朱鳳臣 蔣電明 祁小桐 李維朝 （重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科,重慶 400016）

低劑量LPS對(duì)PC12細(xì)胞抗氧化能力的影響

朱鳳臣 蔣電明 祁小桐 李維朝 （重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科,重慶 400016）

目的:探討低劑量脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）對(duì)PC12細(xì)胞抗氧化能力的影響。方法:分別以濃度為0、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1μg/μl的LPS刺激PC12細(xì)胞24小時(shí),MTT法檢測細(xì)胞活性確立對(duì)細(xì)胞沒有毒性作用的安全劑量;采用安全劑量刺激PC12細(xì)胞24小時(shí),收集培養(yǎng)基上清和細(xì)胞,采用試劑盒檢測上清中的總抗氧化能力（T-AOC）,細(xì)胞中超氧化物歧化酶（SOD）的表達(dá),Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白的表達(dá);流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）、鈣離子（Ca2+）的平均熒光強(qiáng)度。結(jié)果:LPS濃度小于0.1μg/μl對(duì)細(xì)胞沒有明顯毒性作用（P＞0.05）;采用 0、0.01、0.025、0.05、0.1μg/μl LPS分別刺激PC12細(xì)胞24小時(shí),培養(yǎng)上清中T-AOC呈下降趨勢,以0.05、0.1μg/μl組明顯（P＜0.01）,細(xì)胞內(nèi)SOD呈上升趨勢（0.05μg/μl組,P＜0.05;0.1μg/μl組,P＜0.01）,細(xì)胞內(nèi)Bcl-2表達(dá)逐漸升高（0.025～ 0.1μg/μl組,P＜0.01）,細(xì)胞內(nèi) ROS 呈下降趨勢（0.1μg/μl組,P＜0.01）,鈣離子未見明顯變化（P＞0.05）。結(jié)論:低劑量LPS處理PC12 24小時(shí)具有劑量依賴性增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力,并可能藉此參與應(yīng)激耐受。

LPS;PC12細(xì)胞;抗氧化能力;應(yīng)激耐受

低劑量LPS可以顯著減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷程度,改善預(yù)后[1,2],這提示低劑量的LPS可能激活抗氧化機(jī)制,保護(hù)細(xì)胞免于氧化應(yīng)激的損傷,本實(shí)驗(yàn)以低劑量LPS刺激PC12細(xì)胞,觀察培養(yǎng)基上清中TAOC,細(xì)胞內(nèi)SOD、Bcl-2及ROS、Ca2+的表達(dá),初步探討神經(jīng)系統(tǒng)疾病炎癥過程中應(yīng)激耐受的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及來源 LPS（E.coli055:B5）,二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽（MTT）、2′-7′-二氯熒光乙酰乙酸鹽（DCFH-DA）、鈣離子負(fù)載劑Fluo-3/AM（Sigma公司）,Bcl-2抗體（Santa Cruz公司）,β-actin 抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）,總抗氧化能力測定試劑盒、超氧化物歧化酶測試盒（南京建成生物工程研究所）,BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）,RPM I1640培養(yǎng)液、新生牛血清、馬血清（Hyclone公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞株由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。將復(fù)蘇后的PC12細(xì)胞株接種于含有10%新生牛血清、5%馬血清、青霉素和鏈霉素各100 U/ml的RPMI1640培養(yǎng)液中,放置于37℃、5%CO2條件下孵箱培養(yǎng)。細(xì)胞鋪滿瓶底70%～80%時(shí),用消化液（含0.25%的胰蛋白酶）消化1分鐘左右,按1∶3傳代,隔天換液,培養(yǎng) 3代后用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞活力測定（MTT法） 將消化重懸的PC12細(xì)胞調(diào)整至濃度為2.0×105ml-1,按每孔200 μl接種于96孔板中,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)16～18小時(shí)至細(xì)胞貼壁,棄上清,加入用完全培養(yǎng)基配制的 LPS,使各組的濃度分別為0、0.01、0.025、0.05、0.1 、0.25、0.5、1 μg/μl,每組6 孔,繼續(xù)培養(yǎng)24 小時(shí) ,每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl,37℃孵育4小時(shí),棄上清,加入 150μl DMSO振蕩均勻,酶標(biāo)儀上檢測波長490 nm處吸光度值（OD值）,分析各組間OD值的變化。

1.2.3 培養(yǎng)基上清中T-AOC和細(xì)胞內(nèi)SOD的檢測PC12細(xì)胞按每瓶2.0×105ml-1傳代,細(xì)胞鋪滿瓶底70%～80%時(shí),更換為含上述不同濃度LPS的完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí),收集培養(yǎng)基上清和細(xì)胞,立即凍存于-80℃冰箱。按試劑盒說明書操作,檢測上清中的T-AOC和細(xì)胞內(nèi)的SOD。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)Bcl-2的檢測 將上述不同濃度LPS刺激24小時(shí)的PC12細(xì)胞提取蛋白,BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度,各取20μg總蛋白,經(jīng)10%SDS-PAGE電泳,Bio-Rad Western印跡分析儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫下封閉2小時(shí),一抗（Bcl-2抗體或β-actin抗體）4℃過夜,二抗孵育2小時(shí),加入ECL發(fā)光試劑,Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)對(duì)PVDF膜條帶行灰度值測定,分析各劑量組的相對(duì)灰度值（Bcl-2/β-actin）。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)ROS和鈣離子的檢測 采用不含EDTA的消化液收集上述不同濃度LPS刺激的PC12細(xì)胞,并用無血清培養(yǎng)基重懸,分別加入DCFH-DA、Fluo-3/AM處理細(xì)胞,使其終濃度均為10μmol/L,37℃避光孵育30分鐘,用PBS清洗2遍,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度（每個(gè)樣品收集1×104個(gè)細(xì)胞,用CellQuest軟件分析結(jié)果）。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的LPS對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響 為研究PC12的抗氧化機(jī)制,首先要排除藥物對(duì)細(xì)胞毒性作用的干擾,本實(shí)驗(yàn)分別用不同濃度的LPS處理PC12細(xì)胞24小時(shí),MTT法檢測LPS對(duì)細(xì)胞活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)LPS濃度小于0.1μg/μl時(shí)對(duì)細(xì)胞沒有明顯毒性作用（P＞0.05）,而隨濃度的增大（＞0.1μg/μl）,細(xì)胞的活性明顯下降（P＜0.01,見圖1）。

2.2 不同濃度LPS對(duì)PC12細(xì)胞培養(yǎng)基上清T-AOC及細(xì)胞內(nèi)SOD的影響 結(jié)果顯示,不同濃度LPS處理PC12 24小時(shí),培養(yǎng)基上清的T-AOC呈下降趨勢,其中 0.05、0.1μg/μl組與其他各組比較差異顯著（P＜0.01）。細(xì)胞內(nèi)SOD水平呈上升趨勢,其中0.05 μg/μl與空白組、0.01μg/μl比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,0.1μg/μl組與其他各組比較差異顯著（P＜0.01,見表1）。

2.3 不同濃度LPS對(duì)PC12細(xì)胞Bcl-2的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,采用不同濃度的LPS處理PC12細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)Bcl-2呈上升趨勢,0.025、0.05μg/μl組Bcl-2表達(dá)明顯高于空白組、0.01μg/μl組（P＜0.01）,0.1 μg/μl組比其他各組均要高（P＜0.01,見圖2）。

圖1 不同濃度LPS對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響（±s,n=6）Fig.1 The effects on the viability of PC12 cellswith different concentrations of LPS（±s,n=6）

表1 不同濃度 LPS對(duì)PC12培養(yǎng)基上清 T-AOC、細(xì)胞內(nèi)SOD影響（n=4,±s）Tab.1 The effects on T-AOC in culture supernatant and SOD in PC12 cellswith different concentrations of LPS（n=4,±s）

表1 不同濃度 LPS對(duì)PC12培養(yǎng)基上清 T-AOC、細(xì)胞內(nèi)SOD影響（n=4,±s）Tab.1 The effects on T-AOC in culture supernatant and SOD in PC12 cellswith different concentrations of LPS（n=4,±s）

Note:Compared with othergroups,1）P＜0.01;Comparedwith controlgroups and 0.01μg/μl group,2）P ＜0.05.

LPS（μg/μl） T-AOC（U/m l） SOD（U/m l）8.281±0.223 3.402±0.252 0.010 8.232±0.355 3.440±0.153 0.025 8.081±0.125 3.600±0.115 0.050 7.190±0.1041） 3.838±0.0632）0.100 6.230±0.2101） 4.453±0.3431）0

圖2 不同濃度LPS對(duì)PC12細(xì)胞Bcl-2的影響（±s,n=3）Fig.2 The effects on Bcl-2 of PC12 cells with different concentrations of LPS（±s,n=3）

表2 不同濃度LPS對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)ROS和 Ca2+的影響（±s,n=4）Tab.2 The effects on ROS and Ca2+in PC12 cells with different concentrations of LPS（±s,n=4）

表2 不同濃度LPS對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)ROS和 Ca2+的影響（±s,n=4）Tab.2 The effects on ROS and Ca2+in PC12 cells with different concentrations of LPS（±s,n=4）

Note:Compared with other groups,1）P＜0.01.

LPS（μg/μl） ROS fluorescence intensity Ca2+fluorescence intensity 48.53±4.27 16.40±0.93 0.010 48.71±3.69 16.49±0.59 0.025 46.29±4.41 16.26±0.61 0.050 45.99±4.77 16.49±0.76 0.100 34.91±3.101） 16.64±1.09 0

2.4 不同濃度LPS對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)ROS和Ca2+的影響 采用不同劑量低濃度LPS干預(yù)PC12細(xì)胞24小時(shí)發(fā)現(xiàn),細(xì)胞內(nèi)ROS平均熒光強(qiáng)度未見明顯上升趨勢,0.1μg/μl組反而有下降趨勢（P＜0.01）。細(xì)胞內(nèi)Ca2+平均熒光強(qiáng)度未發(fā)生明顯變化（P＞0.05,見表2）。

3 討論

LPS是革蘭氏陰性菌的胞壁的主要成分,是常用的致炎因子。隨著上世紀(jì)50年代“內(nèi)毒素耐受”現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn),人們認(rèn)識(shí)到LPS可以激活細(xì)胞內(nèi)源性的保護(hù)機(jī)制,抵抗后繼打擊[3]。低劑量LPS可以減輕腦缺血再灌注損傷,減少炎癥反應(yīng),改善預(yù)后,甚至可以減輕腦損傷、脊髓損傷的程度[1,4-8]。研究發(fā)現(xiàn),LPS可以激活神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的N rf2、HO-1、SOD、NQO1等抗氧化基因抵抗氧化應(yīng)激[9-11]。本實(shí)驗(yàn)采用低劑量LPS刺激PC12細(xì)胞,觀察其對(duì)PC12細(xì)胞抗氧化機(jī)制的影響,初步探討抗氧化機(jī)制在神經(jīng)細(xì)胞炎癥過程中應(yīng)激耐受的作用。

PC12細(xì)胞是一種常用于體外實(shí)驗(yàn)的神經(jīng)細(xì)胞株,Hillion等[12]認(rèn)為PC12可以作為神經(jīng)元細(xì)胞耐受的細(xì)胞模型進(jìn)行大通量的實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)采用低劑量的LPS刺激PC12細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)PC12細(xì)胞有較強(qiáng)的內(nèi)毒素耐受性,大于0.1μg/μl的LPS才對(duì)其產(chǎn)生明顯毒性作用,與Omata等[11]研究結(jié)果（0.5μg/μl）存在出入,其原因主要考慮是培養(yǎng)條件的不同引起。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),低劑量LPS刺激PC12 24小時(shí)培養(yǎng)基上清中的T-AOC隨LPS的劑量的升高而降低,而細(xì)胞內(nèi)的SOD卻呈上升趨勢,說明PC12消耗了培養(yǎng)基中的抗氧化物質(zhì),同時(shí)合成抗氧化酶類或蛋白,保護(hù)細(xì)胞免于氧化應(yīng)激的損傷。另外,檢測的24小時(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS發(fā)現(xiàn),細(xì)胞內(nèi)ROS隨LPS劑量的增加保持平穩(wěn)甚至降低的趨勢,說明低劑量LPS激活的抗氧化應(yīng)激機(jī)制的確在發(fā)揮作用。

線粒體是ROS產(chǎn)生的主要場所,也是細(xì)胞內(nèi)部最受ROS損傷的細(xì)胞器,對(duì)細(xì)胞凋亡具有重要的意義。Bcl-2定位于線粒體外膜上,維持線粒體膜的完整性,并且發(fā)揮抗氧化及抑制Ca2+釋放等作用,發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用[13]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),低劑量LPS作用24小時(shí),細(xì)胞內(nèi)Bcl-2隨劑量呈上升趨勢,提示低劑量LPS促進(jìn)Bcl-2的合成發(fā)揮保護(hù)作用。Ca2+是細(xì)胞凋亡的始動(dòng)因素,也是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),低劑量LPS刺激下PC12細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度沒有發(fā)生明顯變化,提示低劑量的LPS刺激下PC12細(xì)胞能夠利用抗氧化、抗凋亡機(jī)制保護(hù)細(xì)胞免于損傷[14]。

炎癥過程中的氧化應(yīng)激及抗氧化機(jī)制逐漸被人們認(rèn)識(shí),抗氧化機(jī)制對(duì)炎癥的預(yù)后具有重要的意義[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,低劑量LPS可以激活神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的抗氧化應(yīng)激機(jī)制,發(fā)揮氧化應(yīng)激耐受,保護(hù)細(xì)胞免于損傷。研究炎癥反應(yīng)中的抗氧化應(yīng)激機(jī)制將助于揭示神經(jīng)系統(tǒng)疾病炎癥反應(yīng)的病理機(jī)制,尋找干預(yù)損傷-修復(fù)的途徑。

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[收稿2010-12-08 修回2011-01-10]

（編輯 張曉舟）

The effects of low-dose LPS on the anti-oxidant capacity of PC12 cells

ZHUFeng-Chen,JIANGDian-Ming,QIXiao-Tong,LIWei-Chao.DepartmentofOrthopaedics,theFirstAffiliatedHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China

Objective:To investigate the effects of low-dose LPS on anti-oxidant capacity in PC12 cells.Methods:Stimulating PC12 cellsw ith various concentrations of LPS（0,0.01,0.025,0.05,0.1,0.25,0.5,1μg/μl）for 24 h,MTTassaywas conducted to establish safe doses for cell viability.Non-lethal doses of LPSwereused to dealwith PC12 cells for24h,the culture supernatantand cellswere collected.The total anti-oxidant capacity in culture supernatantand superoxide dismutase in cellswere detected with assay kits.The intracellular Bcl-2 protein expressionswere detected with Western-b lot,and the average fluorescence intensity of ROS and calcium were tested with flow cytometry.Results:Less than 0.1μg/μl LPS concentration had no toxicity for cell activity（P＞0.05）.Stimulating PC12 cellswith different concentrationsof LPS（0,0.01,0.025,0.05,0.1μg/μl）,the T-AOC decreased significantly,especially in 0.05μg/μl and 0.1μg/μl groups（P＜0.01）and the intracellular SOD increased（0.05μg/μlgroup,P＜0.05;0.1μg/μl group,P＜0.01）.The Bcl-2 exp ressions in PC12 cells increased gradually（0.025-0.1μg/μl group,P＜0.01）.The intracellular ROS decreased（0.1μg/μl group,P＜0.01）,but there was no significant changes in calcium（P＞0.05）.Conclusion:Low-dose LPS increases PC12 cells'anti-oxidant capacity at 24 h in a dose-dependentmanner,and that probably participates in stress tolerance.

LPS;PC12 cells;Antioxidant capacity;Stress tolerance

R392

A

1000-484X（2011）05-0430-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.05.011

朱鳳臣（1979年-）,男,在讀博士,主要從事脊髓損傷、骨科炎癥方面的研究,E-mail:zfc1008@hotmail.com;

及指導(dǎo)教師:蔣電明（1957年-）,男,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事骨科生物材料、脊髓損傷及周圍神經(jīng)移植等方面的研究,E-mail:jdm571026@vip.163.com。