王小鳳,彭雁忠,童新燈,湯熾良,陳麗嘉,武 敬,王鳳卿,黃清清

(北京大學(xué)深圳醫(yī)院感染性疾病科,廣東深圳,518036)

慢性乙型肝炎是乙型肝炎病毒感染而引起的 肝臟慢性炎癥。目前,世界上約有3.5億HBV攜帶者,其中每年15%～40%發(fā)展為肝硬化、肝細(xì)胞癌,給人類健康帶來極大的危害。作為全球感染率最高的國(guó)家,中國(guó)有1.3億HBV攜帶者,約2.3千萬CHB患者[1]。據(jù)報(bào)道,CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和Th1/Th2的失衡均可導(dǎo)致乙型肝炎慢性化[2-3]。本文就 CHB患者 CD4+CD25+Treg及部分細(xì)胞因子的變化進(jìn)行研究,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2008年10月～2009年9月期間北京大學(xué)深圳醫(yī)院感染性疾病科收治的臨床確診CHB患者 24例[男20例,女4例,年齡(35.92±1.52)歲]作為CHB組,AHB患者8例[男4例,女4例,年齡(35.50±3.05)歲]作為AHB 組,健康體檢者12例[男6例,女6例,年齡(25.33±0.26)歲]作為對(duì)照組。診斷符合2005年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)制定《慢性乙型肝炎防治指南》[4]的標(biāo)準(zhǔn),并排除其他肝炎病毒感染及合并自身免疫性、酒精性肝病等。所有操作程序均符合倫理協(xié)會(huì)制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn),且所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

CD4-FITC、CD25-PE、IgG1-FITC、IgG2a-PE和 Optlyse c溶血液,購(gòu)自美國(guó) BECKMAN COULTER公司。Epics XL型流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞;AU5400生化分析儀檢測(cè)肝功能,試劑由日本奧林巴斯公司提供;熒光定量RT-PCR法檢測(cè)血清HBV-DNA,試劑盒由達(dá)安公司提供。ELISA雙抗體夾心法測(cè)定血清中 IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和 TGF-β的含量,試劑盒由武漢博士德公司提供。

1.3 方法

流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞百分率:①采集所有研究對(duì)象的新鮮外周血(EDTA-K2抗凝),設(shè)同型對(duì)照和檢測(cè)管。②檢測(cè)管中加入抗人CD4-FITC/CD25-PE單克隆熒光標(biāo)記的抗體各20 μ L,同型對(duì)照管中加入IgG1-FITC/IgG2a-PE單克隆熒光標(biāo)記的抗體各20 μ L。③分別加入100 μ L新鮮抗凝全血,混勻,室溫下避光放置15 min。④加入 500 μ L Optlyse c溶血液,混勻,室溫下避光放置10 min。⑤加入500 μ L PBS,室溫下避光放置 10 min,1 500 r/min離心5 min后棄上清。再用2 mL PBS洗滌,1 500 r/min 5 min后棄上清。最后加入500 μ L PBS懸浮細(xì)胞,24 h內(nèi)檢測(cè)。用標(biāo)準(zhǔn)微球進(jìn)行光路和流路的校正,利用同型對(duì)照管調(diào)整電壓,上機(jī)計(jì)數(shù)5 000個(gè)淋巴細(xì)胞,使用XL2軟件收獲檢測(cè)管細(xì)胞數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。

AU5400生化分析儀進(jìn)行肝功能檢測(cè),熒光定量RT-PCR法檢測(cè)血清HBV-DNA,ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)細(xì)胞因子。所有操作均嚴(yán)格依照說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 各組一般資料(表1)

表1 一般資料(±s)

表1 一般資料(±s)

組別 例數(shù) 年齡 ALT(U/L)HBV-DNA(copies/L)CHB組 24 35.92±1.52492.15±83.49(5.9±1.4)×107 AHB組 8 35.50±3.05612.24±116.13(1.5±1.0)×107對(duì)照組 12 25.33±0.26 24.33±2.05 -

2.2 各組CD4+CD25+Treg百分率

單因素方差分析顯示,CHB組CD4+CD25+Treg百分率均明顯高于AHB組和正常對(duì)照組(P<0.01)。AHB組與正常對(duì)照組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組外周血CD4+CD25+Treg百分率(±s)

表2 各組外周血CD4+CD25+Treg百分率(±s)

與CHB組比較,＊＊P<0.01。

組別 例數(shù) CD4+CD25+Treg百分率CHB組 24 14.93±0.60 AHB組 8 8.64±0.75＊＊對(duì)照組 12 9.06±0.35＊＊

2.3 CD4+CD25+Treg與HBV-DNA、血清ALT的相關(guān)性

通過pearson相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CHB組和AHB組CD4+CD25+Treg與HBV-DNA之間無明顯相關(guān)性(r=0.232,P=0.276;r=0.34,P=0.409);CHB組和AHB組CD4+CD25+Treg與ALT之間無明顯相關(guān)性(r=0.196,P=0.357;r=-0.368,P=0.369)。

2.4 細(xì)胞因子的測(cè)定

所有檢測(cè)結(jié)果單位為pg/mL。CHB組IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ及 TGF-β水平較正常對(duì)照組明顯升高(P<0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 CHB組和正常對(duì)照組IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和 TGF-β的水平(±s,pg/mL)

表3 CHB組和正常對(duì)照組IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和 TGF-β的水平(±s,pg/mL)

與對(duì)照組比較,＊＊P<0.01。

組別 例數(shù) IL-2 IL-4 IL-10 IFN-γ TGF-β CHB組 24 31.27±3.16＊＊ 52.12±2.65＊＊ 165.78±11.33＊＊ 76.25±1.70＊＊ 10.96±0.83＊＊對(duì)照組 12 14.68±1.77 25.06±2.66 84.49±3.21 43.00±2.92 5.73±0.64

2.5 IL-2、IFN-γ與血清ALT的相關(guān)性

CHB組IL-2、IFN-γ與血清ALT的相關(guān)性:通過pearson相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),CHB組IL-2和IFN-γ分別與血清ALT水平正相關(guān)(r=0.442,P=0.030;r=0.469,P=0.021)。

3 討 論

CD4+CD25+Treg為免疫系統(tǒng)中一類起負(fù)性調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞,約占外周血CD4+T細(xì)胞的5%～10%,由 Sakaguchi等[5]在1995年首次報(bào)道。它涉及臨床多個(gè)領(lǐng)域,包括抑制自身免疫性疾病、移植物抗宿主病,誘導(dǎo)母胎免疫耐受,導(dǎo)致腫瘤、感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展,其主要分子標(biāo)志物有Foxp3、GITR、CTLA-4等。體內(nèi)試驗(yàn)表明,CD4+CD25+T reg可分泌 IL-10和 TGF-β,全面抑制CD4+及CD8+T細(xì)胞的活化[6-7]。目前多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為CD4+CD25+Treg可抑制HBV抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng),與CHB的慢性化有關(guān)。CD4+CD25+Treg在AHB中隨病程發(fā)展而變化,具體表現(xiàn)為,初始期降低,恢復(fù)期上升,痊愈后恢復(fù)正常水平,推測(cè)與不同病程階段CD4+CD25+Treg的功能不同有關(guān)[3]。

T淋巴細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫,根據(jù)功能的不同,可分為輔助性T細(xì)胞(helper T cells,Th)、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。其中,Th分為Th1、Th2、Th3三種亞型。Th1主要分泌 IFN-γ、IL-2、TNF 等細(xì)胞因子,主要促進(jìn)細(xì)胞免疫,但反應(yīng)過度將會(huì)引起組織損傷,亦稱為促炎性T細(xì)胞。Th2主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13等細(xì)胞因子,可增強(qiáng)B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫。Th3分泌大量TGF-β,對(duì)免疫應(yīng)答發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。通常,以IFN-γ和IL-4反映體內(nèi)Th1和Th2水平。Th1/Th2之間的平衡,維持機(jī)體正常的免疫狀態(tài)。

Akpolat N等[8]檢測(cè)30例CHB患者血清中TNF-α、IL-4、IFN-γ、TGF-β含量 ,對(duì)肝組織進(jìn)行活檢后發(fā)現(xiàn),TNF-α、IL-4和 TGF-β水平明顯高于健康對(duì)照組,認(rèn)為 IL-4、TGF-β均與CHB的病情進(jìn)展有關(guān)。Jiang R等[9]采用熒光激活細(xì)胞分類儀分析CHB和正常對(duì)照者的PBMCs中IL-4、TGF-β、IFN-γ的表達(dá),發(fā)現(xiàn) CHB 患者 PBMCs中大部分CD4+T細(xì)胞為Th0,在肝炎活動(dòng)期,Th1明顯增多,而Th2變化不大。他們認(rèn)為,Th1與肝臟炎癥正相關(guān),Th2與HBV持續(xù)感染有關(guān)。Lee M等[10]采用RT-PCR法檢測(cè)CHB患者和正常對(duì)照者 PBMCs的 IL-2、IL-4、IL-10和 IFN-γ的表達(dá),發(fā)現(xiàn)IFN-γ與ALT水平呈正相關(guān)。以上說明,感染HBV后,體內(nèi) Th1/Th2出現(xiàn)失衡,表現(xiàn)為免疫損傷或HBV免疫逃避,Th1占優(yōu)勢(shì),表現(xiàn)為CHB的急性期,Th2占優(yōu)勢(shì),表現(xiàn)為CHB持續(xù)狀態(tài)。

本試驗(yàn)共選取慢性乙型肝炎患者24例,急性乙型肝炎患者8例,正常對(duì)照者12例。慢性乙型肝炎組CD4+CD25+Treg百分率均明顯高于正常對(duì)照組和急性乙型肝炎組,而急性乙型肝炎組與正常對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與田瑛等[11]在2007年的一項(xiàng)研究結(jié)果一致。另外,本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),慢性乙型肝炎組和急性乙型肝炎組 CD4+CD25+T reg百分率與HBV-DNA含量無明顯相關(guān)性,提示乙型肝炎病毒并非疾病慢性化的主要原因。關(guān)于CD4+CD25+T reg與ALT之間的關(guān)系,Lin CY等認(rèn)為肝臟的損傷可增強(qiáng)慢乙肝患者Treg的抑制活性,他們?cè)隗w外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),外周血Treg百分率與血清ALT水平成正比,去除Treg后,血清 ALT較高的患者 HBV特異性CD8+T細(xì)胞的增殖反應(yīng)明顯高于血清ALT較低的患者[12]。但國(guó)內(nèi)外大量研究都指出,外周血CD4+CD25+Tregs頻率與血清ALT水平無相關(guān)性[1,13]。本試驗(yàn)也未發(fā)現(xiàn)外周血CD4+CD25+Tregs頻率與血清ALT之間存在相關(guān)性。

同時(shí),本試驗(yàn)分析了24例慢性乙型肝炎患者和12例正常對(duì)照者的血清,分別檢測(cè)IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ及 TGF-β的水平。結(jié)果表明,CHB 組血清IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ及TGF-β水平均高于正常對(duì)照組,結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-10和TGF-β作為CD4+CD25+Treg分泌的細(xì)胞因子,其升高提示,CD4+CD25+Treg作為抑制性免疫細(xì)胞,通過分泌IL-10和 TGF-β,下調(diào)免疫功能,抑制CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的活化,阻礙HBV的清除,導(dǎo)致乙肝病毒肝炎慢性化的發(fā)生和發(fā)展。Th3、Th2和 Tr1也分泌 IL-10和TGF-β,IL-10和 TGF-β的升高,一定程度上反映Th3、Th2、T r1活躍。IL-4作為 Th2的主要效應(yīng)因子,提示Th2占優(yōu)勢(shì),機(jī)體以體液免疫為主,細(xì)胞免疫功能受到抑制,出現(xiàn)Th1/Th2的失衡。而IL-2及IFN-γ作為炎癥因子,其水平亦較對(duì)照組升高,同時(shí),本實(shí)驗(yàn)比較了CHB組IL-2、IFN-γ分別與血清ALT的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)IL-2和IFN-γ分別與血清ALT水平正相關(guān)(r=0.442,P<0.05;r=0.469,P<0.05),與Priimiagi LS等[14]報(bào)道相符。說明Th1可誘發(fā)肝臟炎癥活動(dòng),同時(shí),體內(nèi)Th2細(xì)胞因子能拮抗Th1細(xì)胞因子的作用,減輕肝臟炎癥反應(yīng),維持HBV慢性化感染。

慢性乙型肝炎患者CD4+CD25+Treg百分率和Th1、Th2細(xì)胞因子均明顯高于正常對(duì)照者,提示慢性乙型肝炎患者存在免疫紊亂,CD4+CD25+Treg和 Th1/Th2失衡均與其慢性化有關(guān)。但是,CD4+CD25+Treg和Th1/Th2失衡在HBV感染慢性化過程中的具體機(jī)制仍未完全明確,本研究亦未對(duì)CHB患者抗病毒治療前后的CD4+CD25+Treg百分率和Th1、Th2細(xì)胞因子水平進(jìn)行分析,有待進(jìn)一步研究,為慢性乙型肝炎的臨床免疫治療提供更多的依據(jù)。

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