孫洪巖,張愛梅,操樂杰,李 慶,徐修才

(安徽省合肥市安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院,安徽合肥,230001)

血管生成不僅為腫瘤生長(zhǎng)提供新陳代謝的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),也為腫瘤細(xì)胞的分化、轉(zhuǎn)移提供了潛在的路徑[1]。循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(CECs)在腫瘤血管新生和腫瘤生長(zhǎng)方面起著重要作用,它可以作為反映腫瘤血管生成及監(jiān)測(cè)抗血管治療藥物療效的標(biāo)記物[2-3]。本研究以 CD45-PC5、CD146-PE、CD106-FITC抗體為標(biāo)記,測(cè)得CD45-/dim CD146+為成熟的 CECs,CD45-/dim CD146+CD106+為活性CECs(aCECs),以了解非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者與健康人群外周血CECs和aCECs數(shù)量上的差異。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院呼吸科2009年9月～2010年7月期間收治的經(jīng)組織病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診的進(jìn)展期NSCLC患者 60例,常規(guī)行胸部CT、腦 MRI、骨掃描及腹部 B超檢查,以2009年版國(guó)際肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期。并滿足以下標(biāo)準(zhǔn):年齡>18歲;沒有缺血性心臟病、系統(tǒng)性脈管炎、肺動(dòng)脈高壓、感染性疾病、糖尿病、免疫性疾病、其他原發(fā)性腫瘤;自愿加入本實(shí)驗(yàn),并簽定書面知情同意書。60例肺癌患者(NSCLC 56例)中男40例,女20例,中位年齡64歲(31～81歲)。鱗癌23例,腺癌32例,鱗腺癌1例,小細(xì)胞肺癌 4例。NSCLC患者中Ⅰ、Ⅱ期4例,Ⅲ期15例,Ⅳ期37例。選取本院體檢中心健康人群30例為對(duì)照組,男 19例,女 11例,中位年齡47歲(23～68歲)。

1.2 儀器與試劑

科大創(chuàng)新公司生產(chǎn)KDC-6000R低速冷凍離心機(jī),美國(guó)Beckman-Coulter公司生產(chǎn)流式細(xì)胞儀(型號(hào)為 EPICS-XLⅡMCL;分析系統(tǒng)軟件為SystemⅡ)。淋巴細(xì)胞分離液(Cat:LTS1077)由天津?yàn)笊镉邢薰旧a(chǎn),CD45-PE-Cy5抗體(PN:IM2653U)由Beckman-Coulter公司生產(chǎn),CD146-PE抗體(Cat:550315)、CD106-FITC抗體(Cat:551146)均由美國(guó)BD Bioscience公司生產(chǎn),溶血?jiǎng)?.83%的氯化銨溶液,由本實(shí)驗(yàn)室用去離子蒸餾水自行配制。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本的采集:于治療前1 d抽取NSCLC患者1 mL靜脈血于血常規(guī)管中檢測(cè)血常規(guī)用,再取5 mL靜脈血于肝素鈉抗凝管中,4℃冰箱保存?zhèn)溆?2 h內(nèi)進(jìn)行標(biāo)本檢測(cè)。健康對(duì)照組標(biāo)本在本院體檢中心體檢時(shí)抽取。

1.3.2 標(biāo)本的處理:取7.5 mL淋巴細(xì)胞分離液于專用離心管中,將5 mL肝素鈉抗凝管中外周血用塑料吸管緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液面上;1 800 r/min離心15 min;棄去離心管上層血漿,取盡第2層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層約1.5 mL,加3倍PBS液;1 300 r/min離心5 min;棄上清液,留取下層細(xì)胞懸液 100～200 μ L 備測(cè);取50 μ L 備測(cè)細(xì)胞懸液到已加入 2 μ L CD45-PE-Cy5 、10 μ L CD146-PE、10 μ L CD106-FITC 的專用流式試管中,振蕩混勻,室溫避光孵育15 min;加入溶血?jiǎng)?00 μ L,振蕩混勻,室溫避光孵育 10 min;完全溶血后在15 min內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.3 標(biāo)本的檢測(cè):檢測(cè)前常規(guī)對(duì)流式細(xì)胞儀進(jìn)行光流路質(zhì)量調(diào)控和熒光補(bǔ)償,使儀器各項(xiàng)指標(biāo)在質(zhì)量控制允許值范圍。檢測(cè)時(shí)首先根據(jù)前向(FSC)和側(cè)向(SSC)散射光信號(hào)對(duì)單個(gè)核細(xì)胞群(包括淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞)進(jìn)行設(shè)門,以避免紅細(xì)胞、血小板、細(xì)胞碎片及中性粒細(xì)胞對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響,每份標(biāo)本獲取設(shè)門內(nèi)細(xì)胞在100000個(gè)以上,檢測(cè)后數(shù)據(jù)以Listmode文件形式保存。再以CD45(即CD45-/dim/+細(xì)胞群)設(shè)C門(占單個(gè)核細(xì)胞群的百分比為R1%),CD45-/dim CD146+的成熟CECs占門內(nèi)百分比為R2%,CD45-/dim CD146+CD106+aCECs占門內(nèi)百分比為R3%(圖1-3)。

1.3.4 CEC及aCECs的數(shù)量計(jì)算:根據(jù)同期患者的血常規(guī)檢查結(jié)果中淋巴細(xì)胞(L)及單核細(xì)胞(M)細(xì)胞數(shù),把流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果換算為每mL細(xì)胞數(shù)。CECs=(L+M)×R1%×R2%,aCECs=(L+M)×R1%×R3%。

圖1 CD45-/dim CD146+細(xì)胞流式圖

圖2 CD45-/dim CD106+細(xì)胞流式圖

圖3 CD45-/dim CD146+CD106+細(xì)胞流式圖

2 結(jié) 果

2.1 肺癌患者及健康對(duì)照組CECs、aCECs的數(shù)量

肺癌患者及健康對(duì)照組CECs、aCECs的檢測(cè)結(jié)果顯示。NSCLC與健康對(duì)照組比較,NSCLC患者CECs、aCECs的數(shù)量明顯高于健康人群,由于兩組樣本的CECs、aCECs總體方差不等(方差齊性檢驗(yàn) F=35.374、19.427,P<0.05),行校正 t檢驗(yàn),t′=8.437、6.113,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

NSCLC與小細(xì)胞肺癌CECs、aCECs的數(shù)量比較 ,t=-0.347、0.617,P=0.73 、0.54,NSCLC與小細(xì)胞肺癌CECs、aCECs的數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

在NSCLC中鱗癌與腺癌比較,t=-0.214、-0.282,P=0.831、0.779,鱗癌與腺癌患者CECs、aCECs的數(shù)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

NSCLC中 CECs、aCECs的數(shù)量Ⅰ、Ⅱ期,Ⅲ期,Ⅳ期比較,方差分析 F=2.626、2.211,P=0.082、0.12,總體上 3組不同分期 NSCLC患者CECs、aCECs的數(shù)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。兩兩比較Ⅰ、Ⅱ期與Ⅲ期,P=0.152、0.084,Ⅰ、Ⅱ期與Ⅳ期 P=0.782、0.388,Ⅲ期與Ⅳ期P=0.033、0.087。Ⅲ期CECs的數(shù)量明顯高于Ⅳ期(P<0.05),余各組之間 CECs、aCECs的數(shù)量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

表1 不同病理類型肺癌、不同臨床分期及健康對(duì)照組CECs/aCECs的比較(±s)

表1 不同病理類型肺癌、不同臨床分期及健康對(duì)照組CECs/aCECs的比較(±s)

與健康人群比較,＊＊P<0.01;與Ⅳ期比較,##P<0.01。

組別 n CECs/mL aCECs/mL非小細(xì)胞肺癌 56 2573±201.9＊＊ 784±91.4＊＊鱗癌 23 2539±180.6 755±65.3腺癌 32 2658±218.8 826±107.8小細(xì)胞肺癌 4 2958±376.8 500±31.4健康人群 30 273±21.0 35±6.1臨床分期 Ⅰ、Ⅱ 4 1953±42.0 276±18.4Ⅲ 15 3559±253.7## 1162±118.5##Ⅳ 37 2240±177.5 686±79.3

2.2 aCECs占CECs的比例

aCECs僅占CECs的一小部分。在NSCLC患者中aCECs占CECs的比例為29.9±17.3%,在健康對(duì)照組中占CECs的比例為8.4±13.6%。NSCLC患者aCECs的比例明顯高于健康人群,t=5.914,P<0.001,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4。

圖4 NSCLC與健康人群aCECs占CECs的百分比

2.3 CECs、aCECs的數(shù)量與NSCLC腫瘤大小之間的關(guān)系

CECs、aCECs的數(shù)量與NSCLC腫瘤大小之間的關(guān)聯(lián)性分析 r=0.086、0.03,t=0.637、0.217,P=0.527、0.829。相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 CECs、aCECs的數(shù)量與NSCLC血CEA之間的關(guān)系

CECs、aCECs的數(shù)量與NSCLC血CEA之間的關(guān)聯(lián)性分析 r=0.205、0.251。行 t檢驗(yàn),t=1.321、1.639,P=0.194、0.109。相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

CECs在促進(jìn)腫瘤血管生成過程中發(fā)揮重要作用,其數(shù)量可以反映腫瘤血管生成的的程度。在腫瘤患者中外周血CECs可以作為評(píng)估腫瘤的血管生成及抗血管生成治療療效的標(biāo)志物[2-4]。近期研究進(jìn)一步將CECs細(xì)化為休眠CECs(resting CECs)、活性 CECs(aCECs)及凋亡 CECs(apoptotic CECs),在CECs中大部分是rCECs、apoptotic CECs;僅少部分為aCECs,它可以反映腫瘤的新生血管生成的活力[5-7]。Wang等[8]認(rèn)為aCECs可以作為NSCLC患者預(yù)測(cè)抗血管生成療效、反應(yīng)預(yù)后的理想標(biāo)志物。

盡管CECs的表型特征及檢測(cè)技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化仍缺乏一致性,但普遍認(rèn)為[9]CECs表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物如CD31、CD146等,而不表達(dá)造血細(xì)胞(CD45)及內(nèi)皮祖細(xì)胞(CD133)標(biāo)志物,aCECs還表達(dá)CD106。不同研究分別以多種CD分子標(biāo)記物檢測(cè)出 CECs及 aCECs[5-6,9]。由于 CECs、aCECs在外周血中的數(shù)量較少,前期實(shí)驗(yàn)采用全血三標(biāo)的流式細(xì)胞儀檢測(cè)方法檢測(cè)了CECs的存在及其百分比結(jié)果,并試驗(yàn)性的檢測(cè)了aCECs的結(jié)果,僅極少數(shù)肺癌血標(biāo)本檢測(cè)出了aCECs的存在[10]。本實(shí)驗(yàn)以Duda等[11]用淋巴細(xì)胞分離液對(duì)標(biāo)本進(jìn)行富集處理(提取單個(gè)核細(xì)胞)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CECs的方法為基礎(chǔ),以目前被廣泛認(rèn)可的 CD45、CD146、CD106抗體為標(biāo)記,通過 CD45-來排除造血細(xì)胞及活化的 T淋巴細(xì)胞。測(cè)得CD45-/dim CD146+為成熟的 CECs,CD45-/dim CD146+CD106+為 aCECs。Strijbos等[12]認(rèn)為CECs與血小板之間存在抗原交叉現(xiàn)象,一些較大的血小板團(tuán)塊也表現(xiàn)為CD45-CD31++CD146+。因此本實(shí)驗(yàn)上機(jī)檢測(cè)在單個(gè)核細(xì)胞群設(shè)門,每份標(biāo)本獲取設(shè)門內(nèi)細(xì)胞要在100 000個(gè)以上,以避免紅細(xì)胞、血小板、細(xì)胞碎片、中性粒細(xì)胞及其他非特異反應(yīng)等多種因素影響檢測(cè)結(jié)果,便于CECs及aCECs的計(jì)數(shù)。在樣本處理過程中需注意樣本室溫長(zhǎng)時(shí)間存儲(chǔ)會(huì)影響CECs活性及表型,故在不能立即檢測(cè)樣本時(shí)應(yīng)將樣本處于4℃冰箱保存?zhèn)溆?在加入溶血?jiǎng)┩耆苎髴?yīng)在15 min內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè),溶血時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生過多的細(xì)胞碎片,干擾檢測(cè)結(jié)果。

在肺癌患者外周血中存在大量的活化T淋巴細(xì)胞(CD45+CD146+),前期實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)了上述現(xiàn)象[10]。因此單憑CD146+來測(cè)定CECs的方法存在很大的局限性和誤差,多種抗體標(biāo)記聯(lián)合應(yīng)用可以明顯提高CECs檢測(cè)的準(zhǔn)確性和特異性。

NSCLC患者 CECs、aCECs的數(shù)量及 aCECs占CECs百分比都明顯高于健康人群(P<0.001),與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5-6]。在CECs中aCECs僅占CECs的一小部分,其余大部分是 rCECs、apoptotic CECs;NSCLC患者CECs比健康人群高10倍左右,aCECs則高于健康人群近20倍,CECs可以作為很好的標(biāo)記物來NSCLC血管生成狀況,而aCECs則更能反映NSCLC新生血管生成的活力。CECs、aCECs的數(shù)量在肺癌的病理分型上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),其與NSCLC腫瘤大小及血CEA的水平無明顯相關(guān)性(P>0.05),與相關(guān)報(bào)道[10,13]結(jié)果一致。在NSCLC的臨床分期上,Ⅰ、Ⅱ期的CECs、aCECs數(shù)量均低于Ⅲ期、Ⅳ期,并以Ⅲ期為最高,但總體上3組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10,13]。由于本實(shí)驗(yàn)樣本量相對(duì)較少,類似相關(guān)研究不多,CECs、aCECs的數(shù)量在 NSCLC、小細(xì)胞肺癌乃至NSCLC不同病理類型、不同臨床分期上的差別還有待于進(jìn)一步檢測(cè),以便進(jìn)一步評(píng)估肺癌的血管生成情況,為抗血管生成治療病人的合理選擇及療效評(píng)估提供依據(jù)。

采用富集處理(提取單個(gè)核細(xì)胞)的方法進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析能夠成功地檢測(cè)出CECs、aCECs,其在aCECs檢測(cè)上明顯優(yōu)于前期全血試驗(yàn)性的檢測(cè)結(jié)果。由于CECs在外周血中的數(shù)量較少,更多地收集流式細(xì)胞儀設(shè)門內(nèi)的細(xì)胞數(shù),能夠提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性及可靠性,其在不同功能狀態(tài)CECs的檢測(cè)上將會(huì)充分顯示出它的優(yōu)勢(shì),這為進(jìn)一步檢測(cè)休眠 CECs、活性 CECs、凋亡CECs及循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞(circulating endothelial progenitors,CEPs)奠定了基礎(chǔ),以明確不同類型CECs及 CEPs的活力、動(dòng)力學(xué)特征及其在NSCLC血管生成中的作用及意義。相信隨著CECs檢測(cè)技術(shù)的不斷完善,CECs、aCECs以及其他類型CECs和CEPs將會(huì)成為很好的標(biāo)記物去監(jiān)測(cè)NSCLC血管生成狀況、抗血管生成藥物療效及預(yù)后。

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