朱 翔 綜述 董 揚 審校

骨肉瘤分子邊界相關(guān)標(biāo)記物的研究進展

朱 翔 綜述 董 揚 審校

骨肉瘤邊界包含著豐富的腫瘤病變的特征信息，對疾病的分類、臨床治療方案設(shè)定、疾病預(yù)后具有重要意義。分子生物學(xué)和基因組學(xué)研究的不斷深入，為骨肉瘤的分子邊界研究提供了理論基礎(chǔ)，并且為檢測分子邊界相關(guān)標(biāo)志物提供了必要的技術(shù)手段，一些新的分子標(biāo)記物也隨之被提出并研究。本文就目前相關(guān)領(lǐng)域的骨肉瘤分子邊界相關(guān)標(biāo)記物進行綜述。

骨肉瘤 分子邊界 標(biāo)記物

骨肉瘤是最常見的骨原發(fā)性惡性腫瘤，好發(fā)于青少年，惡性程度高，預(yù)后差，是嚴(yán)重影響青壯年健康的惡性腫瘤。目前，保肢手術(shù)是治療骨肉瘤的最主要手段之一，而術(shù)后局部復(fù)發(fā)是手術(shù)治療失敗和影響疾病預(yù)后的重要原因。因此，手術(shù)切緣徹底與否成為影響預(yù)后的主要因素，如何獲得安全的手術(shù)切緣目前仍存在較大爭議。傳統(tǒng)方法判斷手術(shù)切除是否干凈主要基于對切緣組織的常規(guī)病理學(xué) （即細(xì)胞形態(tài)學(xué)）觀察，然而在病理學(xué)診斷為切緣陰性的患者中，仍有10%～30%出現(xiàn)了局部的復(fù)發(fā)[1]。常規(guī)病理學(xué)的局限性在于對形態(tài)上（或表型上）與正常細(xì)胞無可見差異的癌前細(xì)胞或具有潛在轉(zhuǎn)化能力的“正?！奔?xì)胞沒有區(qū)分能力；當(dāng)正常細(xì)胞中只有少量癌細(xì)胞或微癌灶只存在于切緣組織的某個區(qū)域時，極易造成漏檢。事實上，骨肉瘤在細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化之前，其分子水平及生化代謝水平已發(fā)生異常改變，出現(xiàn)功能異常的癌基因產(chǎn)物。分子生物學(xué)和基因組學(xué)研究的不斷深入，為骨肉瘤手術(shù)切緣的分子邊界研究提供了理論基礎(chǔ)，并且為探討分子邊界提供了必要的技術(shù)手段，一些新的分子標(biāo)記物也隨之被提出并研究?，F(xiàn)將與骨肉瘤手術(shù)切緣相關(guān)的一些分子標(biāo)記物及其研究現(xiàn)狀綜述如下。

1 p16基因

p16是一種新型抑癌基因，位于人類染色體9p16區(qū)，與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)密切相關(guān)，該蛋白是CDK4的抑制因子，通過與細(xì)胞周期蛋白D1以競爭方式結(jié)合CDK4，抑制CDK4的活性，使細(xì)胞停滯于G0期和G1期，抑制細(xì)胞分裂增殖。CDK4可調(diào)節(jié)多種底物的磷酸化，是G1/S期和G2/M期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵。體外研究證實，p16蛋白能特異地抑制CDK4的活性。細(xì)胞周期蛋白D表現(xiàn)為某種癌基因的作用，當(dāng)其過度表達(dá)時，細(xì)胞便會向癌細(xì)胞發(fā)展。細(xì)胞周期蛋白D同CDK4結(jié)合時，可刺激細(xì)胞生長分裂；p16與CDK4結(jié)合時，致使其磷酸化活性降低，引起Rb磷酸化而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。因此，p16既是細(xì)胞周期固有的調(diào)控者，又是抑制腫瘤生長的關(guān)鍵成分。

王海濤等[2]發(fā)現(xiàn)，骨軟骨瘤中 p16 mRNA的表達(dá)顯著高于骨肉瘤。這說明p16表達(dá)降低有可能使癌細(xì)胞獲得某種生長優(yōu)勢，預(yù)示這些患者預(yù)后不良。該研究同時檢測了骨肉瘤和肉瘤旁組織PTEN、p16、Rhoc等表達(dá)情況，分析癌瘤向周邊浸潤及周圍組織癌變趨向的規(guī)律。結(jié)果顯示，距原發(fā)病灶越遠(yuǎn)，PTEN、p16、Rhoc陽性的比例逐漸降低，癌旁發(fā)生高危病變的幾率降低（P<0.05）。李文輝等[3]的實驗發(fā)現(xiàn)，p16在骨肉瘤組織中陽性率為36.67%，認(rèn)為p16基因的缺失可導(dǎo)致p16蛋白定量、定位或結(jié)構(gòu)的改變，造成p16蛋白功能異常，從而導(dǎo)致抑癌功能失活。

2 Survivin基因

Survivin基因是新近分離鑒定的凋亡抑制蛋白（Inhibitorof apop tosis，IAP），在人類大多數(shù)腫瘤組織中高表達(dá)，而在正常成人組織中不表達(dá)，因其具有獨特的結(jié)構(gòu)和分布而區(qū)別于其他凋亡抑制基因[4]。Survivin編碼產(chǎn)生含142個氨基酸的蛋白，能直接抑制 Caspase蛋白酶活性而抑制細(xì)胞凋亡。Survivin是細(xì)胞周期G2/M期的重要調(diào)節(jié)因子，與其他細(xì)胞周期G2/M期檢測點的調(diào)控基因具有協(xié)同作用，以保證細(xì)胞復(fù)制的忠實性[5]。其過量表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避細(xì)胞周期檢測點，從而使腫瘤細(xì)胞逃避凋亡，異常增殖，導(dǎo)致腫瘤的形成。

Survivin在絕大多數(shù)分化成熟的組織（除胎盤等）中不表達(dá)或低表達(dá)，而在胚胎組織以及大多數(shù)實體瘤組織中高表達(dá)。楊寶軍等[6]的實驗證明，Survivin表達(dá)于骨肉瘤細(xì)胞漿，少量可見細(xì)胞核表達(dá)，同時發(fā)現(xiàn)Survivin胞核表達(dá)在部分腫瘤中臨床意義高于細(xì)胞漿。Survivin在38例骨肉瘤標(biāo)本中陽性率分別為44.7%（17/38）和55.3%（21/38）。Survivin的表達(dá)與患者年齡、性別、骨肉瘤亞型無明顯關(guān)系，但與Enneking外科分期有關(guān)，Ⅰ～ⅡA期與ⅡB～Ⅲ期之間的腫瘤Survivin表達(dá)率差異明顯（P＜0.05）。眾所周知，Enneking外科分期越高，患者預(yù)后越差，生存期越短。根據(jù)上述研究提示，Survivin可作為判斷患者預(yù)后的指標(biāo)。

3 CRM1蛋白

CRM1蛋白是體內(nèi)一類重要的核輸出受體，CRM1蛋白參與細(xì)胞核-胞質(zhì)轉(zhuǎn)運，并在有絲分裂中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞有絲分裂過程中，CRM1能和RAN2GTPase酶協(xié)同作用，調(diào)節(jié)有絲分裂中諸多重要環(huán)節(jié)，提示CRM1蛋白很可能參與了惡性腫瘤的病因?qū)W進程[7]。何忠惠等[8]研究檢測并分析了57例CRM1蛋白在骨肉瘤瘤組織和正常組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)CRM1在骨肉瘤組織中的表達(dá)較正常組織中明顯升高，伴有CRM1蛋白高表達(dá)的患者預(yù)后較差。該研究同時發(fā)現(xiàn)，CRM1的高表達(dá)和血清內(nèi)ALP的升高密切相關(guān)。

4 CD44

CD44是一種細(xì)胞表面黏附分子，主要參與細(xì)胞和細(xì)胞、細(xì)胞和基質(zhì)之間的特異性黏附過程，與細(xì)胞的運動、腫瘤的發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。其基因按外顯子的表達(dá)方式不同可分為標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)型CD44s（Standard form）和變異型 CD44v（Variant isoform）。應(yīng)用基因分析手段檢測CD44基因在手術(shù)切緣處的變化情況，對于判斷術(shù)后效果、評估預(yù)后及確立手術(shù)切緣的分子邊界都具有重要的意義。

Femandez等[9]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織CD44s水平明顯高于腫瘤周邊黏膜組織，兩種組織的CD44s水平在高S期腫瘤中明顯高于低S期腫瘤。腫瘤組織CD44s水平和患者預(yù)后無關(guān)，然而腫瘤周邊非腫瘤黏膜的高CD44s水平和患者預(yù)后不良顯著相關(guān)。提示CD44可能在腫瘤生長中起一定作用，腫瘤周圍黏膜的CD44s水平可成為確立手術(shù)切緣分子邊界的標(biāo)志物之一，且在評估腫瘤患者預(yù)后中發(fā)揮重要作用。李成存等[10]發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織中 CD44的陽性表達(dá)率顯著高于骨軟骨瘤及正常骨組織；其表達(dá)與骨肉瘤臨床分期、腫瘤轉(zhuǎn)移及2年內(nèi)死亡有關(guān)，而與患者性別、年齡、腫瘤大小、病理分型、術(shù)前化療無關(guān)；CD44陽性表達(dá)者與陰性表達(dá)者的腫瘤轉(zhuǎn)移率有顯著性差異。

5 MTA1基因

腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（Metastasis associated 1，MTA1）是新近發(fā)現(xiàn)的一個腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，其表達(dá)與許多惡性腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)。MTA1促進惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機制可能與組蛋白去乙酰化轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有關(guān)。組蛋白末端乙?；苤泻徒M蛋白中的陽離子，從而降低DNA與乙酰化區(qū)域的結(jié)合，打開染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，促進轉(zhuǎn)錄；相反，組蛋白去乙酰化使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得緊密，抑制轉(zhuǎn)錄。

李新志等[11]通過應(yīng)用半定量RT-PCR檢測高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞株和低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞株中MTA1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞株中MTA1的表達(dá)水平明顯高于低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞株，有統(tǒng)計學(xué)意義，表明 MTA1基因表達(dá)水平與骨肉瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)。為了進一步證明MTA1促進骨肉瘤轉(zhuǎn)移的作用，該研究還通過真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MTA1基因到低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞株，使之能穩(wěn)定表達(dá)MTA1，可以檢測到低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞株在轉(zhuǎn)染后侵襲能力顯著性增加。步國強等[12]用免疫組化技術(shù)證實MTA1蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞漿，與Moon等[13]的報道一致。該研究認(rèn)為MTA1的表達(dá)與患者的性別、年齡、發(fā)病部位、發(fā)病-就診時間及腫瘤的體積均無相關(guān)性。

6 端粒酶

端粒酶是一種核糖核蛋白體，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，它能以自身的RNA組分為模板合成端粒，以補償細(xì)胞分裂時染色體端粒的縮短，使得端粒的長度得以維持，從而逃避了因端?？s短而引起的細(xì)胞死亡，使細(xì)胞獲得“永生化”。正常人體細(xì)胞很少能檢測出端粒酶活性的表達(dá)，而100%的腫瘤細(xì)胞株及大多數(shù)腫瘤組織中的端粒酶活性卻有異常表達(dá)。端粒酶已被認(rèn)為是迄今為止最有特異性和敏感性的腫瘤標(biāo)志物和抗腫瘤治療的新靶點之一，因此檢測其活性和端粒的長度可用于估計癌變的潛能和趨勢、觀察療效及預(yù)后。

葉哲偉等[14]用原位分子雜交檢測骨肉瘤組織中各種細(xì)胞成分端粒酶hTERT的表達(dá)，結(jié)果顯示，端粒酶hTERT基因在骨質(zhì)增生骨組織、異位骨化組織和正常骨組織中的表達(dá)均為陰性。而52例骨肉瘤中，43例（82.17%）有端粒酶hTERT基因表達(dá)；在分布上，端粒酶hTERT陽性表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的分布定位一致，hTERT均位于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)中，這與hTERT的生化特征和功能是一致的。一方面說明原位分子雜交對于骨肉瘤細(xì)胞水平檢測端粒酶hTERT基因的定位診斷具有重要意義，另一方面說明在骨肉瘤的發(fā)展和維持中端粒酶可能起到重要的作用。

7 Rb2/p130基因

Rb2/p130基因是在1993年被發(fā)現(xiàn)并克隆成功的一個抑癌基因，屬Rb基因家族，它所表達(dá)的蛋白質(zhì) Rb2/p130通過維持細(xì)胞周期G0期細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄靜止來促進細(xì)胞的分化與成熟，從而抑制細(xì)胞的惡變。它在人體內(nèi)的各種正常組織中具有廣泛的表達(dá)。Rb2/p130基因發(fā)生異?；蛉笔c多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

李世德等[15]的實驗表明，骨肉瘤標(biāo)本中Rb2/p130基因有一定程度的表達(dá)，但明顯低于骨軟骨瘤與正常骨組織，并且Enneking臨床分期越低的骨肉瘤標(biāo)本中，Rb2/p130基因表達(dá)也越低，這些都說明了Rb2/p130基因作為抑癌基因在骨肉瘤中表達(dá)下降，從而失去維持G0期細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄靜止及其對細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控作用，使DNA合成增加，大量細(xì)胞進入S期，造成細(xì)胞異常增殖，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展。Rb2/p130表達(dá)下降也使其促進細(xì)胞分化功能下降，使分化低的骨肉瘤細(xì)胞增多，是骨肉瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲性強、預(yù)后不佳的重要原因之一，亦可作為骨肉瘤預(yù)后評價的參考指標(biāo)之一。

綜上所述，骨肉瘤保肢手術(shù)治療的原則是徹底切除原發(fā)病灶，獲得陰性切緣。如何確立一個真正安全的手術(shù)切緣，對患者的局部復(fù)發(fā)和預(yù)后均起到了關(guān)鍵作用。常規(guī)病理學(xué)檢測出的癌細(xì)胞陽性切緣與切緣中僅有分子生物學(xué)變化者不同，后者僅有基因改變而無形態(tài)學(xué)改變，可能處于腫瘤發(fā)生的早期階段，這有可能成為腫瘤復(fù)發(fā)的根源。對手術(shù)患者切緣進行分子生物學(xué)檢測，確定其手術(shù)切緣的分子邊界，可對患者進行及時的干預(yù)，以提高其生存率。因此，常規(guī)的病理學(xué)檢查結(jié)合分子生物學(xué)檢測可提高手術(shù)切緣診斷的敏感性，對預(yù)防患者術(shù)后復(fù)發(fā)和評估預(yù)后都具有重要的意義。從分子水平重新評價和確定骨肉瘤的手術(shù)切緣，亟待深入探究。

[1] Martone T,Gillio-Tos A,de Marco L,et al.Association between hypermethylated tumor and paired surgical margins in head and neck squamous cell carcinomas[J].Clin Cancer Res,2007,13(17): 5089-5094.

[2] 王海濤,王洪光.PTEN,P16,Rhoc基因表達(dá)與骨肉瘤的關(guān)系[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2009,5(6):18-19.

[3] 李文輝,趙炬才,皮國富.人骨肉瘤p16基因表達(dá)及臨床意義[J].實用診斷與治療雜志,2005,19(7):483-487.

[4] Trieb K,Lehner R,Stulnig T,et al.Survivin expression in human osteosarcoma is a marker for survival[J].Eur J Surg Oncol,2003, 29(4):379-382.

[5] Megliorino R,Shi FD,Peng XX,et al.Autoimmune response to anti-apoptotic protein survivin and its association with antibodies to p53 and c-myc in cancer detection[J].Cancer Detect Prev,2005, 29(3):241-248.

[6] 楊寶軍,王桂芝.Survivin和Livin在人骨肉瘤組織中的表達(dá)及臨床意義[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生,2009,47(24):26-27.

[7] Lo HW,Ali-Seyed M,Wu Y,et al.Nuclear-cytoplasmic transport of EGFR involves receptor endocytosis,importin b1 and CRM1 [J].J Cell Biochem,2006,98(6):1570-1583.

[8] 何忠惠,余文熙,林峰,等.骨肉瘤組織CRM1基因表達(dá)預(yù)后意義的分析[J].中華腫瘤防治雜志,2009,16(12):930-933.

[9] Fernández JC,Vizoso FJ,Corte MD,et al.CD44s expression in resectable colorectal carcinomas and surrounding mucosa[J].Cancer Invest,2004,22(6):878-885.

[10] 李成存,張棟,李敏.CD44V6,β-catenin在骨肉瘤中的表達(dá)及其臨床意義[J].腫瘤,2008(2):136-138.

[11] Yi C,Li X,Xu W,et al.Relationship between the expression of MTA-1 gene and the metastasis and invasion in human osteosarcoma [J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2005,25(4):445-447.

[12] 步國強,于秀淳.MTA1在化療后骨肉瘤中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系[J].中國矯形外科雜志,2009,17(3):221-223.

[13] Moon WS,Chang K,Tarnawski AS.Overexpression of metastatic tumor antigen 1 in hepatocellular carcinoma:relationship to vascular invasion and estrogen receptor-alpha[J].Hum Pathol,2004,35(4): 424-429.

[14] 葉哲偉,楊述華,邵佳,等.端粒酶hTERT在骨肉瘤組織中表達(dá)的意義[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2009,38(5):680-682.

[15] 李世德,張向敏,卓祥龍.Rb基因,Rb2/p130基因在骨肉瘤中的表達(dá)與相關(guān)性[J].腫瘤防治研究,2008,35(9):643-646.

Advancement on Markers of Molecular Margins in Osteosarcoma

ZHU Xiang,DONG Yang.

Department of Orthopaedics,Shanghai Sixth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200233,China.

【Summary】The margins of osteosarcoma contain large amount of information about tumor lesions.The information is important to classify the characteristics of tumors,determine therapeutic plan and forecast prognosis of patients.The deepenings of recent advances in molecular biology and genomics not only provide theories for the research of molecular margins in osteosarcoma but also furnish necessary technical means for testing Molecular Margins.Some new molecular markers have been proposed and studied.The new Markers of molecular margins in osteosarcoma will be reviewed in this article.

Osteosarcoma;Molecular margins;Markers

Q813.1+2

A

1673-0364（2011）04-0181-05

2011年4月3日；

2011年4月26日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.05.001

200233 上海市 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院骨科。