劉遠(yuǎn)平，張琳琳，張慧怡，趙丹，馬然，汪秋寬

(大連海洋大學(xué)遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116023）

海燕體壁膠原蛋白提取工藝的初步研究

劉遠(yuǎn)平，張琳琳，張慧怡，趙丹，馬然，汪秋寬

(大連海洋大學(xué)遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116023）

采用兩種不同的方法從海燕Asterina pectinifera體壁中提取出酸溶性膠原蛋白 (ASC）和胃蛋白酶促溶性膠原蛋白 (PSC）。結(jié)果表明:ASC的最佳反應(yīng)條件是，溫度為10℃，提取液種類為乙酸－乙酸鈉溶液，提取液濃度為0.5 mol/L，提取時(shí)間為72 h，ASC得率為7.93%;PSC的最佳反應(yīng)條件是，溫度為17℃、胃蛋白酶酶加量為4%、提取時(shí)間為96 h，PSC得率為49.61%。經(jīng)紫外光譜和氨基酸組成分析，結(jié)果表明，ASC和PSC均為典型的Ⅰ型膠原蛋白。

海燕;酸溶性膠原蛋白;酶促溶性膠原蛋白;提取工藝

膠原蛋白是動(dòng)物結(jié)締組織的主要成分，是動(dòng)物體內(nèi)含量最多、分布最廣的蛋白質(zhì)。膠原蛋白廣泛存在于動(dòng)物的皮膚、骨骼、牙齒、韌帶和血管中，起著支撐器官、保護(hù)機(jī)體的功能［1］。膠原蛋白現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、營養(yǎng)保健品、生物肥料以及醫(yī)用材料等領(lǐng)域［2］。牛、豬的皮和骨中的膠原蛋白一直作為工業(yè)用膠原蛋白的主要來源。近年來，由于哺乳動(dòng)物疫病的爆發(fā)和人畜共患病的增加，使其安全性受到了懷疑。世界各國都在積極尋找更安全的膠原蛋白來源，從水生動(dòng)物中提取安全、衛(wèi)生、無公害的膠原蛋白已成為各國研究的熱門課題。國內(nèi)外對(duì)魚類膠原蛋白的研究較深入［3－5］，關(guān)于無脊椎動(dòng)物如海蟄［6］、海參［7－9］、多棘海盤車［10］膠原蛋白的研究也有報(bào)道，但尚未見關(guān)于海燕膠原蛋白研究的報(bào)道。

海燕Asterina pectinifera俗稱海星，屬海星綱有棘目海燕科，常見于中國黃海、渤海一帶，是分布廣泛的海洋生物資源之一［11］。海燕的體壁較寬厚，韌性極強(qiáng)，含有豐富的膠原蛋白。本研究中，作者對(duì)海燕體壁膠原蛋白的提取工藝進(jìn)行了初步研究，旨在為其膠原蛋白的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

將新鮮海燕 (大連獐子島漁業(yè)集團(tuán)提供）去內(nèi)臟，沖洗干凈，冷凍備用。

胃蛋白酶購自Sigma公司，濃鹽酸、冰醋酸、乙酸鈉均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

主要儀器有:FD－4冷凍干燥機(jī)、FJ－300－S高速均質(zhì)機(jī)、GL－21M冷凍離心機(jī)、UV－754分光光度計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理 將海燕體壁破碎后浸泡于0.4 mol/L的鹽酸溶液中，攪拌，每日更換鹽酸一次，至海燕體壁變軟后用清水漂洗至pH為5.0。將漂洗后的海燕體壁浸泡于0.3 mol/L的NaOH溶液中，每隔2 h更換一次溶液，攪拌6 h，漂洗至pH為8.0，用高速均質(zhì)機(jī)勻漿，真空冷凍干燥。以上操作均在4℃以下進(jìn)行。

1.3.2 酸溶性膠原蛋白的提取 準(zhǔn)確稱取9份同等質(zhì)量經(jīng)預(yù)處理的海燕體壁，加入提取液進(jìn)行提取(w(海燕體壁）∶w(提取液）=1∶20），以提取液種類、反應(yīng)時(shí)間、提取液濃度和溫度為試驗(yàn)因素進(jìn)行酸解正交試驗(yàn)。提取完成后，將混合物以5 000 r/min離心30 min;向上清液中加入NaCl使終濃度達(dá)到2.5 mol/L，靜置24 h后以10 000 r/min離心30 min，將沉淀物透析脫鹽后冷凍干燥，即得酸溶性膠原蛋白 (ASC）。ASC正交試驗(yàn)因素和水平如表1所示。

表1 酸溶性膠原蛋白正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 The factor and level table in the orthogonal experiment of ASC

1.3.3 酶促溶性膠原蛋白的提取 準(zhǔn)確稱取9份同等質(zhì)量經(jīng)預(yù)處理的海燕體壁，用最佳酸溶性膠原蛋白提取工藝進(jìn)行提取。離心后分別向沉淀物中加入0.5 mol/L乙酸溶液 (w(沉淀物）∶w(乙酸）=1∶20）。以溶液反應(yīng)時(shí)間、溫度和酶加量為試驗(yàn)因素進(jìn)行酶解正交試驗(yàn)，試驗(yàn)操作方法同ASC操作，即得酶促溶性膠原蛋白 (PSC）。PSC正交試驗(yàn)因素和水平如表2所示。

表2 酶促溶性膠原蛋白正交試驗(yàn)因素水平表Tab.2 The factor and level table in the orthogonal experiment of PSC

1.3.4 膠原蛋白的純化 將ASC和PSC粗制品溶于0.5 mol/L乙酸溶液中，分別注入透析袋，于4℃下透析，每隔6 h換水1次，透析72 h。透析液以10 000 r/min離心20 min，冷凍干燥，獲得ASC和PSC制品。分別對(duì)ASC、PSC稱重并計(jì)算其提取率 (相對(duì)于預(yù)處理后的海燕體壁干重）。

1.3.5 產(chǎn)物分析

1）紫外 (UV）掃描分析 將純化后的樣品溶于0.5 mol/L的乙酸溶液中，在波長為200～400 nm下對(duì)其進(jìn)行紫外吸收測定。

2）氨基酸組成分析 取一定量膠原蛋白樣品，在減壓充氮條件下用6 mol/L HCl于110℃下水解24 h。采用日立835－50型氨基酸分析儀對(duì)樣品進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法的優(yōu)化

ASC提取的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見表3。極差分析結(jié)果表明:在ASC提取過程中，反應(yīng)條件對(duì)ASC提取率影響的因素主次順序?yàn)樘崛∫悍N類、提取液濃度、提取時(shí)間和提取溫度，最佳試驗(yàn)組合為A3B2C2D2，即制備 ASC的最佳提取條件是:溫度為10℃，提取液種類為乙酸－乙酸鈉溶液，提取液濃度為0.5 mol/L，提取時(shí)間為72 h。在此最佳試驗(yàn)組合條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，ASC的提取率為7.93%。

表3 ASC提取的L9(34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 The design and results of the orthogonal experiment of ASC

PSC提取的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見表4。極差分析結(jié)果表明:在PSC提取過程中，反應(yīng)條件對(duì)PSC提取率影響的因素主次順序?yàn)榉磻?yīng)溫度、酶加量、反應(yīng)時(shí)間，最佳試驗(yàn)組合為，即制備PSC的最佳提取條件為溫度17℃、蛋白酶酶加量4%、提取時(shí)間96 h。在此最佳試驗(yàn)組合條件下，PSC的提取率為49.61%。

表4 PSC提取的L9(34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 The design and results of the orthogonal experiment of PSC

2.2 紫外掃描分析

對(duì)所提取的ASC、PSC在波長為200～400 nm下進(jìn)行紫外光譜分析，結(jié)果見圖1。

圖1 ASC、PSC紫外吸收光譜Fig.1 UV spectra of ASC and PSC

由圖1可知，ASC、PSC的最大吸收波長均在230 nm處，符合Ⅰ型膠原蛋白所特有的吸收峰一般在230 nm左右的特性［12］，表明所提取的膠原蛋白為純度較高的Ⅰ型膠原蛋白。芳香族氨基酸的吸收峰一般在280 nm左右，而ASC在280 nm處存在一處小吸收峰，但PSC不存在。說明該ASC制品中含有少量芳香族氨基酸，而PSC制品中芳香族氨基酸含量較少［9］。

2.3 氨基酸的組成分析

對(duì)用最佳提取條件制備的ASC、PSC進(jìn)行氨基酸的組成分析，結(jié)果見表5。

絕大多數(shù)蛋白質(zhì)中脯氨酸含量很少，而膠原蛋白中脯氨酸和羥脯氨酸的含量是各種蛋白質(zhì)中最高的，可視為膠原蛋白的特征氨基酸［13］。從表5可見，ASC、PSC中甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸和脯氨酸的含量均比較高，其中甘氨酸分別占氨基酸總量的25.98%、26.88%，脯氨酸和羥脯氨酸含量之和分別占總量的18.78%、19.54%，符合Ⅰ型膠原蛋白中甘氨酸含量占氨基酸總量的30%左右、羥脯氨酸約占氨基酸總量的10%、羥脯氨酸與脯氨酸之比為0.7～0.8的組成特性［14］。

表5 ASC、PSC氨基酸的組成分析Tab.5 Amino acid composition of ASC and PSC

4 結(jié)論

本試驗(yàn)中，以海燕體壁為試驗(yàn)材料提取膠原蛋白，探討了制備工藝的具體條件，并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行了研究。通過正交試驗(yàn)對(duì)酸溶性膠原蛋白和胃蛋白酶促溶性膠原蛋白的提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，初步確定了ASC的最佳提取工藝為溫度10℃、乙酸－乙酸鈉溶液0.5 mol/L、提取液濃度0.5 mol/L、提取時(shí)間72 h;PSC的最佳提取工藝為溫度17℃、蛋白酶酶加量4%、提取時(shí)間96 h。經(jīng)紫外光譜和氨基酸組成分析，結(jié)果表明，ASC和PSC均為典型的Ⅰ型膠原蛋白。

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Extraction of collagen from body wall of star fish Asterina pectinifera

LIU Yuan-ping，ZHANG Lin-lin，ZHANG Hui-yi，ZHAO Dan，MA Ran，WANG Qiu-kuan
(The Key and Open Laboratory of Fishery Product Processing and Utilization of Liaoning Province，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

Acid－soluble collagen(ASC）and pepsin－solubilized collagen(PSC）were extracted from body wall of star fishAsterina pectiniferaby two different methods.The optimum extraction of ASC with the yield of 7.93%were found at hydrolyzing temperature of 10℃，hydrolyzing time of 72 h and the concentration of 0.5 mol/L acetic acid － sodium acetate.The optimum conditions for the extraction of PSC with yield of 49.61%were found as follows:hydrolyzing temperature of 17 ℃，hydrolyzing time of 96 h，and the pepsin dose of 4%.The UV spectra and Amino Acid Analysis revealed that ASC and PSC from body wall of the star fish were classified as type I collagen.

Asterina pectinifera;acid－soluble collagen;pepsin－solublized collagen;extraction

S986

A

2095－1388(2011）01－0054－04

2010－03－11

農(nóng)業(yè)部“948”項(xiàng)目 (2006－G44）

劉遠(yuǎn)平 (1984－），男，碩士。E－mail:yupylau@126.com

汪秋寬 (1962－），女，教授。E－mail:wqk320@dlou.edu.cn