趙楚生,陳瑞烈,林少銳,蔡綺純,吳健慧,謝 嬋

(1.中山大學(xué)附屬汕頭醫(yī)院感染科,廣東汕頭,515031;2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院感染科,廣東廣州,510630)

乙型肝炎是國(guó)人常見(jiàn)疾病,臨床表現(xiàn)多樣,可表現(xiàn)為急性、慢性遷延性、慢性活動(dòng)性或者爆發(fā)性等多種形式,其預(yù)后也不一樣。造成臨床表現(xiàn)多樣性的具體機(jī)制還不清楚,但可以肯定與機(jī)體免疫反應(yīng)有關(guān)。乙肝病毒侵入機(jī)體后產(chǎn)生由T細(xì)胞毒反應(yīng)所介導(dǎo)的免疫反應(yīng),T細(xì)胞可分為CD4+和CD8+2種亞群。CD4+細(xì)胞可進(jìn)一步分為T(mén)h1、Th2和 Th0亞型,Th0則是 Th1/Th2的前體細(xì)胞[1]。CD8+細(xì)胞也可進(jìn)一步分為 Th1、Th2亞型,有學(xué)者將其分別命名為T(mén)c1和Tc2[2]。Th1與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)有關(guān),Th2與體液免疫有關(guān)。Th1/Th2(Tc1/Tc2)平衡是保持機(jī)體正常免疫機(jī)制所必需,其失衡與乙型肝炎發(fā)展有明顯相關(guān)性,但也有不同意見(jiàn)[3-5]。

本研究采用流式細(xì)胞術(shù)分析各型乙型肝炎患者外周血不同T淋巴細(xì)胞亞群CD3+/CD8+以及 CD3+/CD8-中細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-4)的表達(dá),對(duì)外周血Th1/Th2、Tc1/Tc2細(xì)胞失衡與乙型肝炎慢性化以及進(jìn)展的關(guān)系進(jìn)行分析,探討免疫平衡機(jī)制在乙型肝炎發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

病例選自2006年7月～2008年12月期間在中山大學(xué)附屬汕頭醫(yī)院、中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院住院及門(mén)診治療的各型乙型肝炎患者81例,其中男61例,女20例。入組病例符合以下標(biāo)準(zhǔn):①年齡18～65歲,性別不限。②診斷標(biāo)準(zhǔn):診斷符合2000年西安第十次全國(guó)病毒性肝炎和肝病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂標(biāo)準(zhǔn)。③無(wú)合并其他嚴(yán)重的疾病,如心腎功能衰竭、糖尿病、腫瘤等,無(wú)甲狀腺功能亢進(jìn)等自身免疫性疾病、無(wú)服用抗排斥等免疫抑制劑。所有病例均排除甲、丙、丁、戊肝病毒、TTV、巨細(xì)胞病毒、皰疹病毒等重疊感染。

1.2 儀器與試劑

BD FACScalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)、CO2培養(yǎng)箱(美國(guó) Forma Scientific公司)。CD3-PE-Cy5,CD8-FITC,IL-4-PE-Cy7,IFN-γ-PE Texas Red和CD69-PE均購(gòu)自BD公司,鼠FITC-IgG1和PE-IgG1單抗為Pharmingen公司產(chǎn)品。PMA、Ionomycin、BFA等購(gòu)自SIGMA公司,RPMI1640購(gòu)自GIBCO公司,固定穿透試劑盒CytofixPCytopem kit購(gòu)自Pharmingen公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng):空腹抽取患者外周靜脈血2～3 mL,肝素抗凝,按1∶1與無(wú)血清的 RPMI 1640培養(yǎng)基混勻,加入刺激劑PMA和Ionomycin,使其終濃度分別為25 ng/mL和 1 μ g/mL,同時(shí)加入終濃度為10 μ g/mL的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑BFA;未刺激對(duì)照則只加BFA,不加刺激劑,混勻后細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。

1.3.2 細(xì)胞膜表面抗原和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色:加入20 μ L CD3-PE-Cy5和 CD8-FITC單抗于檢測(cè)管中,再加100 μ L培養(yǎng)的全血,混勻,室溫暗處孵育15 min,加入溶血素 2 mL,放置5～10 min,待紅細(xì)胞裂解,1 000 r/min離心5 min,棄上清,將細(xì)胞用含0.5%小牛血清的PBS 2 mL洗滌1次,加入固定液CytofixPCytopem 0.5 mL,固定20 min,1 000 r/min離心5 min,棄上清,再加2 mL 1×CytopermPWash穿透劑室溫暗處穿透10 min,1 000 r/min離心5 min,然后加入20 μ L IL-4-PE-Cy7 和 IFN-γ-PE Texas Red 單抗 ,混勻,室溫暗處孵育30 min,2 mL 1×CytopermPWash穿透劑洗1次,最后加入0.5 mL 1%PFA固定待測(cè)。

1.3.3 結(jié)果分析:用CD3和CD8設(shè)門(mén),FL1和FL2熒光通道則以相應(yīng)同種型的鼠IgG染色細(xì)胞作陰陽(yáng)分界線,仔細(xì)設(shè)置各熒光通道之間的熒光補(bǔ)償,然后進(jìn)行IFN-γ和IL4的檢測(cè),每管獲取細(xì)胞數(shù)30 000個(gè),用Cellquest軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié) 果

2.1 急慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群中細(xì)胞因子 IFN-γ、IL-4的表達(dá)

急慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4的表達(dá)百分率比較結(jié)果顯示:相對(duì)于急性肝炎(acute hepatitis B,AHB),慢性肝炎(chronic hepatitis B,CHB)外周血CD3+/CD8-、CD3+/CD8+T細(xì)胞亞群IL-4分泌均增加,慢性肝炎Th2、Tc2細(xì)胞高于急性肝炎(P<0.01;P<0.05)。見(jiàn)表1及圖 1。

表1 急慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4的表達(dá)(±s)

表1 急慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4的表達(dá)(±s)

與 AHB 組比較,＊P<0.05,＊＊P<0.01。

Th(%)Tc(%)分組 n IFN-γ+ IL-4+IFN-γ+ IL-4+AHB 19 13.94±1.99 1.28±0.59 7.46±1.04 1.93±1.05 CHB 62 14.47±1.36 2.04±0.87＊＊ 7.60±0.79 2.45±0.83＊

2.2 慢性輕中重度乙型肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4的表達(dá)

慢性輕中重度乙型肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4的表達(dá)百分率結(jié)果顯示:相對(duì)于輕度組,中度 CD3+/CD8-、CD3+/CD8+T細(xì)胞亞群以及重度組CD3+/CD8-、CD3+/CD8+T細(xì)胞亞群 IFN-γ表達(dá)均有增高(P<0.01),中度 、重度組Th1、Tc1均高于輕度組;相對(duì)于中度組,重度組CD3+/CD8-、CD3+/CD8+T細(xì)胞亞群IFN-γ亦有增高(P<0.05;P<0.01),重度組Th1、Tc1均高于中度組。見(jiàn)表2及圖2。

圖1 肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖

表2 慢性輕中重度乙型肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4的表達(dá)(±s)

表2 慢性輕中重度乙型肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4的表達(dá)(±s)

與輕度組比較,＊＊P<0.01;與中度組比較,#P<0.05。

Th(%)Tc(%)Group n IFN-γ+ IL-4+IFN-γ+ IL-4+輕度組 25 13.77±0.71 2.05±0.90 7.04±0.46 2.45±0.83中度組 22 14.36±0.29＊＊ 2.00±0.97 7.55±0.50＊＊ 2.33±0.86重度組 15 15.81±2.06＊＊# 2.07±0.71 8.59±0.64＊＊## 2.64±0.80

圖2 慢性肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖

3 討 論

乙型肝炎病毒(HBV)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道,全世界有約20億人曾感染HBV,其中3.5億人為慢性HBV感染,每年大約有100萬(wàn)人死于HBV感染引起的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌[6]。我國(guó)屬HBV感染地方性流行區(qū)。2006年我國(guó)流行病學(xué)調(diào)查,一般人群HBV表面抗原(HBsAg)攜帶率為7.18%。據(jù)此推算,我國(guó)現(xiàn)有的慢性HBV感染者約9 300萬(wàn)人,其中,慢性乙型肝炎患者約2 000萬(wàn)例[7-8]。

目前,乙型病毒性肝炎的治療仍是世界公認(rèn)的難題。這主要是由于其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚,從而導(dǎo)致了治療和對(duì)預(yù)后評(píng)估的困難[9-11]。在大多數(shù)病毒感染性疾病中,機(jī)體特異性細(xì)胞免疫對(duì)于清除病毒感染起到重要作用;另一方面,在某些條件下,免疫效應(yīng)細(xì)胞和某些細(xì)胞因子在清除病毒的過(guò)程中可引起組織細(xì)胞損傷,產(chǎn)生不同程度的病理變化。

乙型肝炎的發(fā)病主要是機(jī)體清除HBV而引發(fā)的細(xì)胞免疫病理改變[12-14]。乙肝病毒感染肝臟后,機(jī)體通過(guò)NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、以及特異性的CTL等免疫細(xì)胞清除被病毒感染的肝細(xì)胞[15],若大量肝細(xì)胞被感染或機(jī)體免疫功能亢進(jìn),大量肝細(xì)胞受免疫細(xì)胞攻擊而迅速壞死,則引起重癥肝炎。

Th1/Th2(Tc1/Tc2)免疫應(yīng)答是近年來(lái)免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)之一,其在乙型肝炎發(fā)病機(jī)制中的作用日益受到重視。研究HBV感染時(shí)Th1/Th2(Tc1/Tc2)狀態(tài)對(duì)認(rèn)識(shí)乙型肝炎發(fā)病、發(fā)展、預(yù)后和觀察治療效果均有積極的意義。本研究證實(shí)了慢性乙型肝炎患者外周血Th2、Tc2細(xì)胞高于急性肝炎,而隨著慢性乙型肝炎活動(dòng)程度的加劇Th1、Tc1細(xì)胞逐漸增多。我們的研究結(jié)果表明Th2、Tc2與乙型肝炎慢性化有關(guān),各類(lèi)慢乙肝患者以Th2型反應(yīng)為主,Th2型優(yōu)勢(shì)反應(yīng)是HBV感染慢性化的主要原因之一。Th1/Th2調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的平衡,決定免疫應(yīng)答的方向。Th1細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ、TNF等 I型細(xì)胞因子,促進(jìn)細(xì)胞免疫(I型免疫反應(yīng))、細(xì)胞毒性T細(xì)胞的生長(zhǎng)和活化、巨噬細(xì)胞的活化,介導(dǎo)遲發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)。Th2細(xì)胞以分泌 IL-4、IL-5為特征,通常還產(chǎn)生 IL-6、IL-9、IL-10和IL-13等Ⅱ型細(xì)胞因子,促進(jìn)B細(xì)胞的生長(zhǎng)、活化和分化,增進(jìn)以IgE和IgG1類(lèi)抗體為主的體液免疫(Ⅱ型免疫反應(yīng))?，F(xiàn)有資料表明:各類(lèi)慢乙肝患者以Th2型反應(yīng)為主,在此基礎(chǔ)上,肝臟的炎癥活動(dòng)隨著Th1型免疫反應(yīng)的波動(dòng)而波動(dòng),Th1型免疫反應(yīng)與肝臟炎癥的活動(dòng)密切相關(guān)[4]。其機(jī)制可能為:Th1型細(xì)胞被活化后,分泌IL-2,IFN-γ等Th1型細(xì)胞因子增多,它們能增強(qiáng)NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、以及特異性的CTL等免疫細(xì)胞的活性,使免疫攻擊加強(qiáng);增加肝細(xì)胞表面的HLA-I類(lèi)分子表達(dá),提高肝細(xì)胞對(duì)免疫細(xì)胞的細(xì)胞毒作用的敏感性;另外,還能夠加強(qiáng)趨化活性,吸引炎癥細(xì)胞聚集,加重炎癥反應(yīng)。這樣,Th1型反應(yīng)在促進(jìn)細(xì)胞免疫反應(yīng),清除病毒的同時(shí),還會(huì)加劇肝細(xì)胞的炎癥損傷,致使病情發(fā)展加重。這也能解釋本研究中隨著慢性乙型肝炎活動(dòng)程度的加劇Th1、Tc1細(xì)胞逐漸增多。

本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)外周血Th1/Th2、Tc1/Tc2細(xì)胞失衡與乙型肝炎病情轉(zhuǎn)歸的關(guān)系進(jìn)行分析,探討免疫平衡機(jī)制在乙型肝炎發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)歸和預(yù)后中的作用。由于流式細(xì)胞技術(shù)日益成熟,外周血 Th1/Th2、Tc1/Tc2有望成為判斷乙型肝炎發(fā)展、預(yù)后及治療療效的重要指標(biāo),具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。由于免疫失衡有著復(fù)雜的機(jī)理,其進(jìn)一步的分子生物學(xué)機(jī)制尚待闡明。

[1] Allen S,Turner S J,Bourges D,et al.Shaping the T-cell repertoire in the periphery[J].Immunol Cell Biol,2010,16:[Epub ahead of print].

[2] 馬全林,馬捷,王春利,等.肺癌患者外周血γ δ T細(xì)胞的檢測(cè)及意義[J].腫瘤研究與臨床,2010,22(9):613.

[3] Bertoletti A,Delio M M,Boni C,et al.Different cytokine profiles of intraphepatic T cells in chronic hepatitis B and hepatitis C virus infections[J].Gastroenterology,1997,112(1):193.

[4] 王娟華,謝志萍,裴浩,等.HBV慢性感染患者外周血T h1/Th2(Tc1/Tc2)細(xì)胞IFN-γ和 IL-4的表達(dá)及其臨床意義[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,26(18):1646.

[5] 王麗,陸建偉,沈宗麗,等.惡性腫瘤患者化療前后外周血免疫學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)及其臨床意義[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志,2006,10(11):6.

[6] 陳應(yīng)強(qiáng),龍騰飛,吳亞云.慢性乙型肝炎患者血清前白蛋白三者聯(lián)合檢測(cè)的價(jià)值[J].貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,34(4):432.

[7] Lu F M,Zhuang H.Management of hepatitis B in China[J].Chin M ed J,2009,122(1):3.

[8] 周光耀,金玲湘,蔣道榮.江蘇省南通地區(qū)乙型肝炎病毒基因分型與臨床相關(guān)性[J].中國(guó)臨床保健雜志,2008,11(6):600.

[9] 張南,夏杰,鄧國(guó)宏,等.拉米夫定對(duì)慢性重型乙型肝炎患者生存率的提高[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,30(1):75.

[10] 鮑發(fā)應(yīng),譚亞文.拉米夫定聯(lián)合水飛薊賓-卵磷脂復(fù)合物治療慢性乙型肝炎療效觀察[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,25(6):593.

[11] 王珊珊,唐博恒,劉金華,等.乙型肝炎病毒父嬰傳播的免疫預(yù)防研究[J].華南國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志,2010,24(1):6.

[12] 耿愛(ài)文,龐曉鷹,尹有美,等.拉米夫定聯(lián)合干擾素治療慢性乙型肝炎的臨床觀察[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志,2009,13(21):57.

[13] 尚莉莉.阿德福韋酯治療慢性乙型肝炎療效觀察[J].蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,35(1):54.

[14] 黃重發(fā),朱清,付啟梅,等.慢性乙型肝炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞細(xì)胞因子檢測(cè)意義[J].華南國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志,2009,23(1):40.

[15] T sai S L,Sheen I S,Chien R N,et al.Activation of T h1 immunity is a common immune mechanism for the successful treatment of hepatitis B and C:tetramer assay and therapeutic implications[J].J Biomed Sci,2003,10(1):120.