馬 進(jìn)，劉志高，鄭 鋼

（浙江農(nóng)林大學(xué) 園林學(xué)院，浙江 臨安 311300）

鹽脅迫是影響植物生長，降低作物產(chǎn)量的重要因素。溫室效應(yīng)引起全球氣候變暖，部分地區(qū)環(huán)境惡化引起土地沙漠化和鹽堿化，預(yù)計(jì)到2050年全球?qū)?huì)有超過50%的耕地被鹽堿化[1]。探索植物耐鹽機(jī)制，提高植物耐鹽性，開展耐鹽作物分子育種成為一種有效的應(yīng)對措施。隨著擬南芥Arabidopsis thaliana，水稻Oryza sativa，楊樹Populus trichocarpa和葡萄Vitis vinifera等植物全基因組序列測定的完成和基因組學(xué)研究的深入，植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究已成為后基因組時(shí)代的熱點(diǎn)之一[2]。差異蛋白質(zhì)組學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一種重要研究策略，著重于篩選和鑒定不同種類或狀態(tài)下各樣本之間蛋白質(zhì)組的區(qū)別與變化，具有很強(qiáng)的可實(shí)現(xiàn)性。植物耐鹽性是一個(gè)復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，不僅表現(xiàn)在基因轉(zhuǎn)錄水平上，更會(huì)體現(xiàn)在蛋白質(zhì)組水平變化上，由于鹽堿化自然災(zāi)害是未來農(nóng)林業(yè)面臨的重大難題，筆者討論了差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法及植物鹽響應(yīng)脅迫蛋白質(zhì)組研究情況，有助于理解植物耐鹽分子機(jī)制，對我們以后進(jìn)一步通過分子育種手段來提高植物的耐鹽性具有重要的意義。

1 差異蛋白質(zhì)組學(xué)

1.1 差異蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生背景

蛋白質(zhì)是生物體生命過程中三大結(jié)構(gòu)與功能分子之一，是執(zhí)行生命過程各種活動(dòng)的主要分子，生命中的許多過程都是由蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)和完成的。蛋白質(zhì)組學(xué)是了解基因型和表現(xiàn)型之間相關(guān)關(guān)系等復(fù)雜生物學(xué)問題的有效策略[3－4]，可以深入地揭示生命現(xiàn)象的本質(zhì)，從蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系與功能上回答生命過程的規(guī)律[5]。蛋白質(zhì)組與基因組相比，對蛋白質(zhì)的識(shí)別和鑒定的原則要復(fù)雜得多。隨著對蛋白質(zhì)組學(xué)的深入理解和具體工作的開展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到在短時(shí)間內(nèi)建立人類蛋白質(zhì)組學(xué) “完整的”數(shù)據(jù)庫和實(shí)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)資源共享是難以實(shí)現(xiàn)的或者說條件尚未成熟。于是蛋白質(zhì)組學(xué)研究著重于尋找和篩選任何因素引起的若干樣本之間的差異蛋白質(zhì)的表達(dá)，這樣差異蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)運(yùn)而生。

1.2 差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)

建立可靠的蛋白質(zhì)表達(dá)水平差異分析技術(shù)十分重要，是蛋白質(zhì)組分析的一個(gè)核心技術(shù)問題。差異蛋白質(zhì)組學(xué)的迅速發(fā)展主要得力于大規(guī)模高通量分離和分析技術(shù)的突破性發(fā)展。

1.2.1 基于凝膠的差異分析技術(shù) 凝膠雙向電泳技術(shù)（2DE）原理是將蛋白質(zhì)混合物分別經(jīng)第一向等電聚焦和第二向十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），根據(jù)等電點(diǎn)和分子量不同將各種蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺膠上分離開，樣品制備是凝膠雙向電泳技術(shù)的核心技術(shù)。目前，常用的制備低復(fù)雜度樣品的手段有去除高豐度蛋白、從蛋白復(fù)合物樣品中富集目的蛋白、分離細(xì)胞器蛋白和選擇合適pH值范圍的IPG（固相pH梯度）膠條等[6－7]。2DE技術(shù)是目前所有分離技術(shù)中分辨率最高，信息量最多的技術(shù)[8－9]，但對低豐度和疏水性蛋白質(zhì)的檢測有先天不足等缺陷[10－11]，而這些蛋白質(zhì)往往在生物學(xué)功能中發(fā)揮著重要的作用。該技術(shù)仍然有待改善。雙向差異凝膠電泳（2D-DIGE）被廣泛應(yīng)用于植物定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究。這種方法將待比較樣品分別用不同熒光試劑（cy2，cy3或cy5）標(biāo)記，等量混合后進(jìn)行雙向電泳分離。由于熒光染料靈敏度高，故所需樣品量非常少。而且，一張膠可同時(shí)分析3個(gè)樣品，省去了不同膠圖之間的匹配問題，減少了工作量，不僅重復(fù)性顯著提高，而且提高了分析通量[12]。該技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于受臭氧脅迫的歐洲山楊Populu stremula葉片蛋白質(zhì)組[13]、擬南芥突變體油菜素內(nèi)酯（BR）相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白[14]，以及蒺藜苜蓿Medicago truncatula多根瘤突變體、野生型根響應(yīng)生長素和苜蓿根瘤菌的蛋白質(zhì)組研究中[15]。

1.2.2 基于非凝膠的差異分析技術(shù) 多維液相色譜（MDLC）技術(shù)解決了2DE的很多難以解決的問題，但目前尚無法完全替代2DE，但能彌補(bǔ)2DE的一些缺陷，如蛋白質(zhì)在分離中的丟失、上樣量的限制、較窄的分離范圍等，對高、低豐度蛋白質(zhì)均能進(jìn)行有效分離而且自動(dòng)化程度較高，因此，它是對2DE技術(shù)的有益補(bǔ)充[16]。體外標(biāo)記技術(shù)主要包括同位素親和標(biāo)簽（ICAT）和同位素標(biāo)記相對和絕對定量（iTRAQ）技術(shù)。ICAT技術(shù)是利用一種新的化學(xué)試劑——同位素親和標(biāo)簽試劑，預(yù)先選擇性地標(biāo)記某一類蛋白質(zhì)，經(jīng)分離純化后，再用質(zhì)譜鑒定，這種技術(shù)能夠直接鑒定和測量低豐度蛋白質(zhì)。iTRAQ技術(shù)則是利用4種（最近已發(fā)展為8種）胺活性試劑組成的一組非多聚體的等質(zhì)量標(biāo)記試劑，對蛋白質(zhì)酶解的肽段進(jìn)行差異標(biāo)記，再將標(biāo)記的樣本混合，然后采用多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)（MudPIT）進(jìn)行分析鑒定。Patterson等[17]利用iTRAQ技術(shù)比較了抗硼和非抗硼大麥Hordeum vulgare的蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)抗硼大麥含鐵細(xì)胞中的離子缺乏敏感蛋白和甲基硫代核糖激酶的表達(dá)量明顯升高。15N體內(nèi)代謝標(biāo)記法采用含有15N（或14N）作為唯一氮源的培養(yǎng)基來培養(yǎng)植物組織（植株），依靠摻入合成蛋白質(zhì)的15N實(shí)現(xiàn)定量。該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于鎘脅迫的差異表達(dá)質(zhì)膜蛋白質(zhì)組分析中[18]。MudPIT是從待研究樣品中提取蛋白質(zhì)，將它們酶解成肽段混合物，直接上樣至多維液相色譜中進(jìn)行分離，然后進(jìn)入串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行解析。與普通的2-DE方法獨(dú)立互補(bǔ)，代表了當(dāng)前最豐富的蛋白質(zhì)分離鑒定技術(shù)[19－20]。

2 差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法在植物鹽響應(yīng)脅迫應(yīng)用

2.1 差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法在草本植物鹽響應(yīng)脅迫應(yīng)用

Ramani等[21]在水稻幼苗中檢測到35個(gè)受鹽脅迫誘導(dǎo)的和17個(gè)受其抑制的多肽。Kav等[22]研究了鹽脅迫下豌豆Pisum sativum根器官蛋白質(zhì)的變化。鹽脅迫設(shè)置2種，一種以正常生長2周的豌豆幼苗用75 mmol·L－1或 150 mmol·L－1氯化鈉溶液澆灌 6 周；另一種是種子在 75 mmol·L－1或 150 mmol·L－1氯化鈉溶液中發(fā)芽并生長1周。利用雙向電泳結(jié)合電噴霧四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（ESI-Q-TOF MS/MS）分析，在2種脅迫條件下共鑒定了35個(gè)受鹽脅迫調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。Abbasi等[22]研究了水稻葉鞘在鹽脅迫下的蛋白質(zhì)反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)54個(gè)蛋白表現(xiàn)出對鹽脅迫的上調(diào)和下調(diào)，8個(gè)蛋白表現(xiàn)出顯著的可重復(fù)的豐度變化。研究還發(fā)現(xiàn)7種蛋白在50 mmol·L－1氯化鈉處理24 h之后表達(dá)量達(dá)到最大，而在處理48 h之后開始下降。Yan等[23]用150 mmol·L－1氯化鈉在24，48，72 h內(nèi)處理3周苗齡的水稻幼苗，然后提取水稻根總蛋白，再用2DE分離根總蛋白，檢測到1100多個(gè)蛋白點(diǎn)，其中包括34個(gè)上調(diào)蛋白和20個(gè)下調(diào)蛋白。Parker等[24]分析處理時(shí)間長短不同的水稻葉片蛋白質(zhì)組發(fā)現(xiàn)在大約檢測到2500個(gè)的蛋白中有32個(gè)在鹽脅迫下發(fā)生明顯變化。對其中11個(gè)蛋白進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)包括1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）活化酶和鐵蛋白在內(nèi)的8個(gè)蛋白在24 h 50 mmol·L－1氯化鈉處理下表達(dá)量增加，并且在其后的6 d時(shí)間內(nèi)維持這種增強(qiáng)表達(dá)，只有一種被推測為磷酸甘油酸激酶的蛋白在24 h鹽脅迫下表達(dá)增加但在其后的時(shí)間內(nèi)沒有增加，也有一些蛋白在24 h處理的時(shí)候沒有表現(xiàn)豐度變化，但在處理7 d以后逐漸表現(xiàn)增強(qiáng)或減弱。Kong-ngern等[25]用Western blot分析了3個(gè)水稻栽培品種，抗鹽品種 ‘Pokkali’，中度耐鹽品種 ‘Leuang Anan’和鹽敏感品種 ‘KDML 105’幼苗的3 kD蛋白，結(jié)果表現(xiàn)出不同的表達(dá)特性。與對照相比，抗鹽的 ‘Pokkali’和 ‘Leuang Anan’葉鞘中31 kD被鹽逆境強(qiáng)烈誘導(dǎo)。與此相反，在鹽敏感品種 ‘KDML 105’中則保持不變。而且 ‘Leaung Anan’中31 kD蛋白的表達(dá)要高于 ‘Pokkali’。這些結(jié)果說明，31 kD蛋白是水稻葉鞘中的一個(gè)鹽誘導(dǎo)蛋白。

Ndimba等[26]用2DE電泳方法分離了擬南芥懸浮培養(yǎng)物的總蛋白，共檢測到2949個(gè)蛋白點(diǎn)。其中266個(gè)蛋白在鹽和滲透脅迫條件下表達(dá)豐度發(fā)生變化。用激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（LDI-TOF MS）技術(shù)鑒定了75個(gè)響應(yīng)鹽和滲透脅迫的蛋白。這些蛋白分成10個(gè)功能類型，包括轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)子三磷酸腺苷（ATP）酶、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)蛋白、解毒酶、氨基酸和嘌呤合成相關(guān)酶、蛋白降解酶、熱休克蛋白、碳水化合物代謝有關(guān)蛋白和生物功能未知蛋白。Lee等[27]應(yīng)用2DE結(jié)合蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)全面研究鹽脅迫過程中擬南芥發(fā)生的信號(hào)事件來分析鹽脅迫誘導(dǎo)的根細(xì)胞微體蛋白質(zhì)組表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)鈣離子（Ca2+）依賴膜結(jié)合蛋白和定向膜聯(lián)蛋白（designated annexins）是信號(hào)中的主要組分。Chinnusamy等[28]的研究表明對鹽脅迫下擬南芥的感知導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)的鈣信號(hào)激活鈣感受蛋白SOS3，SOS3又結(jié)合并激活ser/thr蛋白激酶SOS2，活化的蛋白激酶SOS2又調(diào)節(jié)了蛋白激酶SOS1（質(zhì)膜Na+/H+反向協(xié)同運(yùn)輸體）和NHX1（液泡膜Na+/H+反向協(xié)同運(yùn)輸體）的活性，維持了細(xì)胞內(nèi)離子的平衡。研究還發(fā)現(xiàn)滲透型組氨酸激酶（AtHK1-MAPK）可能參與了調(diào)節(jié)滲透的動(dòng)態(tài)平衡和活性氧。

Majoul等[29]在耐鹽小麥Triticum sestivum品種的幼苗中鑒定了1個(gè)26 kD受鹽脅迫影響的多肽?；舫棵舻萚30]首次采用雙向電泳的方法分析10 g·kg－1氯化鈉脅迫72 h的1對小麥耐鹽（RH8706249）及敏鹽突變體（H8706234）的蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)了5種葉綠體蛋白可能在鹽脅迫下對葉綠體及整個(gè)細(xì)胞的功能起到重要作用。Dani等[31]用煙草Nicotiana tabacum作為模型考察了鹽脅迫下可溶性蛋白的變化，其中積累增強(qiáng)的包括已知的受生物和非生物逆境脅迫誘導(dǎo)的蛋白，特別是2個(gè)幾丁質(zhì)酶和1個(gè)類發(fā)芽素蛋白顯著增加，2個(gè)脂類轉(zhuǎn)移蛋白則完全是體外表達(dá)。楊春雪等[32]以星星草Puccinellia tenuiflora為實(shí)驗(yàn)材料，對碳酸氫鈉與氯化鈉脅迫下星星草根蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜進(jìn)行了初步的比較與分析，表明大部分蛋白質(zhì)點(diǎn)在凝膠上的相對位置和豐度變化不明顯，有7個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)與氯化鈉脅迫相比為碳酸氫鈉脅迫特異誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，5個(gè)點(diǎn)在2種鹽脅迫下豐度均上調(diào)，但在碳酸氫鈉脅迫下上調(diào)更明顯。這些蛋白參與基因表達(dá)調(diào)控及能量代謝等過程。

2.2 差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法在木本植物鹽響應(yīng)脅迫應(yīng)用

紅海欖Rhizophora stylosa是一種典型的紅樹林鹽生植物。范吉星等[33]研究利用差異蛋白組學(xué)技術(shù)對淡栽（R0）和30 g·kg－1氯化鈉鹽栽（R3）處理后的紅海欖根部總蛋白進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明：在鹽水栽培上調(diào)的蛋白質(zhì)一般與逆境脅迫有關(guān)，淡水栽培上調(diào)的蛋白質(zhì)一般與基本代謝有關(guān)。這些研究結(jié)果為進(jìn)一步研究紅海欖的耐鹽機(jī)制提供了有意義的線索。在高鹽脅迫下葡萄芽尖中191種蛋白質(zhì)表達(dá)豐度發(fā)生變化，其中約44%為具有同工型的蛋白質(zhì)，且參與光合作用、蛋白質(zhì)合成和定位的蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度明顯下調(diào)[1]。

3 小結(jié)

差異蛋白質(zhì)組學(xué)主要通過尋找、篩選和鑒定由某些因素引起的樣本之間的差異蛋白質(zhì)譜，獲得對某些關(guān)鍵蛋白的定性和功能分析，從分子水平上解析更多的生命現(xiàn)象本質(zhì)，差異蛋白質(zhì)組學(xué)近年來正從定性向精確定量的方向發(fā)展。依靠差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究植物鹽響應(yīng)下蛋白質(zhì)組的區(qū)別與變化，取得了一些新的進(jìn)展，拓展了對于植物耐鹽分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，但仍不能令人滿意，同其他生物（動(dòng)物和微生物）蛋白組學(xué)研究相比，還處于相對落后狀態(tài)。植物響應(yīng)鹽脅迫代謝途徑中的離子運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和能量轉(zhuǎn)換等關(guān)鍵事件的分子機(jī)制仍不清楚。該研究領(lǐng)域目前仍存在以下突出問題：①仍然過多地依賴于2DE-MS技術(shù)，而第2代蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用較少。②研究對象仍主要集中在擬南芥、煙草、水稻、小麥等幾個(gè)有限的物種。③膜整合蛋白和表達(dá)豐度很低的逆境相關(guān)蛋白質(zhì)得不到有效分離。④差異表達(dá)蛋白質(zhì)表達(dá)豐度進(jìn)行分析時(shí)，缺乏嚴(yán)格和多樣化的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。⑤盡管許多植物種已有一定數(shù)目的表達(dá)序列標(biāo)簽（EST），有些甚至建立了一定規(guī)模的EST庫，但是還不能滿足蛋白組質(zhì)譜鑒定的要求。

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)方法的不斷創(chuàng)新與發(fā)展，差異蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，從基因組、蛋白質(zhì)組水平研究基因表達(dá)和蛋白質(zhì)表達(dá)特性，分離篩選耐鹽脅迫下特異表達(dá)的基因群和蛋白質(zhì)，分析特定基因群的轉(zhuǎn)錄至翻譯與耐鹽性之間的相關(guān)性，從分子水平系統(tǒng)詮釋植物耐鹽分子機(jī)制成為可能。

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