向志光，林樹(shù)柱，董 娜，袁 偉，徐艷峰，秦 川

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類(lèi)疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的一類(lèi)嚴(yán)重的傳染性疾病，全世界有大約三分之一的人口潛伏感染結(jié)核分枝桿菌，據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)每年有約1 100萬(wàn)人發(fā)展成為活動(dòng)性結(jié)核，并有約180萬(wàn)人死于結(jié)核?。╓HO 2008年數(shù)據(jù)）?？巩悷熾?、利福平等一線(xiàn)藥物的多耐藥菌的出現(xiàn)，使化學(xué)治療面臨新的困難，急需開(kāi)發(fā)更為有效的抗結(jié)核藥物。結(jié)核菌動(dòng)物感染模型是新抗結(jié)核藥物開(kāi)發(fā)與評(píng)價(jià)中必不可少的工具。

在抗結(jié)核藥物的體內(nèi)藥效學(xué)評(píng)價(jià)中，通過(guò)尾靜脈注射高劑量結(jié)核菌制備的小鼠結(jié)核急性感染模型較為常用［1］。但目前對(duì)于該感染模型中感染靶器官的組織荷菌量和病理早期動(dòng)態(tài)變化的報(bào)道較少。本文報(bào)道了我們實(shí)驗(yàn)室使用結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv，通過(guò)尾靜脈注射的方式感染雌性C57BL/6J小鼠，建立了小鼠結(jié)核菌急性感染模型，測(cè)定了小鼠感染后8周內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)脾臟、肺臟組織的荷菌量以及病理變化。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用菌株

結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，菌號(hào)為93009。菌株經(jīng)小鼠體內(nèi)兩次增毒，于L/J斜面培養(yǎng)基（購(gòu)自BD公司）培養(yǎng)，收獲斜面培養(yǎng)3周的細(xì)菌經(jīng)5μm無(wú)菌濾器（Millipore公司）制成單細(xì)胞菌懸液，經(jīng)L/J斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)計(jì)數(shù)，單細(xì)胞懸液菌濃度為1.5×106CFU/m L，單細(xì)胞懸液分裝凍存于-80℃低溫冰箱備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)中使用的小鼠為6～8周齡的雌性C57BL/ 6J小鼠，SPF級(jí)，體重18～20 g，購(gòu)自北京華阜康公司［SCXK（京）2009-0007］。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用得到了中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和管理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)MC-09-2003），動(dòng)物在感染前1周進(jìn)入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所生物安全3級(jí)實(shí)驗(yàn)室。

1.3 動(dòng)物的感染與分組

取小鼠放于小鼠固定器中，暴露鼠尾，75％酒精擦拭鼠尾暴露鼠尾靜脈，尾靜脈注射200μL結(jié)核分枝桿菌H37Rv單細(xì)胞懸液，感染劑量為3×105CFU，共感染小鼠42只，于感染后1 d、1周、2周、3周、4周、6周、8周分別取6只動(dòng)物脫頸處死，進(jìn)行脾臟、肺臟組織荷菌量的檢測(cè)和病理分析。

1.4 組織荷菌量檢測(cè)

無(wú)菌取脾、肺組織，取左側(cè)肺組織和1/2的脾臟，先后經(jīng)生理鹽水、4％硫酸和生理鹽水漂洗，加1 m L生理鹽水用玻璃勻漿器研磨，組織懸液經(jīng)生理鹽水按照1∶10進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?0-2、10-3、10-4三個(gè)稀釋度的組織稀釋液100μL接L-J斜面，每個(gè)稀釋度平行接種3管，37℃培養(yǎng)3周后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。取每管菌落數(shù)5～100范圍內(nèi)的稀釋度進(jìn)行荷菌量統(tǒng)計(jì)。

1.5 病理分析

剩余的脾、肺組織置4％中性甲醛固定液中固定1周，組織修塊，脾臟組織按長(zhǎng)軸橫切面進(jìn)行修塊，肺組織沿肺門(mén)方向修塊。組織塊經(jīng)梯度酒精脫水后石蠟包埋，切片厚度為4μm，經(jīng)下行酒精梯度入水后行HE染色。按照每個(gè)切面的病灶類(lèi)型、病灶大小和數(shù)量進(jìn)行病理學(xué)分析和評(píng)分。

2 結(jié)果

2.1 感染動(dòng)物脾臟和肺臟組織荷菌量的變化

感染動(dòng)物在各時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，脾臟、肺臟組織勻漿系列稀釋后經(jīng)L-J斜面培養(yǎng)4周菌落計(jì)數(shù)。動(dòng)物感染24 h后脾臟組織的荷菌量（Log10 CFU）為4.53±0.06，在小鼠感染1周、2周和3周后荷菌量達(dá)到5.79±0.03，5.91±0.45和6.58±0.08，荷菌量隨感染時(shí)間逐步增多。在4周后脾臟組織荷菌量維持相對(duì)穩(wěn)定，4周、6周、8周荷菌量分別為6.67± 0.09、6.4±0.32、6.59±0.17。小鼠感染24 h和1周后肺臟組織稀釋100倍以上沒(méi)有檢測(cè)到結(jié)核菌。在2到8周肺臟組織荷菌量為3.68±0.43、4.49± 0.15、6.07±0.45、6.16±0.3、6.4±0.2，荷菌量逐步提高。圖1顯示感染小鼠結(jié)核分枝桿菌脾臟和肺臟組織的荷菌量變化。

2.2 感染小鼠組織病理變化

小鼠感染24 h后病理取材分析未發(fā)現(xiàn)脾臟和肺臟組織有明顯的病理變化（結(jié)果未顯示）。感染結(jié)核分枝桿菌1周后，肺臟血管周?chē)加醒仔约?xì)胞浸出，炎性細(xì)胞以淋巴細(xì)胞為主，部分動(dòng)物肺間質(zhì)出現(xiàn)水腫（圖2B所示）；脾臟組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不規(guī)則，并可見(jiàn)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞的聚集（圖2F）。結(jié)核菌感染3周后小鼠肺組織血管和呼吸道周?chē)写罅康难仔约?xì)胞，并開(kāi)始出現(xiàn)肉芽腫樣細(xì)胞聚集（圖2C）；脾臟組織結(jié)構(gòu)紊亂，肉芽腫范圍較大，約占1/3面積，部分小鼠脾臟組織出現(xiàn)充血現(xiàn)象（圖2G）。結(jié)核菌感染6周動(dòng)物肺臟出現(xiàn)大量肉芽腫（圖2D），脾臟組織充血現(xiàn)象較嚴(yán)重（圖2H）。結(jié)核菌感染8周肺臟組織肉芽腫面積和6周時(shí)相比稍有增多，大體解剖可見(jiàn)肺臟表面存在白色粟粒狀結(jié)節(jié)。結(jié)核菌感染8周脾臟病理表現(xiàn)和6周時(shí)無(wú)明顯差異（圖2見(jiàn)彩插4）。

注：圖中顯示小鼠感染結(jié)核分枝桿菌后不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定脾臟和肺臟組織荷菌量的對(duì)數(shù)值。在感染后1 d和1周時(shí)，肺臟組織沒(méi)有檢測(cè)出結(jié)核菌。圖1 小鼠感染結(jié)核菌脾肺組織荷菌量變化Note：Log10 CFU of bacteria Load of spleenand lung in M.tuberculosis infected mice at different time point.There was no TB detected in lung ofinfected mice at 1 day and 1 week.Fig.1 Changes of bacterial load in the spleen andlung in the M.tuberculosis infected mice

3 討論

結(jié)核感染動(dòng)物模型在抗結(jié)核藥物的臨床前評(píng)價(jià)中具有重要作用，目前有多種動(dòng)物被應(yīng)用，包括小鼠、豚鼠、兔以及非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物。雖然小鼠在感染結(jié)核分枝桿菌后的病理以及臨床表現(xiàn)和人類(lèi)疾病的癥狀有較大差別，但由于其經(jīng)濟(jì)性，小鼠的感染模型在新藥的藥效學(xué)評(píng)價(jià)上仍是首選的模型。

目前國(guó)際上流行的結(jié)核感染小鼠模型有多種，最早的結(jié)核感染小鼠模型是以高劑量的結(jié)核分枝桿菌通過(guò)尾靜脈注射血行感染動(dòng)物，這一模型模擬了結(jié)核感染的血行擴(kuò)散，最早在脾臟和肝臟等組織造成病理?yè)p傷［2］。上世紀(jì)末開(kāi)始有人使用氣溶膠發(fā)生器通過(guò)呼吸道用較低劑量的結(jié)核分枝桿菌以氣溶膠的形式感染動(dòng)物，該模型更好的模擬了病原體在人類(lèi)的傳播方式，在動(dòng)物首先造成了肺臟的感染，模擬了結(jié)核病早期肺結(jié)核的癥狀［3］。但是由于感染動(dòng)物肺臟組織要在3～4周后組織荷菌量才可以維持相對(duì)穩(wěn)定，造模需要的時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)；在感染劑量上不同動(dòng)物也存在著有差異的可能，這種模型也有一定的局限性。

不同品系的動(dòng)物對(duì)于結(jié)核分枝桿菌的易感性存在差異，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的得到的數(shù)據(jù)也不盡相同，有些實(shí)驗(yàn)室使用遠(yuǎn)交系小鼠［4］，更多的實(shí)驗(yàn)室使用近交系小鼠［5］。DBA/2小鼠對(duì)于結(jié)核分枝桿菌抗性較弱，易死亡，表現(xiàn)為對(duì)結(jié)核分枝桿菌的易感；而C57和BAlB/c等品系的動(dòng)物在感染結(jié)核分枝桿菌后不易死亡，相對(duì)不易感［6］。在抗結(jié)核藥物的藥效學(xué)評(píng)價(jià)中C57和BALB/c小鼠應(yīng)用較多。

我們實(shí)驗(yàn)室采用尾靜脈血行感染的方式以3× 105CFU的結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染近交系小鼠C57BL/6J。過(guò)高的感染劑量可能引起感染動(dòng)物過(guò)早死亡，不利于體內(nèi)藥效學(xué)評(píng)價(jià)信息收集。感染后第二天脾臟即可檢出結(jié)核菌，脾臟組織的荷菌量隨時(shí)間逐漸增加，三周后達(dá)到較高的荷菌量，之后維持相對(duì)的穩(wěn)定；肺臟中結(jié)核菌出現(xiàn)較晚，在感染后兩周有菌檢出，荷菌量隨時(shí)間不斷增加。感染一周后小鼠肺臟出現(xiàn)間質(zhì)水腫和炎性細(xì)胞滲出，脾臟出現(xiàn)炎性細(xì)胞聚集；三周后肺、脾組織出現(xiàn)肉芽腫，并隨時(shí)間不斷增加數(shù)量，增大面積。這些結(jié)果表明該模型造成了動(dòng)物的急性結(jié)核菌感染。由于實(shí)驗(yàn)周期有限，本實(shí)驗(yàn)未分析小鼠感染8周之后的情況。這種急性感染模型可以在感染早期用于抗結(jié)核受試物的藥效學(xué)評(píng)價(jià)。

［1］袁偉，秦川.結(jié)核病動(dòng)物模型研究進(jìn)展［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2010，20（9）：55-59.

［2］Pierce C，Dubos RJ，Midd lebrook G.Infection of mice with mammalian tubercle bacilli grown in tween-albumin liquid medium［J］.JExp Med，1947，86（2）：159-174.

［3］Brian PK，Synthia KF，Michael TJ，et al.Low-dose aerosol infection model for testing drugs for efficacy against Mycobacterium tuberculosis［J］.Antimicrob Agents Chemother，1996，40（12）：2809-2812.

［4］Enrique JA，Janna LC，Michael HC.In vitro and in vivo activities of gatifloxacin against Mycobacterium tuberculosis［J］.Antimicrob Agents Chemother，2002，46（4）：1022-1025.

［5］Zhang T，Zhang M，Rosenthal IM，et al.Short-course therapy with daily rifapentine in a murine model of latent tuberculosis infection［J］.Am J Respir Crit Care Med，2009，180（11）：1151-1157.

［6］Medina E，North RJ.Resistance ranking of some common inbred mouse strains to Mycobacterium tuberculosis and relationship to major histocompatibility complex haplotype and Nramp1 genotype［J］.Immunology 1998，93：270-274.