于清霞,戴 琳,王 輝,周少玲

(1.山東省煙臺毓璜頂醫(yī)院,山東煙臺,264000;2.山東省煙臺市煙臺山醫(yī)院,山東煙臺,264001)

一氧化碳(CO)作為新近發(fā)現(xiàn)的氣體信號分子,已有研究證實[1],在動脈粥樣硬化(AS)進程中具有重要作用,通過舒張血管、抑制單核細胞及血小板向內(nèi)皮的黏附聚集、抑制血管平滑肌細胞增殖、遷移等方面的作用來抑制動脈粥樣硬化進程。血紅素加氧酶(HO)是內(nèi)源性一氧化碳的限速酶和關鍵酶[2],以血紅素為底物降解生成膽紅素、鐵及CO。HO有3種同工異構酶即HO-1、HO-2及HO-3。他汀類的抗動脈粥樣硬化作用已有肯定的報道,但具體機制尚需進一步研究。CO作為新近發(fā)現(xiàn)的動脈粥樣硬化進程中重要介質(zhì),而他汀類對HO/CO系統(tǒng)的影響,國內(nèi)外尚無報道。本文通過動物試驗觀察了食餌性家兔主動脈HO-1的表達及CO生成量的變化以及辛伐他汀對HO/CO系統(tǒng)的影響。

1 材料與方法

1.1 AS模型的復制及動物實驗分組

24只新西蘭雄性大白兔(購自山東省農(nóng)科院),飼以120～140 g普通飼料添加1%膽固醇粉1 g/d(湖南華富制藥有限公司),于傍晚給藥。24只大白兔以膽固醇膳食8周后,隨機分為3組,每組8只。模型組用普通飼料;辛伐他汀組(由浙江新昌京新制藥有限公司提供),10 mg/d。每組繼續(xù)給予普通飼料120～140 g,喂養(yǎng)8周。對照組(普通喂食對照組):8只新西蘭大白兔,給予普通飼料120～140 g喂養(yǎng)16周。

1.2 各項生化指標的測定

于實驗開始、8周末、16周末,禁食12 h以上,經(jīng)耳緣靜脈抽血備用。

1.2.1 血脂測量過程及方法:采用沉淀漂浮酶聯(lián)法檢測總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。

1.2.2 內(nèi)源性CO含量的測定:應用Chalmers AH[3]的方法,根據(jù)CO與血紅蛋白親和力較氧強210倍,讓樣品中CO與血紅蛋白溶液相互作用,生成血紅蛋白一氧化碳復合物,再以連二亞硫酸鹽還原檢測CO復合物的含量。

1.3 主動脈光鏡標本制作

16周末,麻醉動物后迅速開胸,暴露心臟,采用冰生理鹽水(4℃)充分灌洗心臟,分離整個主動脈,于主動脈弓下緣水平切取主動脈長約1～2 cm,剝除外膜結締組織,部分組織置入10%中性緩沖甲醛液中固定,常規(guī)石蠟切片,HE染色。

1.4 主動脈 α-actin 、CD68、HO-1 的表達

采用免疫組織化學方法進行染色。兔抗人HO-1多克隆抗體試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供,兔抗人α-actin單克隆抗體、兔抗人CD68單克隆抗體均由北京中山生物工程有限公司提供。采用武漢同濟醫(yī)科大學清平公司軟件MPI-500多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)對HO-的表達進行定量分析。

2 結 果

2.1 血脂檢測結果

與對照組相比較,模型組除HDL外血脂水平明顯升高(P<0.01),用藥后辛伐他汀組血漿TC、TG、LDL下降明顯(P<0.01),HDL升高(P<0.01)。用藥后氨氯地平組血漿TC、TG、LDL與模型組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。

2.2 血漿一氧化碳測定結果

與對照組相比較,血漿一氧化碳水平明顯升高(P<0.01),用氨氯地平進行干預后血漿一氧化碳水平明顯降低(P<0.01),見表1。

表1 各組總膽固醇、甘油三酯、和高密度、低密度脂蛋白膽固醇(mmol/L)及血漿一氧化碳含量(mg/L)的測定結果(±s,n=8)

表1 各組總膽固醇、甘油三酯、和高密度、低密度脂蛋白膽固醇(mmol/L)及血漿一氧化碳含量(mg/L)的測定結果(±s,n=8)

與模型組比較,＊＊P<0.01。

組別 時間(周) TC TG HDLC LDLC CO對照組 0 1.27±0.45 0.76±0.27 0.44±0.17 0.74±0.23 0.142±0.084 8 1.33±0.55 0.86±0.33 0.45±0.19 0.88±0.14 0.135±0.149＊＊16 1.28±0.43 0.85±0.44 0.50±0.13 0.95±0.25 0.133±0.152＊＊模型組 0 1.33±0.52 0.73±0.21 0.43±0.17 0.79±0.21 0.134±0.071 8 12.15±4.37 1.38±0.58 0.38±0.21 11.32±6.01 0.505±0.030 16 11.74±3.11 1.28±0.36 0.44±0.21 9.34±2.88 0.490±0.250辛伐他汀組 0 1.29±0.50 0.78±0.28 0.44±0.18 0.73±0.22 0.147±0.096 8 11.36±3.75 1.06±0.30 0.45±0.20 8.98±3.11 0.517±0.126 16 4.41±3.88＊ 0.52±0.28＊＊ 0.63±0.12＊＊ 3.01±3.32＊＊ 0.157±0.077＊＊

2.3 大體病理學觀察

16周正常對照組兔主動脈內(nèi)膜光滑,無脂質(zhì)沉積。動脈粥樣硬化模型組,可見動脈內(nèi)膜面有淺黃色斑塊狀突起,散在或融合成片,多分布于血管分叉周圍,其長軸多與主動脈長軸平行,以主動脈弓部病變最重。16周末藥物治療組斑塊突起較動脈粥樣硬化組減少,以辛伐他汀組最為顯著。

2.4 免疫組織化學檢測結果

HO-1的陽性染色主要位于內(nèi)膜的內(nèi)皮細胞胞質(zhì)內(nèi)及中膜的平滑肌細胞胞質(zhì)內(nèi),染色成棕色顆粒狀或條狀。在正常對照組主動脈內(nèi)皮細胞內(nèi)呈扭曲線條狀陽性反應,在平滑肌細胞內(nèi)呈陰性反應。在模型組主動脈內(nèi)膜及內(nèi)膜下有強陽性反應帶,中膜平滑肌內(nèi)見灶片狀強陽性。藥物干預組主動脈內(nèi)皮細胞內(nèi)可見陽性反應顆粒,而中膜平滑肌內(nèi)呈弱陽性或陰性(圖1)。

圖1 免疫組織化學檢測主動脈內(nèi)血紅素氧合酶1的表達 400倍

2.5 主動脈HO-1表達的定量檢測

采用圖像分析儀定量檢測,主動脈HO-1表達值對照組為8.82±0.36,模型組為17.55±1.19,辛伐他汀組為14.48±0.49,氨氯地平組為12.20±0.48。模型組表達明顯高于其他各組(P<0.01),辛伐他汀組血紅素加氧酶-1表達值為14.48±0.49與模型組比較有顯著差異(P<0.05)。

3 討 論

CO作為新近發(fā)現(xiàn)的氣體信使分子在生物體內(nèi)的作用方式與NO相似,都可以激活sGC,升高細胞內(nèi)CGMP而發(fā)揮作用;在神經(jīng)系統(tǒng)中作為神經(jīng)遞質(zhì),在其他系統(tǒng)中作為細胞信使分子發(fā)揮作用[4],從而成為心血管系統(tǒng)的重要血管活性物質(zhì)?？赏ㄟ^以下機制參與動脈粥樣硬化進程:①能激活鳥苷酸環(huán)化酶(GC),增加細胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)水平,進而產(chǎn)生舒張血管和抑制血小板聚集等作用;還可以通過激活Ca2+依賴型K通道通過Ca2+脫敏導致血管擴張。②可通過抑制成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白的磷酸化;抑制細胞周期調(diào)節(jié)蛋白A激酶和周期素依賴性蛋白激酶2的活性間接或直接作用于細胞周期,從而對抗血管損傷導致的內(nèi)膜過度增生。CO還可通過旁分泌的方式抑制內(nèi)皮素1和PDGF-B基因mRNA的表達,減少內(nèi)皮源性絲裂原的表達,抑制血管平滑肌細胞的增殖。③可以增加抗炎細胞因子白細胞介素10的表達,而減少促炎性細胞因子腫瘤壞死因子α和腫瘤壞死因子1β的表達。并通過減少細胞間黏附因子的產(chǎn)生,減少單核/巨噬細胞在血管壁的聚集,表現(xiàn)出明顯的抗炎作用[5-8]。

近年來,他汀類藥物作用的多效性引起了人們的極大關注,其中,他汀類藥物的抗炎作用倍受人們的關注,它與臨床試驗中發(fā)現(xiàn)的他汀類藥物降低心血管事件發(fā)生的早期效益有關[9-10]。而辛伐他汀作為臨床上最常用的他汀類藥物,許多研究發(fā)現(xiàn)它既可降低血脂,亦對As的炎性成分也有直接或者間接的影響[11-13]。本實驗經(jīng)藥物干預8周后,與模型組比辛伐他汀組血脂水平明顯下降。干預16周后血漿CO水平明顯下降,用藥前后有顯著性差異(P<0.05)。藥物干預后免疫組織化學檢查示兔胸主動脈HO-1表達明顯減弱,表達程度的定量分析顯示用藥前后有顯著性差異(P<0.05)。CD68及α-actin的陽性染色明顯減弱,其代表粥樣硬化斑塊內(nèi)主要細胞成分即巨噬細胞及平滑肌細胞的多少,二者表達減弱提示動脈粥樣硬化斑塊的消退。大體病理示動脈粥樣斑塊較模型組明顯減少。上述結果表明在動脈粥樣硬化進程中,HO/CO系統(tǒng)呈代償性上調(diào)趨勢,而經(jīng)辛伐他汀干預后,動脈粥樣硬化斑塊可部分消退,同時HO/CO系統(tǒng)的代償作用亦減弱。辛伐他汀可能通過改善血管內(nèi)皮功能、降低血脂水平減少動脈粥樣硬化進程中的促發(fā)因素如各種炎性因子、氧自由基等,從而下調(diào)起代償作用HO-1的表達,而部分抑制動脈粥樣硬化的進程。從而進一步豐富了他汀類藥物抗動脈粥樣硬化的機制。

[1] Otterbein L E,Zuckerbraun B S,Haga M,et al.Carbon monoxide suppresses atherosclerotic lesions associated with chronic graft rejection and with balloon injury[J].Nat Med,2003,9(2):183.

[2] Nakayama M,Takahashi K,Komaru T,et al.Increased Expression of Heme Oxygenase-1 and Bilirubin Accumulation in Foam Cells of Rabbit Atherosclerotic Lesions[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2001,21(8):1373.

[3] Chalmers A H.Simple,sensitive measurement of carbon monoxide in plasma[J].Clin Chem,1991,37(8):1442.

[4] 李慧.內(nèi)源性一氧化碳的研究進展[J].中國醫(yī)學文摘:內(nèi)科學,2005,26(6):734.

[5] N disang J F,T abien H E,Wang R.Carbon monoxide and hypertension[J].Hypertension,2004,22(6):1057.

[6] 陳協(xié)輝,李鵬,黃小平,等.硫化氫對ATP敏感性鉀通道作用的研究進展[J].醫(yī)學研究雜志,2010,39(8):105.

[7] Ali F,Zakkar M,Karu K,et al.Induction of the cytoprotective enzyme heme oxygenase-1 by statins is enhanced in vascular endothelium exposed to laminar shear stress and impaired by disturbed flow[J].J Biol Chem,2009,284(28):18882.

[8] 于清霞,劉同濤,孫春麗,等.氨氯地平對實驗性兔動脈粥樣硬化進程中一氧化氮合酶-一氧化氮和血紅素氧合酶-一氧化碳系統(tǒng)的影響[J].中國動脈硬化雜志,2008,16(8):615.

[9] 劉時武,丁世芳.他汀類藥物的非調(diào)脂作用[J].華南國防醫(yī)學雜志,2008,22(2):63.

[10] 袁彬.他汀類藥物對急性腦梗死患者CRP、TNF-α和血脂的影響[J].中國臨床保健雜志,2008,11(3):298.

[11] 陳珍,蘇丹霞,胡梅榮,等.辛伐他汀對短暫性腦缺血發(fā)作患者頸動脈粥樣硬化斑塊和血脂影響的研究[J].海南醫(yī)學院學報,2008,14(4):349.

[12] 陸寧,盧孔月,劉濤,等.辛伐他汀聯(lián)合非諾貝特治療高脂血癥的療效及安全性臨床研究[J].實用臨床醫(yī)藥雜志,2008,12(8):36.

[13] 朱源生.辛伐他汀對慢性心衰患者心功能和炎性因子的影響[J].實用臨床醫(yī)藥雜志,2009,13(11):52.