng)檢查包裝是否完好,試劑是否齊全,是否有漏液等,檢測前置室溫條件下平衡30min,恢復(fù)至室溫方可拆封進(jìn)行檢測,避免溫度過低在微孔板底形成冷凝水影響檢驗結(jié)果。研究表明,平衡時間在30 min時間以內(nèi),灰區(qū)及陽性標(biāo)本的吸光度會隨著平衡時間的延長而增高[6]。

3.2 標(biāo)本的處理

使用新鮮血清標(biāo)本檢測,放置過久會被細(xì)菌污染,細(xì)菌分泌的酶可能對抗原抗體蛋白產(chǎn)生分解作用。菌體中可能含有內(nèi)源性HRP,造成非特異性干擾。此外,血清的質(zhì)量還受以下內(nèi)源性因素的影響:（1）類風(fēng)濕因子（RF）RF可與固相包被的抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合,從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。（2）補體固相包被抗體和酶標(biāo)記二抗在固相吸附及結(jié)合過程中,其Fc段的補體C1q結(jié)合點被暴露出來,成為一個中介物將二者交聯(lián),從而出現(xiàn)假陽性。此外補體可封閉抗體的抗原結(jié)合位點,從而引起假陰性結(jié)果。（3）異嗜性抗體異嗜性抗體（人類血清中含有抗嚙齒類動物Ig抗體）可通過交聯(lián)固相和酶標(biāo)抗體而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。（4）自身抗體自身抗體能與其相應(yīng)靶抗原結(jié)合形成復(fù)合物,從而干擾抗原的測定。標(biāo)本抽取后應(yīng)放置一段時間,待其充分凝集后,加大離心速度和時間,使紅細(xì)胞和纖維蛋白完全沉淀。血液未開始凝固或凝固不完全時就強行離心,血清中仍殘留部分纖維蛋白原,容易出現(xiàn)纖維蛋白結(jié)塊造成假陽性結(jié)果。標(biāo)本分離時應(yīng)避免溶血,因為血紅蛋白具有類似于過氧化物酶活性,導(dǎo)致非特異性顯色而出現(xiàn)假陽性結(jié)果[5]。

3.3 實驗操作

實驗過程應(yīng)嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行。加樣時使用一次性吸頭,避免交叉污染。所加物應(yīng)加在板孔底部,不可加在孔壁上部,不可濺出,不可產(chǎn)生氣泡,同時要保證加樣時間（從標(biāo)本加入后直到酶標(biāo)抗體加入的時間差）的一致性。嚴(yán)格控制好溫育的溫度和時間,由于酶標(biāo)板周圍與中間升降溫速率不同,易造成“邊緣效應(yīng)”,導(dǎo)致中央孔與周圍孔吸光度（A）有差異。因此溫育時盡可能采用水浴,將微孔板浮于水面上,以便使溫度迅速平衡,溫育時間相差不宜超過3min。同時應(yīng)貼上封膜,防止樣本和酶結(jié)合物蒸發(fā)而影響結(jié)果[6]。洗板應(yīng)充分且干凈,避免孔間交叉污染。加入顯色劑進(jìn)行顯色前,應(yīng)留意顯色劑是否本身已經(jīng)變色,加入終止液后應(yīng)在10min內(nèi)完成比色,防止時間過長顏色改變導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)。此外,每次試驗均應(yīng)設(shè)空白、陰陽性對照等內(nèi)對照,以評價檢測結(jié)果的有效性。

4 結(jié)果報告及處理建議

當(dāng)出現(xiàn)弱陽性結(jié)果時,因其吸光值接近Cut off值,測定時易發(fā)生錯誤,當(dāng)初次檢測結(jié)果為弱陽性時,不能貿(mào)然發(fā)出報告,應(yīng)根據(jù)本實驗室情況合理選擇復(fù)檢方法進(jìn)行復(fù)查。獻(xiàn)血員的篩檢應(yīng)偏重于臨界陰性血樣的復(fù)檢,復(fù)檢結(jié)果仍為臨界陰性的,應(yīng)告知采血機構(gòu)盡可能不用此類血源。體檢人員應(yīng)偏重于臨界陽性標(biāo)本的復(fù)檢,復(fù)檢結(jié)果仍為臨界陽性的,可報告“可疑”,并建議受檢者作進(jìn)一步的復(fù)查,改用靈敏度較高的免疫測定方法或定量的基因擴增方法,不要輕易地發(fā)陽性報告?；颊邚?fù)檢結(jié)果仍為臨界陰、陽性的,應(yīng)綜合分析其他標(biāo)志物的檢測結(jié)果,如非初診患者還可以查閱以往的檢測結(jié)果,了解臨床用藥等情況做出陰性、弱陽性、可疑報告;也可以與臨床醫(yī)生溝通,報告測定結(jié)果S/CO的比值,供臨床醫(yī)生參考[7],接兵醫(yī)生對此應(yīng)有全面的了解,終極鑒定醫(yī)院盡量統(tǒng)一鑒定試驗的方法學(xué),如出現(xiàn)弱陽性不同結(jié)果,盡量尊重第一家鑒定醫(yī)院的結(jié)果。

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