高 原 王 哲 王 健 于 丹 王守巖 孫宏偉 張立德 關(guān)洪全

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)（遼寧沈陽110847）

腦梗死占腦血管病發(fā)病率80%左右，病死率、復(fù)發(fā)率和致殘率均高。在我國，其死亡率僅次于惡性腫瘤，嚴重危害人類的健康［1］。我們以往研究和臨床觀察證實眼針治療中風(fēng)病療效肯定，尤其是急性期效果顯著，但其是否對卒中后腦可塑性有益尚未見報道。為此，我們通過眼針療法對缺血再灌注腦皮質(zhì)中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）表達的影響研究，探討其對大鼠腦缺血再灌注后腦可塑性的作用及可能機制，為眼針治療腦缺血性疾病提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SD大鼠32只，雌雄不拘，體質(zhì)量（280±20）g，由北京維通利華實驗動物中心提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲水、攝取標準顆粒飼料，室內(nèi)溫度22℃，相對濕度45%。將大鼠隨機分為正常對照組、假手術(shù)組、模型組、眼針組，每組8只。

1.2 試藥 實時定量PCR試劑盒購自TaKaRa大連寶生物。BDNF引物由北京華大基因公司合成。親和純化兔抗鼠BDNF多克隆抗體、即用型SABC免疫組化染色試劑盒及DAB染色試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 模型制備與評價 模型組及眼針組參照文獻［2］，采用改良的線栓法復(fù)制大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型。模型成功標準：大鼠于缺血2h后進行再灌注，再灌注24h后進行神經(jīng)功能缺損評分，參照Zea Longa 5分制評分標準：0分為無癥狀；1分為不能完全伸展對側(cè)前爪；2分為向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分為向?qū)?cè)傾倒；4分為不能自發(fā)行走，意識喪失。評分為1～3分者納入實驗組，未達標準者排除。假手術(shù)組術(shù)式同模型、眼針組，區(qū)別在于釣魚線插入深度為0．5～1cm，其他同手術(shù)組。正常組未處理。

1．4 眼針取穴及刺法 眼針組：用31號13mm毫針，于大鼠眶周2mm處針刺，定位參照人體取穴方法，取肝區(qū)、上焦區(qū)、下焦區(qū)、腎區(qū)針刺。手法：平刺，進針3mm。留針20min，留針10min時用刮柄進行刮針1次，刮針5下。治療時機：眼針組于腦缺血再灌注即刻、12h及取材前30min，分別進行眼針治療。

圖1 大鼠眼針取穴部位示意圖

1．5 標本采集與檢測

1．5．1 腦皮質(zhì)BDNF蛋白表達（免疫組化SABC法）檢測 10%水合氯醛（3．5mL/kg）腹腔麻醉，開胸暴露心臟，先以 0．9%氯化鈉注射液 200mL灌至無血色后，再更換4%多聚甲醛200mL進行灌注。開顱取腦，后固定于同一固定液中6h，腦組織取材參照腦立體定位圖譜，以Bregma點前后各0．2mm為取材區(qū)間，常規(guī)脫水、石蠟包埋。將包埋的蠟塊作5μm切片，免疫組化按試劑盒操作。BDNF以細胞膜或細胞漿出現(xiàn)清晰棕褐色顆粒為陽性。使用BI2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對采集的圖像測定陽性反應(yīng)物的灰度，每例動物隨機取3～4張切片，且各組所選部位相同。

1．5．2 腦皮質(zhì) BDNF蛋白表達（Western blot法）檢測 于缺血再灌注24h后對大鼠給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉后斷頭取出右側(cè)大腦皮質(zhì)，按腦組織凈重∶裂解液=1∶10的比例，加入相應(yīng)體積的裂解液，pH為7．5，將樣品剪碎后勻漿、離心、上清即為總蛋白。兔抗鼠 BDNF 一抗（1∶500）；O-dianidine，β-naphthyl acid phosphate顯色；掃描儀掃描NC膜，分析結(jié)果。

1．5．3腦皮質(zhì)BDNFmRNA表達檢測 采用實時定量RT-PCR方法。 BDNF 上游引物：5′ATGGGTTACACGAAGGA 3′；BDNF 下游引物：5′GCCCGAACATACGATT 3′。 β-actin 為內(nèi)參，其上下游引 物 分 別 為 ：5′CGTGCGTGACATTAAAGAG 3′，5′TTGCCGATAGTGATGACCT 3′。所有的產(chǎn)物在ABIPrism 7500 HT序列檢測系統(tǒng)中運行。讀取CT值，以管家基因β-actin為內(nèi)參，以擴增倍數(shù)作為比較的依據(jù)，△CT=CT目的基因-CTβ-actin，△△CT=△CT實驗-△CT對照，擴增倍數(shù)=2-△△CT。將所擴增的PCR產(chǎn)物同時進行溶解曲線分析。

1．6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 10．0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 各組神經(jīng)功能缺損評分比較 模型組和眼針組大鼠均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能障礙，如提尾時左側(cè)前肢不能伸直，行走向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)或傾倒等；假手術(shù)組大鼠無神經(jīng)功能障礙表現(xiàn)。缺血再灌注24h后，模型組大鼠神經(jīng)功能缺失癥狀明顯加重，與造模后即刻神經(jīng)功能缺損程度評分無差異。眼針組大鼠經(jīng)眼針治療后與造模后即刻神經(jīng)功能缺損程度評分有差異（P＜0．01）。

表1 各組腦缺血再灌注損傷24h后神經(jīng)缺損程度評分比較 （分，±s）

表1 各組腦缺血再灌注損傷24h后神經(jīng)缺損程度評分比較 （分，±s）

與本組再灌注后即刻比較，△P＜0．01；與同一時間點模型組比較，*P＜0．01。

組 別 n正常組 8再灌注后即刻-24h假手術(shù)組 8模型組 8---2．625±0．9161眼針組 82．625±0．9161 3．125±0．6409△1．500±0．5345*

2．2 眼針對大鼠腦缺血再灌注24h后腦皮質(zhì)BDNF蛋白表達的影響 免疫組化方法檢測結(jié)果：圖2、表2。正常組大鼠和假手術(shù)組大鼠均有多量BDNF陽性染色，模型組大鼠BDNF的陽性表達顯著降低。模型組大鼠腦皮質(zhì)BDNF表達明顯低于正常組大鼠和假手術(shù)組大鼠（P＜0．01）。眼針組大鼠腦皮質(zhì)BDNF表達明顯高于模型組大鼠，有顯著差異（P＜0．01）。

圖2 各組腦組織切片圖（×400）

Western blot方法檢測結(jié)果：見圖3、表2。模型組大鼠腦皮質(zhì)BDNF蛋白表達強度明顯低于正常組大鼠和假手術(shù)組大鼠，眼針組大鼠腦皮質(zhì)BDNF蛋白表達明顯強于模型組，均有顯著差異（P＜0．01）。

圖3 腦組織BDNF蛋白表達電泳圖

表2 各組腦缺血再灌注24h后腦皮質(zhì)BDNF蛋白表達比較 （±s）

表2 各組腦缺血再灌注24h后腦皮質(zhì)BDNF蛋白表達比較 （±s）

與模型組比較，*P＜0．05，**P＜0．01。

組 別 n正常組 8 Western BDNF灰度值0．7124±0．0234**0．6990±0．0381**0．3677±0．0280 0．6795±0．0374**免疫組化BDNF灰度值161．3377±11．8654**假手術(shù)組 8模型組 8 154．2837±14．8198**122．0856±10．5518眼針組 8143．3383±13．2793**

2.3 眼針對大鼠腦缺血再灌注24h后腦皮質(zhì)BDNFmRNA表達的影響 見圖4。BDNF基因擴增產(chǎn)物大小為86bp，β-actin基因擴增產(chǎn)物為132bp。模型組腦組織BDNFmRNA表達較正常組、假手術(shù)組減少，眼針組表達較模型組增高（P＜0.01）。

圖4 各組大鼠腦皮質(zhì)BDNFmRNA表達的比較

3 討 論

眼針療法是遼寧中醫(yī)學(xué)院彭靜山教授經(jīng)過20余年的潛心研究，以中醫(yī)臟腑經(jīng)絡(luò)理論為基礎(chǔ)，結(jié)合全息論、五輪八廓學(xué)說，華佗的觀眼察病方法，通過長期臨床實踐而創(chuàng)立的一種微針療法，單純眼針治療可收到明顯的患肢主動抬高的即效應(yīng)。眼睛通過縱橫交錯，網(wǎng)絡(luò)全身的經(jīng)絡(luò)與臟腑及其他器官保持密切的聯(lián)系。腦缺血再灌注損傷與肝、腎二臟陰陽失調(diào)以及經(jīng)絡(luò)血脈逆亂有關(guān)。眼針通過刺激上、下焦區(qū)而疏通上、下肢氣血，促進肢體功能恢復(fù)，刺激肝、腎區(qū)調(diào)解臟腑陰陽而治病之根本，故療效顯著。

BDNF產(chǎn)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞，在腦內(nèi)分布最為廣泛，對發(fā)育中的交感、運動、感覺神經(jīng)元的存活、分化和增殖，以及防止運動神經(jīng)元的退行性變有促進作用［3-4］，還具有抗凋亡作用［5］。BDNF是一類調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、成熟、維持神經(jīng)元功能的天然蛋白質(zhì)，是唯一不斷地在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)組織中表達的神經(jīng)營養(yǎng)因子，是神經(jīng)細胞發(fā)育成熟過程中促進和維持細胞生長、存活和分化的依賴因子，同時也是神經(jīng)元受損時，保護其存活和促進其再生的必須因子。有研究顯示［6］，腦缺血后機體可通過促進內(nèi)源性BDNF的表達，提高神經(jīng)元抵抗缺血損傷的能力，促進受損神經(jīng)元的修復(fù)和再生，是機體的一種自我保護機制。但本研究中顯示，當(dāng)腦缺血再灌注24h后未見腦皮質(zhì)BDNF表達增加反而下降，因為腦損傷后BDNF代償性分泌增加水平有限，且持續(xù)時間亦較短，提示機體的自身代償能力是有限的，推測這種代償機制可能發(fā)生在24h之內(nèi)。因此如何有效地利用并促進內(nèi)源性BDNF的表達，可能是治療缺血性神經(jīng)損傷的有效途徑之一。本實驗結(jié)果表明正常組大鼠腦皮質(zhì)有較多量的BDNF的表達，模型組大鼠腦皮質(zhì)BDNF的表達下調(diào)，眼針組大鼠腦皮質(zhì)中BDNF的表達較模型組明顯上調(diào)，促進神經(jīng)元缺血再灌注損傷后的修復(fù)，使大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀得到一定的緩解。

通過刺針眼穴肝區(qū)、上焦區(qū)、下焦區(qū)、腎區(qū)治療后可以有效地利用并促進內(nèi)源性BDNF的表達，從而發(fā)揮對腦細胞損傷的保護作用，為臨床上進一步應(yīng)用眼針治療缺血性腦血管疾病奠定理論基礎(chǔ)。

［1］ Zhang JT.The progress of study on neuropharmacology［M］.Beijing：people′sMedicalPublishing House，2002：49-50，66-79.

［2］ 馬賢德，孫宏偉，柴紀嚴，等．線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型的方法研究［J］．中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009，27（6）：1200-1201.

［3］ Ying SX，Cheng JS.Effectof electro-acupuntureon c-fos expression in gerbilhippcampusduring transientglobal ischemia［J］.Acupuncture Electro-therapeuticsRes，1994，19（6）：207-213.

［4］ Tsukahara T，YoneKawa Y，Tanaka K.The role of brain derived neurotrophic factor in transientfore brain ischemia in the rat brain［J］.Neurosurgery，1994，34（5）：323-331.

［5］ Pringle A K，Sundstrom LE，Wild G J.Brain derived neurotrophic factor，but not neitrophin-3，prevents ischemia induced neuronal cell death in orgenotypic rathippocampus slice cultures［J］.NeurosciLett，1996，211（15）：203-206.

［6］ 張永全，莫國煥，陳明，等．三七總皂苷對腦缺血再灌注大鼠BDNF表達的影響［J］．中成藥，2008，30（7）：958-961.