洪 梅,孫文靜,畢 昱

(解放軍532醫(yī)院,安徽黃山,245000)

三七總皂苷(PNS)是中藥三七中有效成分, 研究表明其具有調(diào)節(jié)免疫、抗纖維化、抗感染、降低心肌耗氧量、擴(kuò)張血管、清除自由基、抑制血小板凝集等藥理學(xué)作用[1]。本試驗(yàn)以BCG加LPS誘導(dǎo)小鼠免疫性肝損傷模型,研究PNS對(duì)其的保護(hù)作用,為PNS在臨床進(jìn)一步應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

三七總皂苷,含量>98%,南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司;聯(lián)苯雙酯(biphenyldicarboxylate,BP),北京協(xié)和藥廠;醫(yī)用卡介苗(bacillus calmette guein,BCG),衛(wèi)生部上海生物制品研究所;脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),美國(guó)Sigma公司;ALT 、AST 、SOD、MDA 、GSH-Px 試劑盒 ,南京建成生物工程研究所;TNF-α、IL-1β試劑盒,北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司;兔抗鼠TGF-β1、NF-κ B單克隆抗體、DAB顯色試劑,武漢博士德生物工程有限公司;T RIZOL Reagent試劑,美國(guó)Invitrogen life technologies公司;Reverse Transcription System逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒,加拿大Fermentas公司。

1.2 動(dòng)物

昆明種小鼠,雄性,體質(zhì)量18～22 g,由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào):SCXK(蘇)2008-0004。自由攝食和飲水,保持室內(nèi)溫度18～22℃,相對(duì)濕度40%～60%。

1.3 儀器與設(shè)備

電子天平JT12001,上海精天電子儀器廠;全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)GL20A,湖南儀器儀表總廠離心機(jī)廠;722S分光光度計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司;電子顯微鏡XDS-1B,重慶光電儀器總公司;Hema18R冷凍離心機(jī)、壓縮機(jī)制冷式基因擴(kuò)增儀、GSG2000核酸/蛋白凝膠圖像分析管理系統(tǒng),珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 模型制備[2]:昆明種小鼠,雄性,體質(zhì)量18～22 g,隨機(jī)分為正常組、模型組、PNS 100、200、400 mg/kg組、陽性藥物組(聯(lián)苯雙酯 150 mg/kg),每組15只,造模第1天除正常組外,其余各組每只小鼠尾部靜脈注射(iv)BCG 12.5 mg/mL(約含5×107個(gè)活菌數(shù)),各治療組ig給予相應(yīng)藥物;正常組和模型組ig給予等容積溶媒,連續(xù)10 d。第10天,除正常組iv給予等容積溶媒外,其余各組每只小鼠iv LPS 37.5 μ g/mL。注射后禁食16 h,自小鼠后眼眶靜脈叢采血,頸椎脫臼處死小鼠,稱取脾臟、肝臟重量計(jì)算臟器指數(shù)。

1.4.2 血清ALT 、AST 、TNF-α、IL-1β 含量測(cè)定 :常規(guī)制備血清標(biāo)本,按照試劑盒說明書測(cè)定ALT 、AST 、TNF-α、IL-1β 含量 。

1.4.3 肝組織勻漿MDA、SOD、GSH-Px含量測(cè)定:取肝臟左葉少許,冰生理鹽水沖洗、濾紙吸濕后,在相同部位精確稱取0.3 g,加入預(yù)冷的生理鹽水,在冰水中制成10%的勻漿,4℃3 000 r/min離心15 min,提取上清液,按照試劑盒說明書測(cè)定SOD、MDA 、GSH-Px含量 。

1.4.4 HE染色法肝組織病理學(xué)檢查:取肝右葉相同部位,大小約1 cm×1 cm×0.5 cm的肝組織小塊,放入 10%甲醛溶液中固定,然后脫水,透明,石蠟包埋,做常規(guī)HE染色,光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.4.5 免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)肝臟TGF-β1、NF-κ B的表達(dá):肝組織用10%甲醛固定,石蠟包埋,4 μ m連續(xù)切片,采用檸檬酸鈉緩沖液熱抗原修復(fù);SP免疫組織化學(xué)染色,蘇木素對(duì)比染色;已知陽性切片;陰性對(duì)照:用PBS代替一抗陰性對(duì)照的方法,檢測(cè)肝組織中 TGF-β1、NF-κ B的表達(dá)。

1.4.6 RT-PCR測(cè)定肝組織TNF-amRNA表達(dá):取100 mg小鼠肝臟組織,采用 TRIzol法抽提RNA,總反應(yīng)體系20 μ L,42 ℃水浴1 h,合成第一鏈cDNA。取上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μ L作為反應(yīng)模板 ,反應(yīng)體系為 25 μ L。 TNF-a Forward:5′-CTAGTACCGAGATGTGGAACTGGC-3′;Reverse:5′-CTGGCTCAGCCACTCCAGC-3′。擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5 min,94℃變性40 s,58℃退火40 s,72℃延伸1 min,33個(gè)循環(huán),再72℃延伸 10 min,4 ℃保存 。β-action Forward:5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′;Forward:5′-ACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′。擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5 min,94℃變性40 s,51℃退火40 s,72℃延伸1 min,32個(gè)循環(huán),再72 ℃延伸 10 min,4℃保存。以5 μ L PCR產(chǎn)物在凝膠上電泳,攝像,存入計(jì)算機(jī),并作圖像分析。

2 結(jié) 果

2.1 三七總皂苷對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響

與正常組相比,模型組小鼠肝、脾系數(shù)明顯高于正常組(P<0.01);三七總皂苷高、中劑量組和聯(lián)苯雙酯組均有抑制肝脾增大的作用,與模型組對(duì)比差異顯著(P<0.05或者P<0.01),結(jié)果見表1。

表1 三七總皂苷對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響(±s,n=10)

表1 三七總皂苷對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響(±s,n=10)

與正常組比較,△△P<0.01;與模型組比較,＊P<0.05,＊＊P<0.01。

組別 劑量(mg/kg)肝指數(shù)(mg/10 g)脾指數(shù)(mg/10 g)正常組 - 551.35±60.40 53.95±4.95模型組 - 704.72± 90.94△△ 101.64±19.27△△三七總皂苷組 100 629.13±83.05 89.12±22.24 200 612.49± 89.18＊ 84.70±13.45＊400 600.13±109.10＊＊ 81.64±15.75＊＊聯(lián)苯雙酯組 150 603.72±74.78＊ 83.58±16.17＊

2.2 對(duì)小鼠血清ALT、AST含量的影響

與正常組相比較,模型組小鼠血清ALT、AST水平明顯升高(P<0.01);三七總皂苷各劑量組和聯(lián)苯雙酯組均能顯著降低小鼠血清中升高的ALT、AST活性,與模型組比較有顯著性差異(P<0.05或P<0.01),提示三七總皂苷對(duì)免疫性肝損傷小鼠具有保護(hù)作用,結(jié)果見表2。

表2 三七總皂苷對(duì)血清ALT、AST含量的影響(±s,n=10)

表2 三七總皂苷對(duì)血清ALT、AST含量的影響(±s,n=10)

與正常組比較,△△P<0.01;與模型組比較,＊P<0.05,＊＊P<0.01。

組別 劑量(mg/kg)ALT(U/L)AST(U/L)正常組 - 44.65±10.99 50.55±8.38模型組 - 81.85±22.59△△ 99.15±20.50△△三七總皂苷組 100 64.35±17.21＊ 80.50±18.33＊200 62.65±21.41＊ 79.35±24.63＊400 59.80±13.76＊＊ 76.80±20.27＊聯(lián)苯雙酯組 150 57.55±18.61＊＊ 74.70±19.28＊＊

2.3 對(duì)小鼠肝組織MDA、SOD、GSH-Px的影響

與正常組比較,模型組小鼠血清MDA水平均顯著升高,SOD、GSH-Px水平顯著下降;與模型組比較,三七總皂苷低、中、高劑量組能顯著降低免疫性肝損傷小鼠升高的MDA水平,升高其低下的SOD、GSH-Px水平,表明三七總皂苷通過提高機(jī)體抗脂質(zhì)過氧化能力對(duì)免疫性肝損傷小鼠起保護(hù)作用,結(jié)果見表3。

表3 三七總皂苷對(duì)小鼠肝組織MDA、SOD、GSH-Px含量的影響(±s,n=10)

表3 三七總皂苷對(duì)小鼠肝組織MDA、SOD、GSH-Px含量的影響(±s,n=10)

與正常組比較,△△P<0.01;與模型組比較,＊P<0.05,＊＊P<0.01。

組別 劑量(mg/kg) SOD(U/mg·prot) MDA(nmol/mg·port) GSH-PX(U/mg·prot)正常組 - 144.81±19.39 5.93±1.57 242.34±32.36模型組 - 100.87±24.07△△ 9.64±2.47△△ 161.64±19.53△△三七總皂苷組 100 124.28±22.23＊ 7.79±2.11＊ 192.40±36.31＊200 125.98±24.44＊ 7.69±1.58＊ 197.19±20.77＊400 132.32±25.66＊＊ 7.29±2.40＊ 205.80±36.19＊＊聯(lián)苯雙酯組 150 129.05±27.96＊ 7.45±1.77＊ 216.87±39.36＊＊

2.4 對(duì)小鼠血清TNF-α、IL-1β的影響

與正常組比較,模型組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平均顯著升高;與模型組比較,三七總皂苷低、中、高劑量組及聯(lián)苯雙酯組均能顯著降低肝損傷小鼠升高的TNF-α、IL-1β水平,表明三七總皂苷對(duì)免疫性肝損傷小鼠具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生有關(guān),結(jié)果見表4。

2.5 對(duì)小鼠肝組織病理學(xué)的影響

表4 三七總皂苷對(duì)小鼠肝組織TNF-α、IL-1β含量的影響(±s,n=10)

表4 三七總皂苷對(duì)小鼠肝組織TNF-α、IL-1β含量的影響(±s,n=10)

與正常組比較,△△P<0.01;與模型組比較,＊P<0.05,＊＊P<0.01。

組別 劑量(mg/kg)TNF(μ g/L)IL(μ g/L)正常組 - 1.76±0.43 4.00±0.81模型組 - 3.42±1.02△△ 5.91±1.07△△三七總皂苷組 100 2.73±0.62＊ 4.93±1.10＊200 2.27±0.75＊ 4.88±1.11＊400 2.51±0.77＊＊ 4.84±1.14＊聯(lián)苯雙酯組 150 2.42±0.68＊＊ 4.87±0.99＊

正常組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,肝細(xì)胞核大而圓,核膜清晰,核仁明顯,胞質(zhì)豐富,匯管區(qū)無炎性細(xì)胞浸潤(rùn),結(jié)構(gòu)清晰可見(圖1.A);模型組肝細(xì)胞呈較廣泛的嗜酸性壞死,肝細(xì)胞腫脹較明顯,有炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1.B),表明模型復(fù)制成功;聯(lián)苯雙酯組仍有部分嗜酸性病變,水樣改變、炎細(xì)胞浸潤(rùn)減輕(圖1.F);PNS不同劑量組有個(gè)別嗜酸性病變細(xì)胞,水樣改變基本消失,大部分肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常(圖 1.C 、D、E)。

2.6 對(duì)血清 TGF-β1、NF-κ B 表達(dá)的影響

與正常組相比,模型組小鼠肝組織 TGF-β1、NF-κ B在胞質(zhì)、胞核廣泛大量表達(dá);與模型組相比,三七總皂苷低、中、高各劑量組小鼠肝組織TGF-β1 、NF-κ B 表達(dá)量明顯下 降,其中高劑量組肝組織完好,結(jié)果分別見圖2、圖3。

A.正常組;B.模型組;C.三七總皂苷(100 mg/kg)組;D.三七總皂苷(200 mg/kg)組;E.三七總皂苷(400 mg/kg)組;F.聯(lián)苯雙酯(150 mg/kg)組

A.正常組;B.模型組;C.三七總皂苷(100 mg/kg)組;D.三七總皂苷(200 mg/kg)組;E.三七總皂苷(400 mg/kg)組;F.聯(lián)苯雙酯(150 mg/kg)組

2.7 對(duì)肝組織TNF-amRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果分析顯示,模型組大鼠肝臟TNF-amRNA的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組,而三七總皂苷干預(yù)組TNF-amRNA的表達(dá)顯著下降,結(jié)果見圖4。

圖4 三七總皂苷對(duì)免疫性肝損傷小鼠肝組織中TNF-amRNA表達(dá)的影響

3 討 論

BCG+LPS誘導(dǎo)的免疫性肝損傷小鼠是廣泛應(yīng)用于肝病防治藥物篩選的經(jīng)典模型[3-4]。其機(jī)制為:預(yù)先給小鼠注射BCG可使多核中粒細(xì)胞或巨噬細(xì)胞聚集于肝,繼后再用低劑量LPS攻擊注射,可激發(fā)這些細(xì)胞釋放對(duì)肝細(xì)胞有毒性作用動(dòng)物多種免疫效應(yīng)分子,如氧自由基、細(xì)胞因子等,這些分子的過度釋放,可引發(fā)免疫性肝損傷[5]。

肝臟是含酶豐富的臟器,肝臟出現(xiàn)任何原因?qū)е碌母谓M織損傷或細(xì)胞破壞、壞死時(shí),酶從細(xì)胞內(nèi)逸出進(jìn)入血液,血清中ALT、AST活性將明顯升高。因此,血清ALT、AST的升高是肝損傷的重要標(biāo)志,轉(zhuǎn)氨酶在一定程度上反映了肝細(xì)胞損害和壞死程度[6-7]。與正常組比較,模型組小鼠血清中AST和ALT活力升高,肝細(xì)胞受到明顯損傷;而經(jīng)PNS治療后,各劑量組均可不同程度的降低肝損傷小鼠血清AST、ALT的升高,以上結(jié)果提示PNS對(duì)小鼠免疫性肝損傷具有良好的保護(hù)作用。同時(shí),病理組織學(xué)檢查顯示,正常對(duì)照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰,肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)則;模型組小鼠肝臟組織出現(xiàn)充血、腫大,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肝細(xì)胞出現(xiàn)大片嗜酸性病變,表明免疫性肝損傷模型復(fù)制成功。PNS不同劑量組有個(gè)別嗜酸性病變細(xì)胞,水樣改變基本消失,大部分肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常。

脂質(zhì)過氧化在免疫性肝損傷的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物,其含量與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)呈正比;而作為抗氧化酶系統(tǒng)主要物質(zhì)之一的SOD含量高低反映了機(jī)體清除氧自由基的能力;GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶,一般認(rèn)為它在細(xì)胞內(nèi)能清除有害的過氧化物代謝產(chǎn)物,阻斷脂質(zhì)過氧化鏈鎖反應(yīng),從而起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用[8-9]。試驗(yàn)結(jié)果表明三七總皂苷可明顯降低免疫性肝損傷小鼠升高的MDA水平,升高肝臟中降低的SOD、GSH-Px活力,表明PNS對(duì)免疫性肝損傷具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與提高機(jī)體脂質(zhì)過氧化功能有關(guān)。

細(xì)胞因子NF-κ B可誘導(dǎo)與免疫和炎癥有關(guān)的多種基因的轉(zhuǎn)錄,這些基因編碼的蛋白包括有TNF-α、IL-1β細(xì)胞因子以及單核細(xì)胞趨化蛋白-1。TNF-α是參與特異性和非特異性免疫肝臟損傷的重要介質(zhì),主要是由活化單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子,能夠增強(qiáng)T、B淋巴細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞的活性,TNF-α產(chǎn)量增加,刺激機(jī)體產(chǎn)生IL-1。綜上所述PNS對(duì)免疫性肝損傷小鼠具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與通過下調(diào)NF-κ B的表達(dá)、抑制細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的分泌有關(guān)[10]。

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