蘇建明 倪海祥 黃 琦 朱 鋒

浙江省中醫(yī)院（浙江杭州310006）

糖尿病腎?。―N）特征性的病理改變是細胞外基質（ECM）在腎小球、腎小管積聚導致腎小球硬化和腎間質纖維化［1］，而ECM的堆積是由于ECM產生過多和降解減少所致?；|金屬蛋白酶及其組織抑制因子表達和活性的改變，與ECM堆積關系密切。基質金屬蛋白酶9（MMP-9）參與血管基底膜主要結構成分-Ⅳ型膠原（Col-Ⅳ）的降解，與DN的關系密切［2-3］。本實驗采用免疫組織化學方法對糖尿病時腎組織MMP-9和Col-Ⅳ表達改變進行研究，并用人參皂苷進行干預，以探討期防治DN的作用和可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 動物：健康雄性SPF級SD大鼠100只，12周齡，體質量（300±20）g，購自中國科學院上海實驗動物中心，由浙江中醫(yī)藥大學SPF動物房飼養(yǎng)。試藥：人參皂苷，由浙江省中醫(yī)院制劑科提供；鏈脲佐菌素（STZ），美國Sigma公司；一抗，鼠抗人（MMP-9 和 Col-Ⅳ）抗體；二抗，羊抗鼠抗體；MMP-2、Col-Ⅳ，均購自北京中山生物制品有限公司。

1.2 模型制備 隨機留取正常對照組18只，其余隨機36只大鼠禁食過夜后，按70mg/kg，左下腹腔內一次性注射1%STZ溶液 （pH 4.5的0.1mol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液在冰浴中新鮮配制）。注射后72h，用血糖儀測定尾尖血血糖，血糖≥16.7mmol/L的大鼠判定為糖尿病大鼠。

1.3 分組與給藥 將模型大鼠隨機分為模型組（18只）和人參皂苷組（18只）。人參皂苷組灌胃人參皂苷0.5g/kg（溶于10%纖維素鈉溶液），模型組和正常對照組灌胃等量生理鹽水。每日2次。

1.4 標本采集 每周用血糖儀測尾尖血血糖，稱體質量，并計算水和食物的攝入量。至實驗第2、4、8周時每組各取6只大鼠留取尿液，苯巴比妥麻醉后行股動脈放血處死，留取股動脈血并取右腎稱質量。右腎與體質量的比值作為腎臟肥大程度的指標。尿液用于測定尿肌酐、尿白蛋白測定，并用尿白蛋白與尿肌酐比值作為臨床腎損害的指標。股動脈血用于測定血糖、C肽、肌酐。

1.5 標本處理與免疫組化染色 大鼠腎臟經10%甲醛固定，梯度乙醇逐步脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片（厚2μm）。石蠟切片經二甲苯脫蠟后作PAS染色、HE染色以及MMP-2、Col-Ⅳ免疫組化染色，E法。一抗均為鼠抗人（MMP-9和Col-Ⅳ）抗體，二抗為羊抗鼠抗體，MMP-9的工作滴度為1∶80，Col-Ⅳ工作滴度為1∶100。每次實驗均設PAS（空白對照）和正常兔血清取代一抗（陰性對照）。光鏡觀察腎組織病變與MMP-9、Col-Ⅳ的分布，免疫組化染色以細胞漿膜或間質有棕黃色顆?；蚓€狀沉積為陽性，否則為陰性。MMP-9、Col-Ⅳ定量均采HPIAS-21000型高清晰度彩色病理圖文報告分析系統(tǒng)在高倍鏡下計算其陽性面積百分比（%），每張切片選取10個視野，求平均值。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，多樣本均數(shù)的兩兩比較采用單因素方差分析，如果方差齊采用LSD，方差不齊采用Tamhane’sT2。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 一般情況 STZ注射72h后，大鼠的血糖均≥16.7mmol/L，并逐漸出現(xiàn)多飲、多尿、多食，體質量增長緩慢等糖尿病癥狀。與正常對照組相比，血糖、腎臟肥大指數(shù)均升高，體質量、C肽顯著下降，尿白蛋白排泄量有升高，但無統(tǒng)計學意義。人參皂苷治療對體質量、腎臟肥大、尿白蛋白排泄有改善作用，但與模型組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表 1；但其對血糖、血脂作用明顯，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與國內外相關研究結論一致［4-6］。見表2。

2.2 病理組織變化 HE染色下腎臟結構清楚，細胞核呈藍色，胞漿呈粉紅色。PAS染色下正常對照組未見明顯的腎小球系膜增生及基底膜增厚，模型組8周時可見腎小球系膜輕度增生、腎小管輕度顆粒樣變、基底膜輕度增厚，但未見腎小球結節(jié)樣增生和動脈玻璃樣變性等典型的糖尿病腎臟改變，人參皂苷組上述病變程度更輕。模型大鼠腎組織MMP-9的組織定位MMP-9抗原免疫組化染色示棕黃色或深棕黃色，主要表達在大鼠腎小球系膜細胞、內皮細胞、包曼氏囊壁層上皮細胞、腎小管上皮細胞，偶見浸潤的巨噬細胞和中性粒細胞表達。

表1 各組大鼠一般情況比較 （±s）

表1 各組大鼠一般情況比較 （±s）

與正常對照組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與模型組比較，△P＜0．05，△△P＜0．01。 下同。

組 別C肽正常對照組（n=6）2周4周體質量（g）227．6±43．9 267．8±47．6肥大指數(shù)（g/kg）3．8±0．12 3．7±0．51（ng/L）2．26±0．55 2．50±0．56 8 周 294．5±66．8 3．2±0．182．60±0．73 0．97±0．09*尿白蛋白肌酐（μg/mg）1．95±0．50 2．02±0．77 2．76±0．67 2．18±0．59模型組（n=6）2 周 176．8±26．2* 6．2±1．24*4 周 180．1±39．8* 6．0±0．41* 1．14±0．30* 2．33±0．95 8 周 188．2±40．4* 6．8±0．72* 1．57±0．63* 3．77±1．36人參皂苷組（n=6）2 周 176．2±21．8* 5．1±0．64* 1．44±0．37* 2．14±0．85 4 周 175．3±12．1* 5．8±0．42* 1．69±0．56* 2．32±0．73 8周197．8±20．5*6．7±0．71*1．26±0．49*2．85±0．78

表2 各組大鼠血清糖脂代謝指標比較 （mmol/L，±s）

表2 各組大鼠血清糖脂代謝指標比較 （mmol/L，±s）

人參皂苷組（n=6）4 周 19．06±3．82**△ 6．8±1．02* 1．69±0．56* 2．32±0．73*8周21．02±4．21**△7．7±1．08*△1．26±0．49*△2．85±0．78*△

2．3 各組大鼠腎組織MMP-9、Col-Ⅳ表達比較 見表3。糖尿病大鼠腎小球MMP-9在2、4、8周時較對照組明顯下降 （P＜0．05），人參皂苷組腎小球 MMP-9高于糖尿病組，在 4、8周時差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0．05）。組內比較發(fā)現(xiàn)模型組大鼠在4、8周時腎小球MMP-9較2周時低（P＜0．05），而人參皂苷組則在4、8周時腎小球MMP-9較2周時高（P＜0．05）。各時期模型組腎間質MMP-9與正常對照組相比，有升高但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05），人參皂苷組較模型組腎間質MMP-9有下降，第8周時差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0．05）。糖尿病大鼠腎小球Col-Ⅳ的表達在 2、4、8 周時均較正常組升高（P 均＜0．05），而腎間質 Col-Ⅳ的表達在8周時較正常組明顯升高（P＜0．05）。人參皂苷組腎小球Col-Ⅳ的表達則較模型組下降，在4、8周時差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），腎間質 Col-Ⅳ的表達也較模型組下降，在 8周時差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。

表3 各組大鼠腎小球MMP-9、Col-Ⅳ表達比較 （%，±s）

表3 各組大鼠腎小球MMP-9、Col-Ⅳ表達比較 （%，±s）

組 別 腎小球 腎間質MMP-9 Col-Ⅳ MMP-9 Col-Ⅳ正常對照組（n=6）2周4周0．73±0．07 0．46±0．03 1．45±0．30 1．53±0．32模型組（n=6）人參皂苷組（n=6）8 周 0．40±0．03 2 周 0．29±0．11*4 周 0．11±0．03*8 周 0．13±0．04*2 周 0．33±0．08*4 周 0．56±0．08*△1．85±0．28 3．08±0．69＊3．01±0．38*3．41±0．41*2．25±0．32*2．33±0．41*△8周0．71±0．09*△2．79±0．35*△1．24±0．07 0．19±0．04 1．13±0．09 0．19±0．05 1．79±0．28 0．25±0．11 1．98±0．29 0．17±0．01 1．67±0．37 0．22±0．06 2．33±0．23 0．59±0．06 1．28±0．17 0．18±0．03 1．47±0．08 0．22±0．02 1．37±0．13*△ 0．27±0．07△

3 討 論

本研究用STZ制成糖尿病大鼠模型，并用人參皂苷治療，用免疫組化方法檢測腎小球及腎間質MMP-9和Col-Ⅳ表達的變化。發(fā)現(xiàn)糖尿病時腎小球MMP-9的表達下降，Col-Ⅳ表達上升，且隨病程進展愈加明顯。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠模型中MMP-9在腎小球中的表達是降低的，這與其他相關研究［7］結果一致。但同時發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠腎間質MMP-9的表達增加，而與Col-Ⅳ表達成正比?？赡艿氖窃谀I小球中，高血糖所致的諸多因素導致MMP-9的表達下降在先，從而引起Col-Ⅳ的降解減少，Col-Ⅳ的積累增加，導致腎小球硬化的發(fā)生。

人參為臨床上治療糖尿病的常用中藥，具有大補元氣，補脾益肺，生津止渴，安神益智之功效。既合“消渴”的基本病機“陰虛為本”，亦治久病及腎之下焦虛寒、陰陽兩虛。本研究觀察了人參皂苷對2型糖尿病實驗大鼠相關指標2周、4周、8周的影響，提示人參皂苷對腎臟的保護作用也可能通過減少ECM的形成起到保護腎細胞的作用。

由于各方面條件的限制，本研究例數(shù)尚少，此外，MMPs的表達調節(jié)大致可以分為基因水平的調節(jié)，酶原活化調節(jié)，活化后調節(jié)等調節(jié)方式［7-10］。相關藥物能否作用于在這幾個環(huán)節(jié)從而調節(jié)MMPs的表達尚待進一步研究。由于人參皂苷成分較多，其療效是多耙向的，故其治療2型糖尿病的機制相對較復雜，確切機制尚不明確，有待于在進一步的研究中篩選提取方式，闡釋其作用機理，尋找答案。

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