衛(wèi)兵艷，劉田福，郭永昌，張引紅

（山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，太原 030001）

脂肪組織不僅是機(jī)體的能量儲存庫，還是體內(nèi)很大的內(nèi)分泌器官；它可以合成或分泌多種具有廣泛生物活性的蛋白質(zhì)或細(xì)胞因子，包括周脂素（perilipin）、脂聯(lián)素（adiponectin）、瘦素（leptin）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）［1-2］等這些因子與許多肥胖相關(guān)性疾病如胰島素抵抗、糖尿病、內(nèi)皮功能障礙、高血壓病、動(dòng)脈硬化癥等有關(guān)。體內(nèi)能量代謝的核心反應(yīng)是脂肪細(xì)胞的脂解。近年的研究表明［3］，該反應(yīng)主要由脂酶從胞液易位至細(xì)胞內(nèi)脂滴的表面來調(diào)控的，該脂滴表面包被的蛋白中周脂素的磷酸化是HSL易位所必需的。由于周脂素在脂質(zhì)分解中的重要作用，故成為近年來研究的熱點(diǎn)。

周脂素是一種新近在大鼠附睪脂肪組織中發(fā)現(xiàn)并命名的高磷酸化蛋白，特異表達(dá)于脂肪細(xì)胞和類固醇生成細(xì)胞脂質(zhì)小滴表面［4］。新近研究表明，脂肪分解調(diào)控中的關(guān)鍵蛋白perilipin可能和2型糖尿病、肥胖、動(dòng)脈粥樣硬化等多種代謝性疾病及心血管疾病有關(guān)［4-6］。但其作用機(jī)制尚不完全清楚。雖然周脂素的功能研究取得了一定進(jìn)展，但關(guān)于周脂素的作用機(jī)制以及重組基因藥物產(chǎn)品開發(fā)等方面，還有待進(jìn)一步研究。

以脂肪組織為材料提取高質(zhì)量的總RNA主要存在兩方面的問題：第一，脂肪組織RNA含量較少，每毫克組織樣品所得總RNA的量小于0.05μg；第二，內(nèi)源和外源性RNA酶對RNA的降解。因而所提RNA的得率較低。為獲得高質(zhì)量的RNA制品，本實(shí)驗(yàn)以脂肪組織為材料，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，在商家提供的總RNA提取試劑的操作步驟基礎(chǔ)上優(yōu)化和改進(jìn)了某些提取過程，從而得到了符合實(shí)驗(yàn)要求的高質(zhì)量的總RNA。利用改進(jìn)后的方法提取了C57BL/ 6J小鼠脂肪組織RNA。以此為模板進(jìn)行RT-PCR，克隆了周脂素基因并對核酸序列進(jìn)行分析，為下一步進(jìn)行重組周脂素的大量表達(dá)及其生物學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：C57BL/6J小鼠購于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（晉2009-0001）。實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物處置符合2006年科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》［7］。

1.1.2 載體及宿主菌：受體菌E.coli JM109由本室保存；pMD18-T購自大連TaKaRa公司。

1.1.3 其他相關(guān)試劑：RNAisoTMPlus、限制性內(nèi)切酶SpeⅠ和NotⅠ、DNA marker，均購于大連TaKaRa公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購于 O MEGA公司，LAmp二步法 R T-PCR試劑盒、DNA回收純化試劑盒、T4DNA連接酶、加A試劑盒均購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提?。喊凑赵噭┖姓f明書進(jìn)行，部分操作步驟做相應(yīng)的改進(jìn)：（1）取新鮮的脂肪組織并將樣品的量加大到1 g，RNAisoTMPlus的量加大到20 m L。（2）第1次離心后上層含有大量油脂，用吸頭除去，保證完全去除油脂污染，然后再離心5 min。（3）進(jìn)行兩次氯仿抽提，以去除DNA的污染。（4）用75％的乙醇洗RNA沉淀后，再用無水乙醇洗1次，縮短RNA沉淀晾干的時(shí)間，可避免RNA在空氣中暴露時(shí)間過長而增加外源RNase對RNA的降解。紫外分光光度計(jì)測定RNA的純度及含量，利用瓊脂糖凝膠電泳快速鑒定所提取的總RNA的質(zhì)量。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)及其產(chǎn)物純化

1.2.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)GenBank中C57BL/6J小鼠周脂素的基因的序列，設(shè)計(jì)引物：序列如下（下劃線部分為酶切位點(diǎn)，斜體部分為保護(hù)性堿基。）：5＇端引物：5＇-GGACTAGTCTTGGGCG TTTGCCTTACCT-3＇（引入 S peⅠ酶切位點(diǎn)及保護(hù)性堿基），3＇端引物：5＇-AAGGAAAAAA GCGGCCGCCCTTGACGAGCAGCGACCTT-3＇（引入NotⅠ酶切位點(diǎn)及保護(hù)性堿基）用于擴(kuò)增周脂素全長編碼區(qū)。該引物由北京奧科公司合成。

1.2.2.2 RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA：在0.2 m L的PCR管中加入下列成分：總 R NA（0.5μg/μL）4μL，Oligo d（T）18（100μmol/L）1μL，dNTP（2.5 mmol/L each）4μL，滅 R NA酶水4μL，混勻后置PCR儀中，65℃，5 min，迅速冰浴10 m in，短暫離心后繼續(xù)加入下列成分：5×RT buffer，5μL，RNA酶抑制劑（20 U/μL）1μL，0.1 mol/L DTT 2μL，混勻后置PCR儀中，37℃，孵育2 min后加入HiFi-MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶 （ 200 U/μL）1μL，混勻后置PCR儀中，37℃50 min，終止反應(yīng)，置 - 20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 周脂素基因的擴(kuò)增：在0.2 mL的PCR管中加入下列成分：cDNA 4μL，10×LAmp PCR buffer 5μL，10μmol/L的正、反義引物各 2 μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L each）4μL，5×RT-PCR enhancer 10μL，LAmp DNA polymerase 0.5μL加雙蒸水補(bǔ)足體積至50μL，混勻后置PCR儀中。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min，然后94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，循環(huán)30次，72℃延伸5 m in，終止反應(yīng)。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，紫外燈下觀察電泳結(jié)果并照相。

1.2.2.4 PCR產(chǎn)物的純化回收：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外燈下切取含有目的基因的瓊脂糖凝膠塊，按膠回收試劑盒說明書中的方法，回收膠塊中的目的片段。

1.2.3 周脂素基因編碼區(qū)克隆、酶切及其DNA序列分析：

1.2.3.1 PCR產(chǎn)物加A：純化的目的基因7μL，dATP 1μL，10×A-tailing buffer 1μL，Tag DNA polymerase 1μL，混勻后置PCR儀中，72℃保溫30 m in。

1.2.3.2 PCR產(chǎn)物T-A克隆及鑒定：在10μL連接反應(yīng)體系中，將加A的目的片斷與pMD18-T載體按摩爾數(shù)3∶1混合，加入T4DNA連接酶和連接緩沖液，22℃孵育1 h后，65℃10 m in滅活T4DNA連接酶，然后取上述連接產(chǎn)物10μL轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)菌100μL，將轉(zhuǎn)化后的DH5α涂布于含氨芐青霉素（100μg/m L）及X-Gal（40 μg/m L）、IPTG（24μg/m L）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單個(gè)白色菌落置于LB液體培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)speⅠ/NotⅠ雙酶切鑒定含有目的基因的質(zhì)粒由大連TaKaRa公司進(jìn)行DNA測序，并將測序結(jié)果與GenBank中的已知基因序列及氨基酸序列進(jìn)行比對。

1.2.3.3 C57BL/6J重組質(zhì)粒的DNA序列分析：陽性克隆用通用引物測序，測序結(jié)果表明序列與GenBank比對達(dá)到100％一致（GenBank accession number：NM_175640.2）。

2 結(jié)果

2.1 C57BL/6J小鼠附睪脂肪組織總RNA的提取結(jié)果

提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度儀測定A值。A260/A280=1.89，比值在1.8～2.0之間；總RNA經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳可見28、18s 2條清晰的條帶，并且28s/18s≈2.0（圖1），表明提取的總RNA質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求，可用于逆轉(zhuǎn)錄。

圖1 C57BL/6J脂肪組織總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Representative electrophoresis tracing of the total RNA from C57BL/6Jmouse adipose tissue

2.2 RT-PCR結(jié)果

提取C57BL/6J小鼠附睪脂肪組織的總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，1.2％瓊脂糖凝膠電泳可見與預(yù)期設(shè)計(jì)的周脂素基因片段大小一致的擴(kuò)增條帶（包括兩側(cè)酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基）（圖2）。

圖2 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Representative electrophoresis tracing of the RT-PCR products

2.3 PCR產(chǎn)物T-A克隆結(jié)果

經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增的周脂素基因片段與pMD18-T載體連接構(gòu)建成pMD18-T-plin重組載體，經(jīng)speⅡNotⅠ雙酶切，1.2％瓊脂糖凝膠電泳可見2條帶，中1條帶與RT-PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果完全一致，另1條與pMD18-T載體片段（2 692 bp）的大小一致，見圖3。

2.4 周脂素重組質(zhì)粒的DNA序列分析

陽性克隆用通用引物測序，測序結(jié)果表明序列與GenBank比對均為100％一致（GenBank accession number：D45371）。測序圖譜見圖4、5。表明pMD18-T載體中已含有周脂素基因片段。

圖3 周脂素重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Electrophoresis of the recombinant plasm id perilipin using double enzyme digestion

3 討論

由于脂肪組織富含脂類物質(zhì)，單位體積細(xì)胞數(shù)較少，且單位細(xì)胞RNA含量也相對較少，按照RNAisoTMPlus試劑說明書提取脂肪組織RNA效果并不理想，所以如何有效地除去脂類的污染和最大限度地提高產(chǎn)量是在提取脂肪組織RNA過程中不可忽視的問題。在脂肪組織RNA提取過程中，對其中一些步驟作了適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)。本實(shí)驗(yàn)主要做到以下幾點(diǎn)：①樣品量足，一般組織的RNA提取樣品量大概是100 mg，本實(shí)驗(yàn)將樣品量加大到1 g進(jìn)行提取從而保證了RNA的得率。②樣品組織裂解充分，短時(shí)間內(nèi)液氮研磨至粉末狀加入超量的裂解液快速研磨至透明后劇烈震蕩3 min，保證了裂解液與組織的充分接觸。③除脂徹底，將樣品與裂解液反應(yīng)后，離心5 min后，用吸頭除去了上層的脂類，取得的下層溶液應(yīng)做同樣的2次離心以保證完全去除脂類污染。④去除內(nèi)源和外源性RNA酶的影響，實(shí)驗(yàn)過程中使用的實(shí)驗(yàn)材料均用0.1％的DEPC水處理后，高壓滅菌，操作過程戴口罩帽子，盡量保持環(huán)境潔凈，液氮研磨充分，用75％的乙醇洗完RNA沉淀后，再用無水乙醇洗1次［8］，以此減少內(nèi)外源性RNA酶的影響。從而得到了高質(zhì)量的RNA，為后續(xù)擴(kuò)增周脂素基因做了充分保證。

圖4 周脂素的測序圖譜Fig.4 Sequencing map of the plasm id perilipin

圖5 周脂素克隆序列比對部分結(jié)果Fig.5 Sequence analysis of the plasm id perilipin

周脂素由Plin基因編碼［9］。Perilipin氨基末端大約100個(gè)氨基酸的區(qū)域與ADRP的氨基末端區(qū)域極為相似，被稱為PAT結(jié)構(gòu)域。鼠的perilipin基因定位于第7號染色體，人的基因定位于15q26，含有9個(gè)外顯子。研究發(fā)現(xiàn)，perilipin可能在脂肪分解調(diào)控中起到“分子開關(guān)”的作用，在脂肪水解和機(jī)體能量代謝過程中發(fā)揮著雙重作用［3］，既可通過阻止脂肪酶接近脂滴降低基礎(chǔ)狀態(tài)下的脂解，又可促進(jìn)激素刺激的脂肪分解，可以調(diào)控脂解率以及脂肪組織中甘油三酯的輸出。腫瘤壞死因子α（TNF-α）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）激動(dòng)劑、瘦素（leptin）等均可以影響perilipin的表達(dá)［10-12］。由于周脂素與脂代謝的具體作用目前還不明確［13，14］，其可能是聯(lián)系胰島素抵抗與代謝性疾病的重要環(huán)節(jié)，在脂質(zhì)沉積及有序排列中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［15-16］，其在脂代謝中的關(guān)鍵作用可能與肥胖及相關(guān)疾病的發(fā)生有關(guān)［17］。

實(shí)驗(yàn)經(jīng)過提取脂肪總RNA、Rt-PCR、T-A克隆，得到周脂素編碼區(qū)重組質(zhì)粒，測序結(jié)果表明，序列與Genbank比對均為100％一致（GenBank accession number：NM_175640.2）。本實(shí)驗(yàn)得到?jīng)]有任何突變的基因，考慮與以下因素有關(guān)：①附睪脂肪組織總RNA的提取質(zhì)量較高為進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄提供保證。②引物的GC比例設(shè)定合適（上游為55％，下游為60％），因而提高了基因擴(kuò)增的特異性。③割膠純化時(shí)，操作速度很快，減少了紫外線對目的基因的損傷。紫外線可引起DNA損傷，應(yīng)盡量減少其照射時(shí)間。④對純化的目的片段進(jìn)行了加A反應(yīng)，同時(shí)pMD18-T克隆載體是線性化的載體，其3’端有1個(gè)T伸出，顯著提高了重組效率。本實(shí)驗(yàn)成功地克隆沒有任何突變的周脂素基因，為對其進(jìn)行精確實(shí)驗(yàn)提供了根本保障；為進(jìn)一步真核表達(dá)周脂素蛋白，建立周脂素轉(zhuǎn)基因小鼠，分析周脂素的生物功能及作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；為進(jìn)一步理解體脂分布異常，胰島素抵抗開辟一新的方向，最終為探索該類藥物的開發(fā)提供嶄新的思路；可能也將為糖尿病等相關(guān)疾病的臨床工作提供一種新的防治策略。

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