柴立元，曾娟，蘇艷蓉，楊志輝，楊衛(wèi)春

(中南大學 冶金科學與工程學院，湖南 長沙，410083)

一株Cr(Ⅵ)還原菌的鑒定及其還原特性

柴立元，曾娟，蘇艷蓉，楊志輝，楊衛(wèi)春

(中南大學 冶金科學與工程學院，湖南 長沙，410083)

從長沙鉻鹽廠區(qū)的被污染土壤中分離獲得一株具高效還原高濃度 Cr(Ⅵ)的細菌，利用 PCR擴增獲得該菌16S rDNA部分序列，經(jīng)測序和比對確定菌株為Pannonibactersp.。研究該菌株的生理特性、培養(yǎng)條件以及還原六價鉻的最佳條件。研究結果表明，該菌為革蘭氏陰性菌，顯微鏡下觀察為短桿狀，好氧；該菌在pH為9，溫度為30 ℃時生長最好；pH為8，30 ℃時六價鉻還原效果最佳；16 h內(nèi)可將質(zhì)量濃度為300 mg/L的Cr(Ⅵ)還原90%以上。

微生物；六價鉻；還原；16S rDNA

鉻污染的處理被認為是世界性難題，但采用微生物治理鉻污染潛力巨大。目前，國內(nèi)外對微生物還原Cr(Ⅵ)進行了很多研究。如 Flavio等[1]將Bacillussp.ES29菌體細胞和胞內(nèi)提取物應用于生物反應器，取得較好的鉻還原效果。Wang等[2]對Enterobacter cloacae菌的還原特性和還原酶進行了研究，發(fā)現(xiàn)該菌的鉻還原酶位于菌質(zhì)膜上，還原鉻需氧氣?？蛇€原Cr(Ⅵ)的細菌種屬多樣，例如：無色桿菌Achromobactersp.CH-1[3?5]、芽孢桿菌Bacillus sphaericus[1]、脫硫弧菌Desulfovibrio vulgaris[6]、腸桿菌Enterobacter cloacae[2]、假單胞菌Pseudomonas aeruginosa[7]和微球菌等。本文作者從長沙鉻鹽廠區(qū)的被污染土壤中分離獲得一株能還原Cr(Ⅵ)的細菌，經(jīng)分子生物學鑒定后確定該細菌的屬級分類，并研究該菌的生理學特征和還原Cr(Ⅵ)能力，確定該菌最佳的生長和還原 Cr(Ⅵ)的條件。

1 材料與方法

1.1 菌種

1號菌種為從鉻污染土壤中分離獲得的一株菌種，能高效還原高濃度Cr (Ⅵ)細菌，其形態(tài)特征和生理生化現(xiàn)象與現(xiàn)有文獻報道的菌種不同，命名為P。

2 號菌種為Achromobactersp.CH-1[3?4]，是從長沙鉻鹽廠鉻渣堆場分離得到的一株細菌，能耐受六價鉻并能還原六價鉻質(zhì)量濃度為1.5 g/L。

3號菌種為E.coliK12，系上海生物工程公司提供的一株對六價鉻無耐受和還原能力的細菌。

1.2 培養(yǎng)基

篩選菌株用培養(yǎng)基 1[8]：蛋白胨質(zhì)量濃度為 10 g/L，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)為 2 g/L，亞硫酸鈉為 0.5 g/L，硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)為 0.5 g/L，乳酸為 0.4 g/L，硫代乙醇酸鈉為0.5 g/L。

篩選菌株用培養(yǎng)基2[9]：氯化鈉質(zhì)量濃度為2 g/L，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)為0.6 g/L，醋酸鈉為2 g/L，碳酸鈣為3 g/L。

篩選菌株用培養(yǎng)基3[10]：蛋白胨質(zhì)量濃度為1 g/L，氯化鈉為 1 g/L，酵母浸膏為 0.5 g/L，葡萄糖為0.01 g/L。

篩選菌株用培養(yǎng)基 4[11]：氯化銨質(zhì)量濃度為 1.0 g/L，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)為 0.2 g/L，硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)為 0.001 g/L，二水合氯化鈣為 0.001 g/L，醋酸鈉為5 g/L，酵母浸膏為0.5 g/L，磷酸氫二鉀為0.5 g/L。

篩選菌株用培養(yǎng)基5[12]：蛋白胨質(zhì)量濃度為5 g/L，酵母浸膏為2.5 g/L，氯化鈉為2.5 g/L，一水合葡萄糖為0.5 g/L。

篩選菌株用培養(yǎng)基 6[13]：蛋白胨質(zhì)量濃度為 10 g/L，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)為 2 g/L，硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)為0.5 g/L，硫酸鈉為0.5 g/L，乳酸鈉為6 mL，維生素C為7.5 g/L，琉基乙酸鈉為7.5 g/L。

篩選菌株用培養(yǎng)基7[14]：乳酸鈉質(zhì)量濃度為4 g/L，酵母浸膏為4 g/L，氯化鈉為2 g/L。

篩選菌株用培養(yǎng)基8：酒石酸鈉質(zhì)量濃度為3 g/L，酵母浸膏為4 g/L，氯化鈉為2 g/L。

篩選菌株用培養(yǎng)基 9：檸檬酸三鈉質(zhì)量濃度為 3 g/L，酵母浸膏為4 g/L，氯化鈉為2 g/L。

篩選菌株用培養(yǎng)基10：乙酸鈉質(zhì)量濃度為3 g/L，酵母浸膏為4 g/L，氯化鈉為2 g/L。

篩選菌株用培養(yǎng)基11：乳糖質(zhì)量濃度為3 g/L，酵母浸膏為4 g/L，氯化鈉為2 g/L。

篩選菌株用培養(yǎng)基12：乙酸銨質(zhì)量濃度為3 g/L，酵母浸膏為4 g/L，氯化鈉為2 g/L。

篩選菌株用培養(yǎng)基13：乙醇銨質(zhì)量濃度為3 g/L，酵母浸膏為4 g/L，氯化鈉為2 g/L。

篩選菌株用培養(yǎng)基14：乳酸質(zhì)量濃度為3 g/L，酵母浸膏為4 g/L，氯化鈉為2 g/L。

對上述 14種培養(yǎng)基，分別加入重鉻酸鉀至一定Cr(Ⅵ)質(zhì)量濃度，并添加質(zhì)量分數(shù)為1.5%的瓊脂，配置成固體篩選平板。

1.3 細菌培養(yǎng)和馴化

將菌株以 2%的接種量接種于含一定 Cr(Ⅵ)的培養(yǎng)基中，以120 r/min轉速攪拌，于30 ℃恒溫培養(yǎng)至穩(wěn)定期后傳代。細菌濃度用600 nm處吸光度表示[12]，Cr(Ⅵ)質(zhì)量濃度采用二苯碳酸二肼分光光度法進行分析[14]。

1.4 不同初始pH、溫度及溶解氧條件下的菌珠培養(yǎng)

以2%接種量將菌株接種于Cr(Ⅵ)質(zhì)量濃度為300 mg/L，pH 分別為7，8，9，10和11的選定培養(yǎng)基中，轉速為120 r/min，于30 ℃恒溫培養(yǎng)10 h，檢測細菌濃度和剩余Cr(Ⅵ)質(zhì)量濃度。

以2%接種量將菌株接種于Cr(Ⅵ)質(zhì)量濃度為300 mg/L，pH 為 8的培養(yǎng)基中，于 25，30，40，50和65 ℃，在轉速為120 r/min時，分別培養(yǎng)10 h，檢測細菌濃度和剩余Cr(Ⅵ)質(zhì)量濃度。

以 2%的接種量將菌株接種于 Cr(Ⅵ)的質(zhì)量濃度為300 mg/L，pH為8的液體培養(yǎng)基中，分別在厭氧和好氧條件下，于30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)20 h，觀察菌株生長情況，監(jiān)測細菌質(zhì)量濃度。

以上實驗每個處理3次。

1.5 16S rDNA部分片段的PCR擴增、測序

1.5.1 菌落PCR擴增 16S rDNA

從固體平板上挑取少量單克隆菌落，用solutionⅡ[15]溶液(10% SDS 10ul，40% NaOH 2ul，一級無菌水 88ul)裂解菌體，裂解液稀釋后作為模板，引物為細菌 16S rDNA聚合酶鏈式反應(PCR)通用引物[10](27F，1492R)，使用TIANGEN公司生產(chǎn)的 Taq mix進行擴增。

PCR系統(tǒng)為：10×Taq聚合酶緩沖液5 μL，MgCl2(25 mmol) 4 μL，dNTP(5mmol) 3 μL，引物 1 μL，模板 DNA 3 μL，Taq酶(10000U/ml) 0.5 μL，重蒸水33.5 μL。

PCR程序為：于95 ℃變性5 min，于94 ℃退火1 min，53 ℃退火 30 s，于 72 ℃延伸 90 s，循環(huán) 30 次；于72 ℃保溫10 min；于4 ℃ 保存。

1.5.2 序列分析

PCR產(chǎn)物的測序由上海生物工程有限公司完成。測序得到的菌株 16S rDNA部分片段的序列與NCBI(美國國立生物技術信息中心)中的核酸數(shù)據(jù)庫序列進行Blast比對分析。

2 結果

2.1 菌株P形態(tài)、功能鑒定

在培養(yǎng)基上生長的菌株 P，菌落表面光滑，邊緣整齊，中間微隆起。在含Cr(Ⅵ)的培養(yǎng)基上生長時，菌落呈藍灰色，且菌落周圍的培養(yǎng)基由亮黃色轉為淡黃色。藍灰色是Cr(OH)3的特征顏色，而培養(yǎng)基中除K2Cr2O7外，未添加其他金屬離子，據(jù)此初步判斷菌株P將亮黃色 Cr(Ⅵ)還原成藍灰色Cr(OH)3。經(jīng)革蘭氏染色 ，菌株P為革蘭氏陰性菌，短桿狀。

圖1 鉻還原菌P菌落形態(tài)Fig.1 Colony shape of chromate-reducing bacterium P

2.2 菌株分子生物學鑒定

利用細菌16S rDNA 通用引物用PCR的方法擴增菌株P16S rDNA部分片段，PCR產(chǎn)物測序獲得該片段序列，然后與NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫進行Blast序列比對，結果見表1。

表1 菌株P 16S rDNA序列比對結果Table 1 Analysis of partial 16S rDNA sequence of strain P

由表1可知：菌株P與Pannonibactersp.序列同源性達到 100%，據(jù)此可以確定菌株 P屬于Pannonibacter.sp。目前還沒有關于Pannonibacter屬的細菌具有六價鉻還原或六價鉻耐受能力的報道。

2.3 菌株P Cr(Ⅵ)還原培養(yǎng)基的選擇及馴化

參考國內(nèi)外在研究耐Cr(Ⅵ)和還原 Cr(Ⅵ)細菌時使用的培養(yǎng)基，選用14種不同培養(yǎng)基，分別加入Cr(Ⅵ)終濃度為300 mg/L的重鉻酸鉀作為鉻源，接種菌株P，并以課題組前期研究發(fā)現(xiàn)的六價鉻還原細菌Achromobactersp.CH-1[3?4]作為正對照，E.coliK12 作為負對照，同時培養(yǎng)。接種后48 h，菌株P在篩選用培養(yǎng)基8上，生長速度較其他13種培養(yǎng)基的生長速度都快，且在該種培養(yǎng)基上生長時對Cr(Ⅵ)還原情況良好，使培養(yǎng)基由黃綠色變成藍灰色，由此確定該培養(yǎng)基為最適宜培養(yǎng)基，并進行后續(xù)實驗。正對照Achromobactersp.CH-1在篩選用培養(yǎng)基7上，其生長和Cr(Ⅵ)還原速度較其他培養(yǎng)基上快，使培養(yǎng)基由黃綠色變成藍灰色，而負對照E.coliK12在各種含鉻培養(yǎng)基上均不生長。經(jīng)過在 Cr(Ⅵ)濃度不斷遞增的培養(yǎng)基中馴化，菌株 P能還原六價鉻質(zhì)量濃度達到900 mg/L。

2.4 初始pH值對細菌P的生長及Cr(Ⅵ)還原能力的影響

預試實驗表明，菌株P在堿性環(huán)境生長情況明顯優(yōu)于酸性環(huán)境。因此選擇初始pH為中性和堿性條件，檢測細菌生長及其對六價鉻的還原效果，結果見圖2。

圖2 不同初始pH值對菌株P生長及其Cr(Ⅵ)還原的影響Fig.2 Effect of initial pH value on growth and Cr(Ⅵ)reduction activity of bacterium P

從圖2可以看出：當初始pH為7～9時，菌體吸光度隨著pH升高而升高；當pH超過9時，菌體吸光度隨 pH升高急劇下降；當初始 pH為 8 時，Cr(Ⅵ)的還原率最高，達60%以上；初始pH高于或低于8，菌株的六價鉻還原能力都有所下降；當pH為10時，還原率僅為6.64%。而在pH＜7的酸性環(huán)境下，菌株P可以生長，但 Cr(Ⅵ)基本未被還原?？梢娫摷毦€原Cr(Ⅵ)的最適初始pH為8；生長的最適pH為9。目前報道的六價鉻還原菌，大部分適合在中性pH條件下生長，如Eenterobactr[2]和Ochrobactrumsp.[16]；少數(shù)以間接方式還原六價鉻的化能自養(yǎng)菌在酸性條件下生長，如Thiobacillus ferrooxidans[17]和Shakoori等分離的鉻還原菌CMB-Cr1 (ATCC 700729)[10]。像菌株P一樣嗜堿性鉻的還原菌不多見，菌株P是繼本課題組分離得到CH-1之后的又一株Cr(Ⅵ)還原細菌。

2.5 溫度對細菌P的生長及Cr(Ⅵ)還原能力的影響

利用初始pH8的培養(yǎng)基8,在不同溫度下培養(yǎng)細菌P，檢測溫度對其生長及六價鉻還原能力的影響，結果如圖3所示。

圖3 溫度對菌株P生長及其Cr(Ⅵ)還原的影響Fig.3 Effect of temperature on growth and Cr(Ⅵ) reduction activity of bacterium P

圖3表明：細菌P在溫度為25～40 ℃生長情況良好，當溫度高于50 ℃時，該細菌基本不能生長；菌株P的生長及其還原 Cr(Ⅵ)的能力均受溫度的影響；細菌P在25～40 ℃之間對Cr(Ⅵ)具有一定的還原率；30℃時，Cr(Ⅵ)還原率最高，達80%以上；溫度高于50 ℃，菌株幾乎不能還原六價鉻。目前報道的六價鉻還原菌絕大多數(shù)屬于中溫菌，還原的最佳溫度為30～35 ℃[4,16?17]。菌株 P 生長和還原 Cr(Ⅵ)的最適溫度均為30 ℃，也屬于中溫菌。

2.6 溶解氧對細菌P生長的影響

目前所分離的鉻還原菌中，好氧、厭氧及兼性菌均有報道[12,18]。對細菌P，在厭氧和好氧條件下，于30 ℃培養(yǎng)20 h，發(fā)現(xiàn)它在厭氧條件下不能生長，結果如圖4所示。因此 菌株P為好氧細菌。

圖4 菌株P在厭氧和好氧條件下的生長情況Fig.4 Growth of strain P in anaerobic and aerobic condition

2.7 細菌P的生長曲線及其六價鉻的還原曲線

在最適六價鉻還原條件下培養(yǎng)菌株 P，檢測其六價鉻還原與生長之間的關系。圖5所示為菌株P的生長與六價鉻還原隨時間的變化規(guī)律。

圖5 菌株P生長曲線與其生長過程中的Cr(Ⅵ)還原率Fig.5 Growth curves of strain P and corresponding Cr(Ⅵ)reduction activity

六價鉻的還原過程基本與菌株的生長過程相耦合，在前8 h的生長延滯期，細菌對Cr(Ⅵ)的還原速度非常緩慢，還原率＜5%；進入對數(shù)生長期時，六價鉻的還原速度明顯加快；16 h后，Cr(Ⅵ)還原率＞90%。當細菌生長進入穩(wěn)定期時，Cr(Ⅵ)的去除率達 95%以上。可見：細菌P在其初級代謝階段已完成對Cr(Ⅵ)的還原。

3 結論

(1) 從鉻渣堆場分離得到具有六價鉻還原能力的細菌屬于Pannonibacter.sp，在含Cr(Ⅵ)固體培養(yǎng)基上生長菌落呈藍灰色，顯示其六價鉻還原能力命名為P。

(2)Pannonibacter.sp P在16 h內(nèi)能還原90%的300 mg/L Cr(Ⅵ)。

(3) 菌株 P在 25～40 ℃生長良好并具有較高的Cr(Ⅵ)還原效率，30 ℃時還原Cr(Ⅵ)的效果最佳。

(4) 菌株P于30 ℃，pH為7～9時均能還原Cr(Ⅵ)，當pH為8時，還原能力最佳。對比國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)的鉻還原菌，還原六價鉻質(zhì)量濃度達300 mg/L的菌株較少。本研究發(fā)現(xiàn)菌株P的生長溫度和pH條件適中，將該菌應用于治理堿性含Cr(Ⅵ)廢水和開發(fā)鉻渣的生物治理技術具有很大的潛力。

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(編輯 張曾榮)

Identification and characteristics of a Cr (Ⅵ) reducing strainPannonibactersp. P

CHAI Li-yuan, ZENG Juan, SU Yan-rong, YANG Zhi-hui, YANG Wei-chun

(School of Metallurgical Science and Engineering, Central South University, Changsha 410083, China)

One bacterium which can reduce high concentration of Cr(Ⅵ) was isolated from the soil seriously contaminated by chromium-containing slag in Changsha chromate factory. The bacterium was Gram-negative and short rod when observed using a microscope. The partial 16S rDNA sequence indicats that this strain isPannonibacte sp, and is an aerobic bacterium with the optimal growth at pH 8 under 30 ℃ and the optimal Cr(Ⅵ) reduction at pH 9.0 under 30℃. Under the optimal conditions, more than 90% of 300 mg / L Cr (Ⅵ) is reduced by strain P in 16 h.

bacterium; hexavalent chromium; reduction; 16S rDNA

Q89；X703

A

1672?7207(2011)02?0300?05

2009?12?11；

2010?03?06

國家水體污染控制與治理科技重大專項(2009ZX07212-001-01)；國家杰出青年科學基金資助項目(50925417)；國家自然科學基金重點資助項目(50830301)

楊衛(wèi)春(1982?)，女，湖南湘鄉(xiāng)人，博士，從事廢水廢渣治理研究；電話：0731-88830875；E-mail：yang220222000@yahoo.com.cn