劉 弘趙 紅苑賀英潘 琳孫紅妹

1中日友好醫(yī)院（北京100029）

2首都兒科研究所細(xì)菌研究室（北京100600）

四逆散和桂枝茯苓丸系漢代張景岳的經(jīng)方，臨床運用廣泛。我科名老中醫(yī)許潤三教授以此創(chuàng)制了婦科Ⅰ號方和Ⅱ號方，治療盆腔炎性疾病取得了良好的臨床療效。盆腔炎癥性疾病及其后遺癥（如不孕、疼痛、異位妊娠等）嚴(yán)重影響了廣大婦女的生活質(zhì)量，其病原體主要為淋病奈瑟球菌、衣原體、支原體等［1］。本研究選取臨床行之有效的兩個中藥復(fù)方，利用解脲支原體陰道接種小鼠生殖器官感染模型探討中藥對盆腔炎癥性疾病的免疫調(diào)節(jié)的影響。

1 材料與方法

1．1 菌株 解脲支原體血清8型菌株，由首都兒研所提供。

1．2 動物 BALB/c雌性8～10周齡小鼠 48只，體質(zhì)量18～20g。購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2006-2009。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心國家標(biāo)準(zhǔn)實驗室。

1．3 藥物 婦科Ⅰ號方：由柴胡 10g，枳實 15g，赤芍 20g，生甘草 10g，丹參 30g，蒲公英 30g等組成，水煎劑濃縮為 0．8mg/mL備用；婦科Ⅱ號方：由桂枝 10g，茯苓 10g，桃仁 10g，赤芍 10g，牡丹皮10g等組成；阿齊霉素膠囊，250mg/粒，齊魯制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H10970061，溶于注射用水配成1．9mg/mL備用；苯甲酸雌二醇注射液，2mg/mL，上海通用藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H31021114，產(chǎn)品批號090801。

1．4 儀器與試劑 臺式冷凍離心機(jī)，湘儀TGL-16；流式細(xì)胞儀（BD公司FACSCalibur）；超凈臺，泰斯特；全自動多功能酶標(biāo)儀：MULTISKANMK3，Thermo，USA； 電熱恒溫培養(yǎng)箱：DH4000A，天津泰斯特；MINIshaker：MH-1，kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER。常規(guī)化學(xué)試劑購于北京化學(xué)試劑公司，紅細(xì)胞裂解液、Leucoperm reagent、anti-mouse CD3e（EM0306）、anti-mouseCD4（BM0401）、anti-mouseCD8a（EM0804）由尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司提供。 鼠 IFN-γ、TNF-ɑ、IL-4 購自 RB，批號：2R582、2R602、2R482。

1．5 解脲支原體血清8型感染液制備 取無菌PPLO培養(yǎng)基100mL，按5∶1比例加入小牛血清20mL混勻，分裝到無菌錐形瓶中。取-70℃保存的菌種，于37℃水浴中解凍后，吸取100μL菌液加入培養(yǎng)基中。蓋硬膠塞后用封口膜封口，于37℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)，配成1．0×103CCU/mL濃度備用。

1．6 造模方法 小鼠造模前取陰道分泌物支原體培養(yǎng)均為陰性。小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇注射液0．2mL，每周1次，共4次。在皮下注射雌激素第2次后陰道接種支原體解8感染液，采用移液槍和一次性槍頭，暴露小鼠陰道，注入感染液20μL，待液體被陰道黏膜完全吸收后，放回籠內(nèi)，每只鼠分籠喂養(yǎng)。每日接種1次，連續(xù)3次。1周后再加強(qiáng)接種1次。雌激素最后1次皮下接種后1周，取小鼠陰道分泌物進(jìn)行支原體液體培養(yǎng)，全部為陽性，視為造模成功。為了明確造模過程中雌激素對于小鼠免疫狀態(tài)有無影響，單獨設(shè)立了雌激素對照組，皮下注射雌激素方法同前，陰道接種等量生理鹽水。

1．7 分組與給藥 小鼠共隨機(jī)分為阿齊霉素組、婦科Ⅰ號方組、婦科Ⅱ號方組（各組每日0．4mL藥物灌胃）、模型組、正常對照組、皮下注射雌激素組（各組給予等劑量生理鹽水灌胃），14d后處死動物。

1．8 檢測指標(biāo) T細(xì)胞亞群：小鼠眼球取血，取全血樣本50μL加入 CD3、CD4、CD8 各 5μL，充分混勻，室溫避光染色 30min；然后加入紅細(xì)胞裂解液2mL，混勻后室溫避光溶解紅細(xì)胞8min；加入5%PBS 2mL洗兩次，1000r/min離心5min，棄上清后加入0．5mL 0．5%的多聚甲醛重選沉淀固定，4℃過夜后，樣品上流式細(xì)胞儀檢測。細(xì)胞因子：小鼠處死后迅速分離脾臟，制備脾組織勻漿，4000r/min離心15min，吸取上清液；采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測 IFN-γ、TNF-ɑ 和 IL-4 濃度。

1．9 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16．0統(tǒng)計軟件。采用t檢驗和單因素方差分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 各組T細(xì)胞亞群比較 見表1。模型組和雌激素組CD4+/CD8+與正常對照組相比顯著降低，中藥及西藥干預(yù)后能夠提高這一比值，但與模型組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。雌激素組的CD4+和CD8+與模型組相比均明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0．05），但 CD4+/CD8+與模型組相比有降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與正常對照組相比降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。

表1 中藥復(fù)方對于T細(xì)胞亞群的影響 （%，±s）

表1 中藥復(fù)方對于T細(xì)胞亞群的影響 （%，±s）

與模型組比較，*P＜0．05；與正常對照組比較，△P＜0．05。

CD4+/CD8+阿齊霉素組 4．02±0．38婦科Ⅰ號方組 4．11±0．70 CD8+11．29±4．45 9．38±4．83 11．61±5．98模型組 7 3．66±0．43組 別n 7 8婦科Ⅱ號方組7 CD4+44．73±15．41 37．89±18．12 43．97±19．404．02±0．76 39．05±10．96 10．84±3．70正常對照組 9 51．69±15．64 12．22±4．30 4．32±0．45*皮下注射雌激素組 6 59．12±10．20* 16．39±2．49* 3．61±0．35△

2．2 各組細(xì)胞因子比較 模型組和雌激素組的IFN-γ、IL-4、TNF-ɑ與正常對照組相比，均有升高的趨勢，藥物干預(yù)后均有降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討 論

盆腔炎癥性疾病及其后遺癥的動物模型近年來發(fā)展為機(jī)械損傷加細(xì)菌感染［2］，致病菌主要為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和鏈球菌等需氧菌；還有就是動物陰道接種支原體［3］或衣原體［4］。這些動物模型無論從感染因素、感染途徑和病理特點都與人類盆腔炎癥性疾病及其后遺癥越來越相似。本文采取的造模方法小鼠生殖器官炎癥病變是明顯的，既往文獻(xiàn)也有類似報道［5］。

表2 中藥復(fù)方對細(xì)胞因子的影響 （pg/mL，±s）

表2 中藥復(fù)方對細(xì)胞因子的影響 （pg/mL，±s）

IL-4 51．80±37．21 56．64±31．86 49．07±20．26模型組 7 4．70±13．57 TNF-α阿齊霉素組 3．93±23．28婦科Ⅰ號方組 4．51±18．08組 別n 7 8婦科Ⅱ號方組7 IFN-γ 251．26±168．18 263．61±157．23 231．75±96．094．26±12．51 235．48±102．33 60．86±37．00正常對照組 9 205．85±118．10 45．97±22．92 3．52±15．70皮下注射雌激素組 6 310．87±210．82 57．28±36．10 4．97±24．31

婦科Ⅰ號方理氣活血、清熱止痛，適用于盆腔炎癥性疾病及其后遺癥氣滯血瘀證；婦科Ⅱ號方溫通活血、化瘀止痛，適用于盆腔炎癥性疾病寒凝血瘀證。這兩個經(jīng)驗方臨床表明能夠有效緩解患者的癥狀和體征，以往的苯酚糊致炎動物實驗［6］也證實對于炎癥病理有明顯改善。但是中醫(yī)藥取效的作用靶點是多方面的，同時我們在臨床中發(fā)現(xiàn)盆腔炎癥性疾病患者支原體陽性率較高，因此設(shè)計本研究來探討中藥對于支原體引起的小鼠生殖器官感染的免疫功能是否有影響。

目前中藥對于免疫功能影響的實驗研究有從方藥角度進(jìn)行，也有從疾病角度進(jìn)行。如有報道在加味四逆散治療大鼠肝郁證潰瘍性結(jié)腸炎研究中，該方能夠顯著降低IL-1β、IL-6，上調(diào)了IL-4和IL-10，從而有利于炎癥的消除和組織的修復(fù)［7］。桂枝茯苓丸治療人宮頸癌荷瘤小鼠，能夠顯著升高小鼠脾臟IL-2水平。亦有報道［8-9］中藥能夠顯著降低支原體陰道感染小鼠血清IFN-γ和 TNF-α。

T淋巴細(xì)胞亞群在人體細(xì)胞免疫反應(yīng)中有著重要的作用。一般認(rèn)為CD4+/CD8+比值可反映機(jī)體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，如CD4+/CD8+比值下降即提示患者機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)雌激素預(yù)處理以及支原體感染均能導(dǎo)致小鼠免疫功能下降，從而引發(fā)生殖器官炎癥的發(fā)展，中西藥物組均能提高這一比值，但差異未見統(tǒng)計學(xué)意義，考慮可能與樣本量小有關(guān)系。

CD4+Th細(xì)胞由Th0向Th1、Th2或Th3細(xì)胞分化。Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-ɑ等，促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，促進(jìn)疾病的發(fā)展；Th2 細(xì)胞主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 等，促進(jìn)B細(xì)胞增殖，增強(qiáng)抗體介導(dǎo)的體液免疫，促進(jìn)疾病的恢復(fù)。本研究發(fā)現(xiàn)雌激素預(yù)處理以及支原體感染均能導(dǎo)致小鼠炎癥性細(xì)胞因子增多，中西藥物治療均能降低脾組織IFN-γ、TNF-α和IL-4，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮是否脾組織的細(xì)胞因子濃度與外周血的濃度有差異，需要進(jìn)一步實驗證實。

支原體感染可以引起小鼠生殖器官炎癥，中藥對于病原體的清除可能不及敏感抗生素，但其多成分、多靶點作用于炎癥病理的緩解，也可能參與機(jī)體免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的整體平衡有關(guān)，而不單是一個或幾個細(xì)胞因子的高表達(dá)或低表達(dá)。今后可以考慮病證結(jié)合動物模型，進(jìn)一步從免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)方面探索中醫(yī)藥的作用機(jī)制。

［1］ 劉朝暉，廖秦平．盆腔炎性疾病致病微生物及治療方案研究［J］．實用婦產(chǎn)科雜志，2010，26（7）：522-524．

［2］ 黃麗，孫培文，羅雋，等．慢性盆腔炎模型的建立與評價［J］．中南藥學(xué)，2010，8（6）：469-472．

［3］ Furr PM，Taylor-Robinson D.The establishment and persistence of Ureaplasma urealyticum in oestradiol-treated femalemice［J］.JMed Microbiol，1989，29（6）：111-114.

［4］ M Tuffrey，F(xiàn) Alexander，C Inman，etal.Correlation of infertility with altered tubalmorphology and function inmicewith salpingitis induced by a human genital-tract isolate of Chlamydia trachomatis［J］.Reprod Fert，1990，156（88）：295-305.

［5］ D Taylor-robinson，PM Furr.Observationson experimental colonisation ofmice by ureaplasmas of hum an origin［J］.Med Microbiol，2002，51（4）：866-870.

［6］ 王清，張宗芳，劉弘.中藥三種途徑給藥治療輸卵管阻塞模型的結(jié)果分析［J］.中藥研究與信息，2004，6（11）：35-37.

［7］ 谷松，郭曉東，關(guān)慶增，等.加味四逆散對潰瘍性結(jié)腸炎肝郁大鼠模型細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)作用［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2006，12（3）：56-58.

［8］ 韓延華，辛雪艷.消抗靈Ⅱ號對小鼠解脲支原體感染及感染后血清中干擾素-γ 的影響［J］.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，3（2）：83-85.

［9］ 韓延華，于晨芳，韓延博.消抗靈Ⅱ號對小鼠解脲支原體感染及感染后血清中 TNF-ɑ 的影響［J］.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，3（3）：134-136.