謝興亮，盛艷梅，韓麗，楊明

愈腸寧胃-結(jié)腸分釋膠囊對三硝基苯磺酸致大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的影響

謝興亮，盛艷梅，韓麗，楊明

目的評價愈腸寧胃-結(jié)腸分釋膠囊的藥效，并探討其作用機制。

方法SD 大鼠 48 只，按體重隨機分為正常組、對照組、陽性對照組、愈腸寧胃-結(jié)腸分釋膠囊低劑量組（膠囊低劑量組）、愈腸寧胃-結(jié)腸分釋膠囊高劑量組（膠囊高劑量組）、愈腸寧溶液組（溶液組），每組 8 只。正常組、對照組均給予同體積生理鹽水，陽性對照組給予柳氮磺吡啶腸溶片，其余 3 組分別給予不同劑量的愈腸寧胃-結(jié)腸分釋膠囊和愈腸寧溶液。各組給藥 3 d 后，以三硝基苯磺酸誘導(dǎo)建立大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，各組繼續(xù)給藥至 8 d 后結(jié)束實驗，取大鼠結(jié)腸組織測定腸重系數(shù)，觀察并評價給藥后結(jié)腸組織損傷指數(shù)，同時檢測結(jié)腸組織髓過氧化物酶（MPO）、TNF-α、IL-1β、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平。結(jié)果與正常組比較，對照組大鼠腸重系數(shù)、結(jié)腸組織損傷指數(shù)差異顯著，結(jié)腸組織 SOD 水平顯著降低，MPO、TNF-α、IL-1β、MDA 水平顯著升高。與對照組相比，各給藥組大鼠腸重系數(shù)、結(jié)腸組織損傷指數(shù)（P＜ 0.05，P＜ 0.01）以及 MPO、TNF-α、IL-1β、MDA 水平均顯著降低；膠囊高劑量組、陽性對照組大鼠結(jié)腸組織 SOD 水平均顯著升高。與溶液組相比，陽性對照組、膠囊高劑量組大鼠腸重系數(shù)、結(jié)腸組織損傷指數(shù)均顯著降低（P＜ 0.05，P＜ 0.01）；膠囊高劑量組大鼠結(jié)腸組織 SOD 水平明顯升高，MPO、TNF-α、IL-1β 水平均顯著降低（P＜ 0.05，P＜ 0.01），MDA水平則無明顯差異。

結(jié)論通過抑制炎性細胞浸潤和促炎因子的異常釋放，以及調(diào)節(jié)失衡的氧自由基系統(tǒng)等作用機制，愈腸寧胃-結(jié)腸分釋膠囊表現(xiàn)出與同劑量愈腸寧溶液相比更明顯的療效優(yōu)勢，具有良好應(yīng)用前景。

結(jié)腸炎，潰瘍性； 疾病模型，動物； 中草藥； 遲效制劑； 膠囊

愈腸寧是治療潰瘍性結(jié)腸炎（UC）的中藥復(fù)方，由黃芪、苦參兩味藥組成。我們在前期研究中，以其中具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎止瀉等作用的藥效成分黃芪多糖、黃芪皂苷、苦參生物堿為原料，針對 UC 的病理特征以及藥效成分的理化性質(zhì)、藥效特點，設(shè)計制備了由黃芪組分胃速釋微丸、苦參組分結(jié)腸靶向釋藥微丸組成的愈腸寧胃-結(jié)腸分釋膠囊[1]。在此基礎(chǔ)上，為進一步評價該制劑設(shè)計制備的科學(xué)性、合理性，本研究我們選擇了三硝基苯磺酸（TNBS）誘導(dǎo)大鼠 UC 模型對其藥效進行評價，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 愈腸寧胃-結(jié)腸分釋膠囊為成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥藥劑教研室自制；苦參堿（M-071201）、氧化苦參堿（O-071201）、黃芪多糖提取物（20081012）均購自西安中鑫生物技術(shù)有限公司；黃芪皂苷提取物（XC080228）購自西安小草植物科技有限公司；柳氮磺吡啶腸溶片（SASP）為上海信誼嘉華藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：081103；2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）為美國 Sigma公司生產(chǎn)，批號：107K5008；TNF-a ELSIA 試劑盒（RT110371）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；IL-1β ELSIA試劑盒（20090110）購自武漢博士德生物工程有限公司；髓過氧化物酶（MPO）試劑盒（20090204）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（20090204）、丙二醛（MDA）試劑盒（20090204）、考馬斯亮藍試劑盒（20090204）均購自南京建成生物工程研究所。Model 550 酶標儀為美國 BIORAD 公司產(chǎn)品；UV1700 紫外分光光度計為日本島津公司產(chǎn)品；DY89-I 型勻漿機為寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；TG2-16C 型離心機為上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品。

1.1.2 實驗動物 健康 SD 大鼠兩批共 48 只，雌性，7 ～ 8 周齡，體重 200 ～ 250 g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（川）2008-11，飼養(yǎng)于清潔級動物房。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 待大鼠適應(yīng) 1 周飼養(yǎng)后，按體重隨機分成 6 組：正常組、對照組（造模大鼠）、陽性對照組、愈腸寧胃-結(jié)腸分釋膠囊低劑量組（膠囊低劑量組）、愈腸寧胃-結(jié)腸分釋膠囊高劑量組（膠囊高劑量組）、愈腸寧溶液組（溶液組），每組 8 只。

1.2.2 給藥方案 ①陽性對照組：取柳氮磺吡啶腸溶片，研細、過篩，配制成濃度為 30 mg/ml 的混懸液，以 0.6 g/kg 的劑量灌胃給藥；②膠囊低劑量組：以 7.3 mg/kg 的劑量，胃插管（內(nèi)徑 2.0 mm、外徑 3.0 mm）給予分釋膠囊中包衣微丸；③膠囊高劑量組：以 14.5 mg/kg 的劑量，胃插管（內(nèi)徑2.0 mm、外徑 3.0 mm）給予分釋膠囊中包衣微丸；④愈腸寧溶液按 7.8∶2.6∶1∶3 比例取黃芪多糖、黃芪皂苷、苦參堿、氧化苦參堿，配制成濃度為14.5 mg/ml 的混合溶液，以 0.29 g/kg 的劑量灌胃給藥（與膠囊高劑量組藥物量相同）。正常組和對照組均灌胃給予同體積的生理鹽水，各組均每日1 次給藥。

1.2.3 TNBS 誘導(dǎo)大鼠 UC 模型的建立 各組大鼠經(jīng)給藥 3 d 后，第 4 天禁食不禁水 24 h，進行乙醚吸入麻醉后，參照文獻[2]方法進行造模。取 5%（w/v）TNBS 水溶液，加入乙醇配制成濃度為 20 mg/ml 的 50% TNBS 乙醇溶液。經(jīng)各組大鼠肛門輕緩插入灌胃針 8 cm，按 64 mg/(kg·d) 劑量緩慢注入相應(yīng)體重比例的 TNBS 乙醇溶液，倒提 30 s，正常組大鼠灌腸給予相應(yīng)體積生理鹽水，使動物保持平躺，自然清醒。第 5 天起各組大鼠繼續(xù)給藥 8 d。1.2.4 實驗考察指標 實驗期間觀察動物便血、腹瀉、飲食及活動情況。實驗完成后，處死大鼠，取結(jié)腸，縱剖開后用冰生理鹽水洗凈糞便，濾紙吸干水分、稱量，計算腸重系數(shù)：結(jié)腸重/體重 × 100%。然后取小段結(jié)腸用 10% 甲醛固定，酒精脫水，石蠟包埋，切片后行 HE 染色，光鏡下觀察結(jié)腸病理變化，并參照文獻[2]中標準，采用雙盲法分項計分，最后將各項分數(shù)相加計算總分作為結(jié)腸組織損傷指數(shù)，以評價結(jié)腸的損傷程度（表 1）。另取炎癥改變較明顯的結(jié)腸，洗凈后制成勻漿，530 ×g離心 15 min，取上清液分裝，-20 ℃ 保存，分別按各試劑盒說明書檢測 TNF-α、IL-1β、MPO、SOD、MDA 水平及總蛋白含量，并以總蛋白含量對前述各指標數(shù)據(jù)進行校正。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 13.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理，首先對各組數(shù)據(jù)進行正態(tài)檢驗（normality plots with tests），方差齊時采用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差不齊時采用非參數(shù)檢驗（nonparametric tests）。以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對大鼠結(jié)腸腸重系數(shù)及組織學(xué)損傷的影響

與正常組比較，對照組大鼠腸重系數(shù)明顯增加，結(jié)腸組織損傷指數(shù)差異顯著，潰瘍面積大、病變深、炎癥明顯、伴有纖維化和肉芽組織。與對照組相比，各給藥組大鼠腸重系數(shù)、結(jié)腸組織損傷指數(shù)均顯著降低，表現(xiàn)出明顯的抗 TNBS 損傷作用。與溶液組相比，陽性對照組、膠囊高劑量組大鼠腸重系數(shù)、結(jié)腸組織損傷指數(shù)均顯著降低，表現(xiàn)出更好的抗結(jié)腸炎性損傷和增生的作用（表 2，圖 1）。

2.2 大鼠結(jié)腸組織 SOD、MDA 水平

與正常組比較，對照組大鼠結(jié)腸組織 SOD 水平顯著降低，MDA 水平顯著升高，表明結(jié)腸組織自由基處于失衡狀態(tài)。與對照組相比，膠囊高劑量組、陽性對照組大鼠結(jié)腸組織 SOD 水平均顯著升高，MDA 水平顯著降低。與溶液組相比，膠囊高劑量組大鼠結(jié)腸組織 SOD 水平升高的更為明顯，而 MDA 水平則無顯著差異（表 2）。

表1 大鼠結(jié)腸病理損傷程度評分標準[2]Table 1 The score standard for the degree of colon pathological injury of rats

表 2 各組大鼠結(jié)腸組織損傷情況及 SOD、MDA 水平（x± s ，n = 8）Table 2 The level of SOD , MDA and colon tissue injury of rats in different groups (x± s , n = 8)

表 3 各組大鼠結(jié)腸組織 MPO、TNF-α、IL-1β 水平（x± s ，n = 8）Table 3 The level of MPO, TNF-α and IL-1β of rats in different groups (x± s , n = 8)

圖 1 大鼠結(jié)腸組織損傷的組織學(xué)觀察 HE × 100（A：正常結(jié)腸組織；B：結(jié)腸組織漿膜層炎癥；C：結(jié)腸組織潰瘍；D：結(jié)腸壞死組織；E：結(jié)腸肉芽組織；F：結(jié)腸組織纖維化）Figure 1 Histological observation of colon tissue injury of rats HE × 100.A: Normal colon tissue; B: Inflammation of placenta percreta in colon tissue; C: Ulcer of colon tissue; D: Necrotic tissue of colon; E: Granulation tissue of colon; F: Fibrosis of colon tissue.

2.3 大鼠結(jié)腸組織 MPO、TNF-α、IL-1β 水平

與正常組比較，對照組大鼠結(jié)腸組織 MPO、TNF-α、IL-1β 水平均顯著升高，中性粒細胞浸潤明顯，促炎因子分泌十分活躍。與對照組相比，各給藥組大鼠結(jié)腸組織 MPO、TNF-α、IL-1β 水平均顯著降低，顯示出良好的抗中性粒細胞浸潤和促炎因子釋放的作用。與溶液組相比，膠囊高劑量組大鼠結(jié)腸組織 MPO、TNF-α、IL-1β 水平均顯著降低，顯示出更強的下調(diào)炎性反應(yīng)作用（表 3）。

3 討論

目前，UC 的特異性病因尚不明確，但結(jié)腸炎性反應(yīng)導(dǎo)致的組織損傷是其病理學(xué)關(guān)鍵[3]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，UC 患者活動期結(jié)腸黏膜組織 MPO、TNF-α、IL-1β、MDA 水平均明顯升高，SOD 水平顯著下降，其中 TNF-α、IL-1β 是公認的能介導(dǎo) UC急性炎癥損傷的重要因子，其含量與病變程度呈正相關(guān)[3]。MPO 是反映中性粒細胞浸潤程度的特征性指標，UC 發(fā)作時大量中性粒細胞在結(jié)腸黏膜聚集，釋放炎性介質(zhì)參與炎癥反應(yīng)。TNBS 誘導(dǎo)大鼠UC 模型能很好地體現(xiàn)上述指標變化，與人體 UC病理反應(yīng)相似，較適合于藥物藥效和作用機制的研究[4]。本實驗結(jié)果表明，愈腸寧胃-結(jié)腸分釋膠囊能顯著對抗 TNBS 導(dǎo)致的大鼠結(jié)腸組織病理損傷，其作用機制主要表現(xiàn)為對抗結(jié)腸局部 TNF-α、IL-1β 等促炎因子分泌和中性粒細胞浸潤，以及調(diào)節(jié)失衡的自由基系統(tǒng)。

制劑釋藥行為是影響其療效的關(guān)鍵因素之一，特別是化學(xué)組成復(fù)雜的中藥復(fù)方制劑。我們的課題研究根據(jù)：①臨床治療 UC 時，黃芪多采用煎湯、入丸散口服，苦參多以煎湯灌腸；②黃芪中皂苷、多糖主要在小腸吸收后發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，但其黏性較大，水溶性不佳而影響其溶出度；③苦參生物堿抗炎止瀉作用強度與其在效應(yīng)室的濃度直接相關(guān)，但其口服吸收后在結(jié)腸分布有限等認識，將黃芪多糖、皂苷制成胃部速釋微丸以改善其溶出性能，苦參生物堿制成結(jié)腸靶向微丸以提高其在結(jié)腸的藥物濃度，再將兩者組合成具有兩步釋藥特征的現(xiàn)代中藥復(fù)方釋藥系統(tǒng)——愈腸寧胃-結(jié)腸分釋膠囊，以充分發(fā)揮復(fù)方中各種成分的綜合作用，但其實際療效如何，還需要進行客觀評估。在本研究中，與同劑量愈腸寧溶液相比，該膠囊顯示出明顯的療效優(yōu)勢，表明研究擬定的愈腸寧胃-結(jié)腸分釋膠囊制劑設(shè)計、制備方案基本達到了以制劑增效的設(shè)計目標。此次研究結(jié)果提示，我們在前期課題研究中提出的將多元釋藥技術(shù)用于中藥復(fù)方以制備現(xiàn)代中藥復(fù)方釋藥系統(tǒng)[5]這一新思路具有良好應(yīng)用前景，值得繼續(xù)深入研究。

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www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2011, 6(2):111-115

Effect of Yuchangning capsule releasing drug respectively in stomach and colon on ulcerative colitis in rats caused by TNBS

XIE Xing-liang, SHENG Yan-mei, HAN Li, YANG Ming

ObjectiveTo evaluate the pharmacodynamic action of Yuchangning capsule releasing drug respectively in stomach and colon, and explore the mechanism of action.

MethodsThe forty-eight SD rats were randomly individed into normal group, control group, positive control group, the low dose of capsule group, the high dose of capsule group and liquor group with eight rats in each group.The rats in the normal and control groups were perfused with the same volume physiological saline, the rats in the positive control group were perfused with sulfasalazine, and the rats in the other three groups were perfused with the different doses of Yuchangning capsule releasing drug respectively in stomach and colon and Yuchangning liquor.3 days after the perfusion, the trinitro-benzene-sulfonic acid was perfused into the rats in order to establish the rat model of ulcerative colitis, and the experiment was finished on the 8th day after continuous perfusion.The colon tissue of rats were taken to determine the coefficient of colon weight, observe and evaluate the exponent of colon injury, and detect the level of MPO, TNF-α, IL-1β, SOD and MDA in colon tissue.

ResultsCompared with the normal group, the coefficient of colon weight and exponent of colon injury showed remarkable differences, the level of SOD in colon tissue remarkably decreased, and the level of MPO, TNF-α, IL-1β, MDA remarkably increased in the control group.Compared with the control group, the coefficient of colon weight, exponent of colon injury (P＜ 0.05,P＜ 0.01)and the level of MPO, TNF-α, IL-1β and MDA all remarkably decreased in the other groups, the level of SOD remarkably increased in the high dose of capsule group and positive control group.Compared with the liquor group, the coefficient of colon weight and exponent of colon injury both remarkably decreased (P＜ 0.05,P＜ 0.01) in the hige dose of capsule group and positive control group;At the same time, the level of SOD remarkably increased, and the level of MPO, TNF-α, IL-1β all remarkably decreased (P＜ 0.05,P＜ 0.01).There was no significant difference in the level of MDA between the high dose of capsule group and the liquer group.

Conclusion Through the mechanism of inhibiting the infiltration of inflammatory cells and the abnormal release of proinflammatory factors, and adjusting the disequilibrium of oxygen-derived free radicals, the Yuchangning capsule releasing drug respectively in stomach and colon showed better curative effect than the same dose of Yuchangning liquor, and possessed fine application prospects.

Colitis, ulcerative; Disease models, animal; Drug, Chinese hebal; Delayed-action preparations; Capsules

YANG Ming, Email: yangming16@126.com

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2011, 6(2):111-115

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.02.006

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2009ZX09103-307）

610083 成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥劑教研室（謝興亮），藥理教研室（盛艷梅）；611173 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥劑教研室（韓麗）；330004南昌，江西中醫(yī)學(xué)院現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室（楊明）

楊明，Email：yangming16@126.com

2011-01-24

Author Affiliations: Department of Pharmacy (XIE Xing-liang), Department of Pharmacology (SHENG Yan-mei), Pharmaceutical College, Chengdu Medical College, Chengdu 610083, China; Department of pharmacy, Pharmaceutical College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611173, China (HAN Li); Key Lab of Modern Preparation of TCM, Ministry of Education,Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China (YANG Ming)

·綜述·