顧連云,趙 萍

(南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院,江蘇南京,210029)

人細胞色素P450酶(Cytochrome P450)主要存在肝微粒體中,由3部分組成:血紅素蛋白,黃素蛋白和磷脂。約有30多個CYP450同工酶參與藥物的代謝,占主導地位的酶類有 4種:CYP2D6,CYP3A4,CYP1A2 和 CYP2C19。CYP2C19是CYP450超家族的一種同工酶,在藥物代謝中有重要作用,代謝降解40%～50%的藥物[1-3]。主要參與代謝的藥物有:質(zhì)子泵抑制劑、三環(huán)類抗抑郁藥、抗癲癇藥、抗精神病藥、降糖藥、抗凝藥、抗瘧疾藥以及一些抗癌藥物等[4-7]。

CYP2C19藥物代謝有個體差異,而個體差異主要受遺傳因素與環(huán)境因素的共同影響。約14.3%的中國人和3.5%的歐洲人CYP2C19酶的功能降低或缺失。因此CYP2C19酶的活性在人群中呈現(xiàn)二態(tài)分布,即弱代謝者和強代謝者。到目前為止,已發(fā)現(xiàn)CYP2C19 m1～CYP2C19 m7突變等位基因,影響該基因的正常表達,致使CYP2C19酶的功能降低甚至缺失。所有突變等位基因是CYP2C19遺傳多態(tài)性的分子生物學基礎。其遺傳多態(tài)性也存在種族差異,在中國漢族人群中,CYP2C19基因突變的類型主要是CYP2C19＊2和CYP2C19＊3兩型。CYP2C19＊1為野生型基因,有催化活性,其余突變型均無催化活性。CYP2C19＊2和CYP2C19＊3在亞洲發(fā)生的突變頻率較高,與藥物代謝個體差異有很大關聯(lián),是東方人慢代謝表型的主要遺傳突變類型,也是目前研究較深入的一類藥物代謝酶[8-9]。盡管CYP2C19占人肝微粒體CYP450的含量較小(0.8%～1.4%),但其酶缺陷在東方人中高達15%～23%,成為其酶代謝底物產(chǎn)生藥物效應個體差異和種族差異的主要原因,是藥物代謝酶分子遺傳藥理學研究領域中最為關注的靶目標之一。已有許多臨床研究認為CYP2C19基因多態(tài)性對其相關底物的藥動學和藥效學有一定影響,CYP2C19基因型可能是預計疾病恢復或愈合的決定因素[2,10]。因而CYP2C19基因多態(tài)性對于這些底物的治療優(yōu)化或個體化可能會非常有用。本研究旨在了解江蘇及其周邊地區(qū)漢族人群CYP2C19的基因多態(tài)性的分布情況,為進一步探討臨床中CYP2C19基因多態(tài)性與藥物敏感性的個體化用藥方案提供資料。

1 資料與方法

1.1 研究對象

江蘇省人民醫(yī)院體檢的無血緣關系的健康人,共 81例,均為漢族人,無慢性疾病史,經(jīng)過一般體檢、肝腎功能、血尿便常規(guī)、心電圖、胸片、乙型肝炎免疫指標檢查正常。入選者3月內(nèi)未參加任何臨床藥物試驗,試驗開始前1周內(nèi)未服用任何藥物,遵從臨床藥物試驗研究過程規(guī)定,簽署書面知情同意書。男42例,女39例,年齡(29.5±6.8)歲。

1.2 試劑和儀器

上海博彩PCR產(chǎn)物回收試劑盒,內(nèi)切酶BamH Ⅰ和SmaⅠ,西班牙瓊脂糖;離心機(Eppendorf 5415D,德國);凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)(JD801,江蘇省捷達科技發(fā)展有限公司)。脫氧核苷三磷酸(dNTP)、10×PCR反應緩沖液、Taq DNA聚合酶、鎂離子(日本 Toyobo公司);引物(上海生工生化公司);DNA分子量標記(Marker)、限制性內(nèi)切酶緩沖液(Loading Buffer,美國Promega公司);PCR儀(PTC-200,美國MJ Research公司);電泳儀(D IY210C,北京六一儀器廠)。

1.3 CYP2C19基因型分析

1.3.1 CYP2C19 DNA擴增:全血基因組DNA的提取及純度測定:采用 DNA提取試劑盒(Promega公司,美國)進行DNA抽提。PCR擴增:以研究對象外周血提取的基因組DNA為模板,設計以下引物為實驗引物序列:

PCR 反應 體 系 20 μ L, 水 14.5 μ L;10 ×Buffer 2 μ L;10 mmol/L dNTP 0.4 μ L;10 μ mol/L 的上 、下游引物各 1 μ L;DNA Taq polymerase 0.2 μ L;DNA 1 μ L。反應參數(shù)為:95 ℃ 預變性5 min,94℃變性30 s,50℃退火30 s,72℃延伸1 min,共30個循環(huán),最后72℃延伸5 min。擴增參數(shù)為:95℃預變性5 min,94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,共30個循環(huán),最后72℃延伸5 min。選取擴增特異性良好的PCR樣本進行PCR產(chǎn)物回收,分別用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和SmaⅠ進行酶切反應。3%瓊脂糖凝膠電泳,應用凝膠成像系統(tǒng)進行成像處理。典型PCR圖分別見圖1、2、3。

2 結(jié) 果

2.1 CYP2C19基因片段的酶切及受試者CYP2C19基因型的判定

CYP2C19 m1的等位基因擴增得到169 bp的片段,用限制性內(nèi)切酶SmaⅠ經(jīng)3 h酶切后,據(jù)酶切結(jié)果可判定關于CYP2C19 m1等位基因的CYP2C19基因型,CYP2C19 m2的等位基因擴增得到329 bp的片段,用限制性內(nèi)切酶BamHI經(jīng)3 h酶切后,據(jù)酶切結(jié)果可判定關于CYP2C19 m2等位基因的CYP2C19基因型,兩者結(jié)合的等位基因測定結(jié)果可判定受試者的 CYP2C19基因型。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物圖

圖2 CYP2C19ml基因結(jié)果圖

圖3 CYP2C 19m2基因結(jié)果圖

3.2 CYP2C19基因型分布狀況

81例樣本CYP2C19的基因型經(jīng)PCR-RFLP法檢測,統(tǒng)計結(jié)果見表1。分別針對CYP2C19＊2、＊3 2個等位基因突變點進行基因型分析,PMs有3種基因型(CYP2C19＊2/＊2,＊2/＊3或＊3/＊3),EMs有2種基因型,為純合子(＊1/＊1)和雜合子(＊1/＊2或＊1/＊3)。根據(jù)每個志愿者的2種基因變異結(jié)果,81名志愿者中純合子EMs組 31例,占38.3%;雜合子EMs組37例,占45.7%;PMs組 13例,弱代謝型所占比例約為16.0%。

表1 CYP2C19基因型及表型的統(tǒng)計結(jié)果

3 討 論

基因突變的多樣性決定了其表型的多樣性,等位基因的突變使酶活性降低,對藥物代謝的能力隨著等位基因的不同組合而呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性,表現(xiàn)出正常基因純合子、正常基因與突變基因雜合子、突變基因純合子或雜合子的變化趨勢。CYP2C19的基因多態(tài)性分布具有明顯的種族和地域差異。中國是一個幅員遼闊的多民族國家,在遺傳背景大致相似的基礎上又有各自的特色[1,8]。中國人群的 CYP2C19變異主要是CYP2C19＊2和CYP2C19＊3兩型,這 2種變異幾乎涵蓋了中國人所有的PM。由于CYP2C19＊3的存在,使PM在中國人中的發(fā)生率較高,達到15%～17%。本試驗中,作者對81例健康志愿者進行CYP2C19基因型的分析,PM的發(fā)生率是16.0%(13/81)。

CYP2C19基因多態(tài)性影響其相關底物的藥動學和藥效學,因而產(chǎn)生不同的藥物臨床療效[2],因此CYP2C19基因型的檢測是必要的,它可能是臨床優(yōu)化相關藥物治療作用的一種有用的工具,它可使臨床醫(yī)生決定藥物的選擇、治療劑量和療程,以及選擇最佳的聯(lián)合治療方案,對研究CYP2C19基因多態(tài)性與疾病、藥物療效、毒副作用的相關性有一定參考價值。從圖1可見,江蘇及周邊地區(qū)的弱代謝的比例低于蒙族人(33.3%)及海南黎族人(15%),高于獨龍族(11.2%),布依族(10.2%),苗族(9.2%),土族(9.0%),藏族(8.7%)和維吾爾族(4.17%)等[9-14]。說明CYP2C19的基因多態(tài)性分布是具有種族和地域差異的。

近年來基因?qū)騻€體化治療已在臨床應用,對指導臨床用藥極為重要。由于藥物反應存在個體差異,部分患者會導致治療失敗,部分患者甚至會因不良反應而死亡等。在美國約有0.32%的住院患者因藥物不良反應而死亡,在各類死亡原因中藥物不良反應死亡排名第4～6位[2]。基因?qū)騻€體化治療不僅可以預防上述情況發(fā)生,還可以幫助患者以最小的藥物劑量而獲取最佳的治療效果,真正體現(xiàn)出“因人用藥,量體裁衣”的原則。CYP2C19酶的活性還受許多藥物誘導或抑制酶的影響,如:巴比妥類、炔諾酮、利福平、潑尼松為誘導劑;西咪替丁、苯丙氨酯、氟西汀、帕羅西汀、氟伏沙明、吲哚美辛、酮康唑、奧美拉唑為抑制劑,它們之間也存在相互作用,對其療效的影響也應慎重考慮,因此在臨床聯(lián)合用藥時如何調(diào)整藥物劑量仍有待進一步研究[15-17]。

[1] 付良青,黃豐,吳德政,等.中國漢族人群不同性別細胞色素氧化酶CYP2C19基因多態(tài)性的比較[J].藥學學報,2004,39(3):161.

[2] 鄭露,邵建國.CYP2C19的基因多態(tài)性與臨床[J].第二軍醫(yī)大學學報,2007,28(11):1262.

[3] 張莉蓉,張偉,陰振坤,等.河南地區(qū)漢族人群藥物代謝酶和基因多態(tài)性分析(英文)[J].中國新藥與臨床雜志,2006,25(8):561.

[4] Sim S C,Risinger C,Dahl M L,et al.A common novel CYP2C19 gene variant causes ultrarapid drug metabolism relevant for the drug response to proton pump inhibitors and antidepressants[J].Clin Pharmacol Ther,2006,79:103.

[5] Kirchheiner J,Nickchen K,Bauer M,et al.Pharmacogenetics of antidepressants and antipsychotics:the contribution of allelic variations to the phenotype of drug response[J].Mol Psychiatr,2004,9:442.

[6] T akada K,Arefayene M,Desta Z,et al.Cytochrome P450 pharmacogenetics as a predictor of toxicity and clinical response to pulse cyclophosphamide in lupus nephritis[J].Arth Rheum,2004,50:2202.

[7] Li Y,Hou J,Jiang H,et al.Polymorphisms of CYP2C19 gene are associated with the efficacy of thalidomide based regimens in multiple myeloma[J].Haematol.2007;92:1246.

[8] 周健,呂虹,康熙雄.中國漢族人群不同性別、年齡、體重指數(shù)之間細胞色素氧化酶CYP2C19基因多態(tài)性的檢測[J].中國臨床藥理學與治療學,2007,12(2):208.

[9] 牛春燕,關麗,羅金燕.維吾爾族健康人群CYP2C19基因多態(tài)性分析[J].新疆醫(yī)科大學學報,2005,28(3):247.

[10] 胡詠梅,梅俏,許建明.安徽省漢族人群 CYP2C19基因多態(tài)性的調(diào)查研究[J].安徽醫(yī)藥,2007,11(8):717.

[11] 付良青,黃豐,吳德政,等.中國漢族和蒙族人群細胞色素氧化酶CYP2C19遺傳多態(tài)性的比較[J].中國臨床藥理學與治療學,2003,8(5):551.

[12] 葉峻杰,彭林,張松,等.中國獨龍族人群中基因多態(tài)性的分布[J].中國新藥雜志,2004,13(3):266.

[13] 付瓊瑤,李佩瓊,王九輝,等.海南黎族人群細胞色素P450 2C19基因多態(tài)性的研究[J].中國熱帶醫(yī)學,2005,5(9):1087.

[14] 周健,呂虹,康熙雄.中國漢族人群不同性別、年齡、體重指數(shù)之間細胞色素氧化酶CYP2C19基因多態(tài)性的檢測[J].中國臨床藥理學與治療學,2007,12(2):208.

[15] Klotz U.Clinical impact of CYP2C19 polymorphism on the action of proton pump inhibitors:a review of a special problem[J].Int J Clin Pharmacol Ther,2006,44:297.

[16] Yasui Furukori N,Takahata T,Nakagami T,et al.Different inhibitory effect of fluvoxamine on omeprazole metabolism between CYP2C19 genotypes[J].Brit J Clin Pharmaco,2004,57(4):487.

[17] Qiao H L,Hu Y R,Tian X,et al.Pharmacokinetics of three proton pump inhibitors in Chinese subjects in relation to the CYP2C19 genotype[J].Eur J Clin Pharmacol,2006,62:1.