王 鈞,孟慶祥,劉金玲,范愛(ài)飛,周 宇,聶李平,孫麗華,張文麗,張紅宇,姚志娟,郭乃欖

(北京大學(xué)深圳醫(yī)院血液科,廣東深圳,518036)

健康供者的外周血造血干細(xì)胞(PBSC)采集是異基因外周血造血干細(xì)胞移植成敗的關(guān)鍵步驟。一方面PBSC的數(shù)量及質(zhì)量與移植后能否重建造血功能、急慢性移植物抗宿主病的發(fā)生、疾病的復(fù)發(fā)等有密切關(guān)系;另一方面,臨床上希望找到更有效的采集程序,減少采集并發(fā)癥,減輕供者痛苦,降低采集費(fèi)用。COBE Spectra血細(xì)胞分離機(jī)是目前國(guó)內(nèi)外常用的連續(xù)性細(xì)胞分離裝置,近年來(lái)在半自動(dòng)采集程序(MNC程序)基礎(chǔ)上,又開(kāi)發(fā)出了自動(dòng)采集程序(AutoPBSC程序)。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于AutoPBSC程序的報(bào)告尚不多見(jiàn),本科2002年3月～2008年3月期間對(duì)應(yīng)用該分離機(jī)的兩種采集程序?qū)】倒┭叩腜BSC進(jìn)行采集并進(jìn)行比較,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料及方法

1.1 一般資料

2002年3月～2008年3月期間,本院健康供者53例,年齡 15～56歲,中位年齡31歲,男 30例,女23例。同胞供者51例,其中HLA位點(diǎn)全相合37例,HLA位點(diǎn)不全相合14例;無(wú)關(guān)供者2例。供者中合并高血壓2例,糖尿病1例,地中海貧血基因攜帶者1例。

1.2 供者采集前動(dòng)員

健康供者采用重組人類(lèi)粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF,格拉諾賽特 5 ～ 10 μ g/(kg·d)皮下注射,第4天開(kāi)始采集PBSC。采集PBSC的閾值為MNC>(6～8)×108/kg,CD34+細(xì)胞>2×106/kg,CFU-GM>1×105/kg)。

1.3 PBSC采集方法

使用美國(guó)COBE Spectra血細(xì)胞分離機(jī),隨機(jī)采用AutoPBSC與MNC 2個(gè)不同程序采集PBSC,其中采用AutoPBSC程序63例次,MNC程序50例次。MNC程序需操作人員根據(jù)經(jīng)驗(yàn),通過(guò)目測(cè)比色法手控調(diào)節(jié)血漿泵流速進(jìn)行造血干細(xì)胞采集,每次采集平均循環(huán)3個(gè)血容量;AutoPBSC程序?yàn)椴杉到y(tǒng)通過(guò)濃度比濁法自動(dòng)監(jiān)視,每循環(huán)1 200～1 600 mL,以采集+回沖(各4 mL)方式定量收集PBSC 8 mL,避免人為改變采集過(guò)程,每次采集循環(huán)3個(gè)血容量,采集約50～80 mL PBSC。

1.4 PBSC檢測(cè)指標(biāo)及方法

CD34+細(xì)胞:應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè);CFU-GM檢測(cè)按常規(guī)方法應(yīng)用CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),10 d及14 d在倒置顯微鏡下分別計(jì)數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞集落(≥40個(gè)細(xì)胞為一集落);單個(gè)核細(xì)胞測(cè)定應(yīng)用Sysmax SE-9500血細(xì)胞分析儀,結(jié)合人工涂片分類(lèi)計(jì)數(shù)。供者血紅蛋白、白細(xì)胞及血小板:應(yīng)用Sysmax SE-9500血細(xì)胞分析儀,血常規(guī)監(jiān)測(cè)時(shí)間為采集當(dāng)日和次日。

1.5 PBSC的輸注及凍存

2種程序采集的外周血造血干細(xì)胞均不需特殊處理可直接由患者中心靜脈插管輸注。如供、患者間血型相合或僅次要不合則患者不需特殊治療;供、患者血型完全不相合則患者在輸注PBSC前需補(bǔ)液擴(kuò)容(2 500 mL/m2),并加用5%碳酸氫鈉125 mL堿化尿液及速尿20 mg利尿處理。

凍存處理:將PBSC懸液終濃度調(diào)至小于2×107/mL,與含有6%羥乙基淀粉(6%HES,賀斯)及終濃度5%的二甲基亞砜(DMSO)的冷凍保存液混合后直接置入-80℃超低溫冰箱內(nèi)保存。

2 結(jié) 果

2.1 2種程序采集PBSC指標(biāo)的比較

53例健康供者共采集PBSC 113例次,其中采用AutoPBSC程序63例次,MNC程序50例次,平均每例供者采集PBSC 1～4次,中位采集次數(shù)為2次。AutoPBSC程序與MNC程序比較,外周血造血干細(xì)胞的體積小,采集袋中血小板及紅細(xì)胞混入量少,單個(gè)核細(xì)胞、CD34+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和總數(shù)較高。但統(tǒng)計(jì)學(xué)處理發(fā)現(xiàn),2種方法采集的單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)差異無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2種程序采集PBSC指標(biāo)的比較(±s)

表1 2種程序采集PBSC指標(biāo)的比較(±s)

與MNC程序比較,＊＊P<0.01。

項(xiàng)目 AutoPBSC程序 MNC程序混血小板數(shù)(×109) 45.56±13.28＊＊ 21.22±8.32 PBSC體積(mL) 77.23±14.1＊＊ 241.44±28.79 MNC(%) 95.56±2.62＊＊ 82.27±8.31 MNC(×109) 15.32±3.61 14.44±5.41 CD34(%) 3.1±1.42＊＊ 1.97±0.89 CD34(×106) 23.76±7.34＊＊ 1.97±0.89混入紅細(xì)胞數(shù)(×109)33.3±18.62＊＊ 113.12±45.5

2.2 采集對(duì)供者血常規(guī)的影響

AutoPBSC與MNC 2種程序采集PBSC后供者血紅蛋白含量變化無(wú)顯著性差異,血小板計(jì)數(shù)在應(yīng)用 MNC程序組呈顯著性下降,提示應(yīng)用MNC程序更易損失血小板;而AutoPBSC程序組則血小板損失較少(表2)。

表2 兩種程序采集PBSC后供者血常規(guī)變化(±s)

表2 兩種程序采集PBSC后供者血常規(guī)變化(±s)

與MNC程序比較,＊＊P<0.01。

程序 血紅蛋白下降(g/L)血小板計(jì)數(shù)下降(×109/L)AutoPBSC 1.08±0.36 24.3±12.67＊＊MNC 1.74±0.10 65.21±23.76

2.3 特殊情況

1例地中海貧血(基因攜帶者)供者首日應(yīng)用AutoPBSC程序采集 PBSC后,發(fā)現(xiàn) MNC及CD34+結(jié)果明顯低于AutoPBSC程序采集中位水平,紅細(xì)胞數(shù)目明顯高于中位水平且有核紅細(xì)胞。第2、3天換用MNC程序,獲得足夠采集結(jié)果。

2.4 植活情況

所有異基因外周血造血干細(xì)胞移植均順利植活,中性粒細(xì)胞大于0.5×109/L,中位時(shí)間14 d(11～22 d),血小板計(jì)數(shù)大于20×109/L,中位時(shí)間為13 d(9～26 d),HLA位點(diǎn)全相合與不全相合異基因造血干細(xì)胞移植中性粒細(xì)胞植活時(shí)間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討 論

近年來(lái),國(guó)內(nèi)異基因外周血造血干細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用迅速發(fā)展。作為外周血造血干細(xì)胞移植的重要環(huán)節(jié),外周血造血干細(xì)胞采集的數(shù)量、質(zhì)量與移植結(jié)果密切相關(guān)[1]。與采集供者骨髓相比,外周血造血干細(xì)胞采集更方便,可反復(fù)采集得到大量造血干細(xì)胞,且移植后造血恢復(fù)更快,供者不需麻醉痛苦較小,安全性提高,易于被供受者雙方接受[2-6]。

目前臨床應(yīng)用的血細(xì)胞分離機(jī)是根據(jù)梯度離心原理,利用不同血液成分的密度差異,將血液成分在一次性無(wú)菌分離管路中進(jìn)行分離、采集和收集。與其他血細(xì)胞分離裝置如CS3000 Plus(Baxter)、MCS 3P(Haemonetics)比較,COBE Spectra具有同樣時(shí)間內(nèi)分離血流量大、CD34+細(xì)胞產(chǎn)率高的特點(diǎn);其造血干細(xì)胞分離物是保存在離心倉(cāng)外的產(chǎn)品袋中,避免了長(zhǎng)時(shí)間受到離心力的破壞和離心倉(cāng)溫度因素對(duì)采集物的潛在危險(xiǎn);且明顯降低了采集物中紅細(xì)胞、血小板數(shù)量和采集容積[7]。另外,Ford等[8-9]研究發(fā)現(xiàn),與CS3000分離機(jī)相比,COBE采集結(jié)果對(duì)需要輸入裝置的細(xì)胞參數(shù)(紅細(xì)胞壓積及白細(xì)胞計(jì)數(shù)等)依賴(lài)性小,采集性能更趨穩(wěn)定。

COBE Spectra分離機(jī)的AutoPBSC程序是全自動(dòng)化分離程序,與傳統(tǒng)MNC程序比較,具有更多優(yōu)勢(shì):體外循環(huán)血量少(165 mL對(duì)比284 mL),利于在兒童及低體質(zhì)量人群的采集;采集物體積小,利于進(jìn)行細(xì)胞處理及細(xì)胞凍存;采集物含中性粒細(xì)胞及血小板量少,減少對(duì)干細(xì)胞污染等[10-11]。Heuft等對(duì)88例患者102次采集結(jié)果分析表明,應(yīng)用AutoPBSC程序分離一次即達(dá)到移植閾的比例為85%[12],顯示具有較高的采集效率。對(duì)于干細(xì)胞采集的數(shù)量及效率則有不同的報(bào)道,Rowley等研究比較供/患者應(yīng)用2種程序分離PBSC的結(jié)果,終移植閾為CD34+細(xì)胞大于5×106/kg,結(jié)果分析表明與Auto PBSC程序相比,MNC程序的分離效率更高[13]。

本研究顯示與MNC程序比較,AutoPBSC程序有以下特點(diǎn):①單個(gè)核細(xì)胞和CD34+細(xì)胞百分比提高,但綜合計(jì)算二者分離物中單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)及CD34+細(xì)胞總數(shù)是相近的,提示兩種分離方法均可有效采集到足夠的造血干細(xì)胞;②采集物中含血小板數(shù)下降,對(duì)供者血小板影響小,對(duì)于順利進(jìn)行下一次分離尤為重要;③采集物體積減少,利于造血干細(xì)胞凍存。本組供者113例次采集中,發(fā)現(xiàn)1例次攜帶地中海貧血基因供者應(yīng)用AutoPBSC程序失敗的情況,分析可能與供者年輕紅細(xì)胞較多且存在有核紅細(xì)胞有關(guān),二者密度接近于單個(gè)核細(xì)胞。AutoPBSC程序限定每循環(huán)僅采集3～5mLPBSC,每次采集時(shí)紅細(xì)胞混有過(guò)多,導(dǎo)致單個(gè)核細(xì)胞無(wú)法有效采集到有關(guān)。該供者換用MNC程序后順利采集到足夠PBSC,表明不是供者干細(xì)胞動(dòng)員的原因。

本研究認(rèn)為,AutoPBSC程序在外周血造血干細(xì)胞分離采集領(lǐng)域有獨(dú)特優(yōu)勢(shì),尤其適用于首日采集、低體質(zhì)量?jī)和?、分離時(shí)血小板低下(特別采集是第2天)、分離后須進(jìn)行冷凍或需要進(jìn)行CD34+細(xì)胞分選等情況。但攜帶地中海貧血基因或輕型地貧供者應(yīng)慎用AutoPBSC程序。

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