劉 弘趙 紅苑賀英潘 琳孫紅妹

1中日友好醫(yī)院（北京100029）

2首都兒科研究所細(xì)菌研究室（北京100600）

四逆散和桂枝茯苓丸系漢代張景岳的經(jīng)方，臨床運(yùn)用廣泛。我科名老中醫(yī)許潤(rùn)三教授以此創(chuàng)制了婦科Ⅰ號(hào)方和Ⅱ號(hào)方，治療盆腔炎性疾病取得了良好的臨床療效。盆腔炎癥性疾病及其后遺癥（如不孕、疼痛、異位妊娠等）嚴(yán)重影響了廣大婦女的生活質(zhì)量，其病原體主要為淋病奈瑟球菌、衣原體、支原體等［1］。本研究選取臨床行之有效的兩個(gè)中藥復(fù)方，利用解脲支原體陰道接種小鼠生殖器官感染模型探討中藥對(duì)盆腔炎癥性疾病的免疫調(diào)節(jié)的影響。

1 材料與方法

1．1 菌株 解脲支原體血清8型菌株，由首都兒研所提供。

1．2 動(dòng)物 BALB/c雌性8～10周齡小鼠 48只，體質(zhì)量18～20g。購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2006-2009。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室。

1．3 藥物 婦科Ⅰ號(hào)方：由柴胡 10g，枳實(shí) 15g，赤芍 20g，生甘草 10g，丹參 30g，蒲公英 30g等組成，水煎劑濃縮為 0．8mg/mL備用；婦科Ⅱ號(hào)方：由桂枝 10g，茯苓 10g，桃仁 10g，赤芍 10g，牡丹皮10g等組成；阿齊霉素膠囊，250mg/粒，齊魯制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H10970061，溶于注射用水配成1．9mg/mL備用；苯甲酸雌二醇注射液，2mg/mL，上海通用藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H31021114，產(chǎn)品批號(hào)090801。

1．4 儀器與試劑 臺(tái)式冷凍離心機(jī)，湘儀TGL-16；流式細(xì)胞儀（BD公司FACSCalibur）；超凈臺(tái)，泰斯特；全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀：MULTISKANMK3，Thermo，USA； 電熱恒溫培養(yǎng)箱：DH4000A，天津泰斯特；MINIshaker：MH-1，kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER。常規(guī)化學(xué)試劑購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司，紅細(xì)胞裂解液、Leucoperm reagent、anti-mouse CD3e（EM0306）、anti-mouseCD4（BM0401）、anti-mouseCD8a（EM0804）由尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司提供。 鼠 IFN-γ、TNF-ɑ、IL-4 購(gòu)自 RB，批號(hào)：2R582、2R602、2R482。

1．5 解脲支原體血清8型感染液制備 取無(wú)菌PPLO培養(yǎng)基100mL，按5∶1比例加入小牛血清20mL混勻，分裝到無(wú)菌錐形瓶中。取-70℃保存的菌種，于37℃水浴中解凍后，吸取100μL菌液加入培養(yǎng)基中。蓋硬膠塞后用封口膜封口，于37℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)，配成1．0×103CCU/mL濃度備用。

1．6 造模方法 小鼠造模前取陰道分泌物支原體培養(yǎng)均為陰性。小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇注射液0．2mL，每周1次，共4次。在皮下注射雌激素第2次后陰道接種支原體解8感染液，采用移液槍和一次性槍頭，暴露小鼠陰道，注入感染液20μL，待液體被陰道黏膜完全吸收后，放回籠內(nèi)，每只鼠分籠喂養(yǎng)。每日接種1次，連續(xù)3次。1周后再加強(qiáng)接種1次。雌激素最后1次皮下接種后1周，取小鼠陰道分泌物進(jìn)行支原體液體培養(yǎng)，全部為陽(yáng)性，視為造模成功。為了明確造模過(guò)程中雌激素對(duì)于小鼠免疫狀態(tài)有無(wú)影響，單獨(dú)設(shè)立了雌激素對(duì)照組，皮下注射雌激素方法同前，陰道接種等量生理鹽水。

1．7 分組與給藥 小鼠共隨機(jī)分為阿齊霉素組、婦科Ⅰ號(hào)方組、婦科Ⅱ號(hào)方組（各組每日0．4mL藥物灌胃）、模型組、正常對(duì)照組、皮下注射雌激素組（各組給予等劑量生理鹽水灌胃），14d后處死動(dòng)物。

1．8 檢測(cè)指標(biāo) T細(xì)胞亞群：小鼠眼球取血，取全血樣本50μL加入 CD3、CD4、CD8 各 5μL，充分混勻，室溫避光染色 30min；然后加入紅細(xì)胞裂解液2mL，混勻后室溫避光溶解紅細(xì)胞8min；加入5%PBS 2mL洗兩次，1000r/min離心5min，棄上清后加入0．5mL 0．5%的多聚甲醛重選沉淀固定，4℃過(guò)夜后，樣品上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。細(xì)胞因子：小鼠處死后迅速分離脾臟，制備脾組織勻漿，4000r/min離心15min，吸取上清液；采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè) IFN-γ、TNF-ɑ 和 IL-4 濃度。

1．9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)軟件。采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 各組T細(xì)胞亞群比較 見(jiàn)表1。模型組和雌激素組CD4+/CD8+與正常對(duì)照組相比顯著降低，中藥及西藥干預(yù)后能夠提高這一比值，但與模型組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雌激素組的CD4+和CD8+與模型組相比均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0．05），但 CD4+/CD8+與模型組相比有降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與正常對(duì)照組相比降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

表1 中藥復(fù)方對(duì)于T細(xì)胞亞群的影響 （%，±s）

表1 中藥復(fù)方對(duì)于T細(xì)胞亞群的影響 （%，±s）

與模型組比較，*P＜0．05；與正常對(duì)照組比較，△P＜0．05。

CD4+/CD8+阿齊霉素組 4．02±0．38婦科Ⅰ號(hào)方組 4．11±0．70 CD8+11．29±4．45 9．38±4．83 11．61±5．98模型組 7 3．66±0．43組 別n 7 8婦科Ⅱ號(hào)方組7 CD4+44．73±15．41 37．89±18．12 43．97±19．404．02±0．76 39．05±10．96 10．84±3．70正常對(duì)照組 9 51．69±15．64 12．22±4．30 4．32±0．45*皮下注射雌激素組 6 59．12±10．20* 16．39±2．49* 3．61±0．35△

2．2 各組細(xì)胞因子比較 模型組和雌激素組的IFN-γ、IL-4、TNF-ɑ與正常對(duì)照組相比，均有升高的趨勢(shì)，藥物干預(yù)后均有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

盆腔炎癥性疾病及其后遺癥的動(dòng)物模型近年來(lái)發(fā)展為機(jī)械損傷加細(xì)菌感染［2］，致病菌主要為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和鏈球菌等需氧菌；還有就是動(dòng)物陰道接種支原體［3］或衣原體［4］。這些動(dòng)物模型無(wú)論從感染因素、感染途徑和病理特點(diǎn)都與人類(lèi)盆腔炎癥性疾病及其后遺癥越來(lái)越相似。本文采取的造模方法小鼠生殖器官炎癥病變是明顯的，既往文獻(xiàn)也有類(lèi)似報(bào)道［5］。

表2 中藥復(fù)方對(duì)細(xì)胞因子的影響 （pg/mL，±s）

表2 中藥復(fù)方對(duì)細(xì)胞因子的影響 （pg/mL，±s）

IL-4 51．80±37．21 56．64±31．86 49．07±20．26模型組 7 4．70±13．57 TNF-α阿齊霉素組 3．93±23．28婦科Ⅰ號(hào)方組 4．51±18．08組 別n 7 8婦科Ⅱ號(hào)方組7 IFN-γ 251．26±168．18 263．61±157．23 231．75±96．094．26±12．51 235．48±102．33 60．86±37．00正常對(duì)照組 9 205．85±118．10 45．97±22．92 3．52±15．70皮下注射雌激素組 6 310．87±210．82 57．28±36．10 4．97±24．31

婦科Ⅰ號(hào)方理氣活血、清熱止痛，適用于盆腔炎癥性疾病及其后遺癥氣滯血瘀證；婦科Ⅱ號(hào)方溫通活血、化瘀止痛，適用于盆腔炎癥性疾病寒凝血瘀證。這兩個(gè)經(jīng)驗(yàn)方臨床表明能夠有效緩解患者的癥狀和體征，以往的苯酚糊致炎動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［6］也證實(shí)對(duì)于炎癥病理有明顯改善。但是中醫(yī)藥取效的作用靶點(diǎn)是多方面的，同時(shí)我們?cè)谂R床中發(fā)現(xiàn)盆腔炎癥性疾病患者支原體陽(yáng)性率較高，因此設(shè)計(jì)本研究來(lái)探討中藥對(duì)于支原體引起的小鼠生殖器官感染的免疫功能是否有影響。

目前中藥對(duì)于免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究有從方藥角度進(jìn)行，也有從疾病角度進(jìn)行。如有報(bào)道在加味四逆散治療大鼠肝郁證潰瘍性結(jié)腸炎研究中，該方能夠顯著降低IL-1β、IL-6，上調(diào)了IL-4和IL-10，從而有利于炎癥的消除和組織的修復(fù)［7］。桂枝茯苓丸治療人宮頸癌荷瘤小鼠，能夠顯著升高小鼠脾臟IL-2水平。亦有報(bào)道［8-9］中藥能夠顯著降低支原體陰道感染小鼠血清IFN-γ和 TNF-α。

T淋巴細(xì)胞亞群在人體細(xì)胞免疫反應(yīng)中有著重要的作用。一般認(rèn)為CD4+/CD8+比值可反映機(jī)體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，如CD4+/CD8+比值下降即提示患者機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)雌激素預(yù)處理以及支原體感染均能導(dǎo)致小鼠免疫功能下降，從而引發(fā)生殖器官炎癥的發(fā)展，中西藥物組均能提高這一比值，但差異未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮可能與樣本量小有關(guān)系。

CD4+Th細(xì)胞由Th0向Th1、Th2或Th3細(xì)胞分化。Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-ɑ等，促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，促進(jìn)疾病的發(fā)展；Th2 細(xì)胞主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 等，促進(jìn)B細(xì)胞增殖，增強(qiáng)抗體介導(dǎo)的體液免疫，促進(jìn)疾病的恢復(fù)。本研究發(fā)現(xiàn)雌激素預(yù)處理以及支原體感染均能導(dǎo)致小鼠炎癥性細(xì)胞因子增多，中西藥物治療均能降低脾組織IFN-γ、TNF-α和IL-4，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮是否脾組織的細(xì)胞因子濃度與外周血的濃度有差異，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

支原體感染可以引起小鼠生殖器官炎癥，中藥對(duì)于病原體的清除可能不及敏感抗生素，但其多成分、多靶點(diǎn)作用于炎癥病理的緩解，也可能參與機(jī)體免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的整體平衡有關(guān)，而不單是一個(gè)或幾個(gè)細(xì)胞因子的高表達(dá)或低表達(dá)。今后可以考慮病證結(jié)合動(dòng)物模型，進(jìn)一步從免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)方面探索中醫(yī)藥的作用機(jī)制。

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