富巖，韓國，楊小楠，富俞淞，邢靜，胡俊霞，陳穎，云文琦，于在林

兩種具長效性重組人血清白蛋白/干擾素α融合蛋白表達工程菌的構建及融合蛋白的理化特性研究

富巖，韓國，楊小楠，富俞淞，邢靜，胡俊霞，陳穎，云文琦，于在林

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術, 2011, 6(2):84-95

目的對兩種長效干擾素 α 融合蛋白原料藥的理化特性多項指標開展分析和進行比較。

方法利用基因工程技術分別構建了可高效表達重組人血清白蛋白/干擾素 α2a 融合蛋白（rHSA/IFNα2a）或重組人血清白蛋白/干擾素 α2b 融合蛋白（rHSA/IFNα2b）的畢赤酵母工程菌。融合蛋白直接分泌到組分簡單的無機鹽培養(yǎng)基中，并經(jīng)特別建立的高效分離純化工藝進行純化，隨后對兩個融合蛋白進行詳盡的理化特性分析。

結果獲得的融合蛋白純度在 98% 以上；N 端前 15 個氨基酸序列與理論序列相同；質譜分子量分別為 85640.8 D和85781.5 D；圓二色光譜分析比對蛋白空間構象未變；等電點 pI 約在 5.1 左右；為非糖基化蛋白；紫外光譜呈典型蛋白質光譜；自由巰基含量測定值為 1.4；肽圖批次間一致；肽質量指紋圖譜可匹配分別達 83% 和 82%；對制備的2 個融合蛋白原料藥中的細菌內(nèi)毒素、宿主蛋白質、外源性 DNA、甲醇和甘油的殘留量檢測符合標準要求；融合蛋白的免疫學鑒別為陽性；體外細胞生物比活性約為 2.5 ×105IU/mg，并且 2 個融合蛋白生物比活性測定值無不同，由此，獲得了符合臨床用藥標準的原料藥。

結論研究所獲得的結果可以作為指導《注射用重組人血清白蛋白/干擾素 α2a 融合蛋白》和《注射用重組人血清白蛋白/干擾素 α2b 融合蛋白》2 個新藥的原料藥生產(chǎn)質量標準的建立和檢定方法的確定。

干擾素 α； 血清白蛋白； 畢赤酵母； 重組融合蛋白質類

人干擾素（human interferon，hIFN）是一類重要的細胞因子，它是機體受到病毒感染時，免疫細胞通過對侵染源做出應答反應而產(chǎn)生的一組結構類似、功能相近的低分子糖蛋白。干擾素 α 屬于I 類干擾素，主要有干擾素 α2a 和干擾素 α2b，均由白細胞產(chǎn)生，并且干擾素 α2a 和干擾素 α2b 是現(xiàn)在臨床上使用最為廣泛的慢性病毒性肝炎的特效藥[1]。兩者的氨基酸序列僅在第 23 位的氨基酸不同，干擾素 α2a 是精氨酸（K），而干擾素 α2b 是賴氨酸（R）。市售重組干擾素 α 是由細菌或畢赤酵母菌表達的非糖基化蛋白質藥物，可用于乙型肝炎、丙型肝炎和部分癌癥的治療[2]。對臨床應用結果觀察表明，不同個體對這兩種干擾素 α 的反應不同，使得它們一定要作為兩個完全獨立的治療用藥物來適用于不同個體的臨床治療應用中。由于重組干擾素 α 的血藥半衰期僅有 3 h，患者需要每天1 次或隔天的頻繁連續(xù)用藥達 6 個月以上才具有治療效果，患者的依從度極低，難以獲得良好的治療效果[3]。為此，研發(fā)具長效性重組干擾素 α2a 和α2b 是十分必要的。利用聚乙二醇（PEG）化學修飾法對重組干擾素 α 進行加工，可以使得重組干擾素 α 長效化[4]。但是，所有 PEG-干擾素 α 都是在常規(guī)的原液基礎上進行再次加工，修飾得率不高，臨床用藥劑量大大提高、生產(chǎn)成本也遠高于常規(guī)藥物 20 倍以上，同時產(chǎn)生的副作用也較為明顯[5]。為此，尋找新的干擾素長效化的方法一直在繼續(xù)。

人血清白蛋白（HSA）是一種可溶性的、含有585 個氨基酸和 17 對二硫鍵的一種球狀非糖基化蛋白質。人體內(nèi)每升血液含有約 50 g 血清白蛋白，從而構成人體血液中蛋白總量的一半以上，并作為血液中的最主要和最基本的載體，攜帶和傳遞多肽蛋白質分子、脂肪酸、類固醇和激素分子等，其穩(wěn)定的惰性性質是維持血壓的一個重要因素，同時白蛋白在血液中的半衰期為 14 ～ 20 d[6]。白蛋白抵御生物體內(nèi)酶解的作用具有極大的優(yōu)勢，當其在與治療性蛋白質形成融合蛋白后，使得治療性蛋白質的半衰期獲得延長。1992年，Yeh 等[7]首次提出了利用酵母分泌的白蛋白/CD4 融合蛋白用于人類疾病的治療設想。十年來本課題組已對多種血細胞刺激因子融合蛋白、多種干擾素、白介素、皮膚細胞生長因子進行了作為長效藥物的可能性研究，并獲得大量研究資料和結果[8-10]。另外，Osborn 等[11]對人血清白蛋白與干擾素 α2b 融合蛋白（Albuferon）在猴體內(nèi)進行的藥代/藥動（PK/PD）試驗研究，Halpern 等[12]對人血清白蛋白/粒細胞刺激因子融合蛋白：Albugranin 的動物試驗結果都顯示出不同的人血清白蛋白融合蛋白在動物體內(nèi)均具有比常規(guī)重組蛋白質藥物更長的體內(nèi)半衰期特性。對人血清白蛋白與治療性蛋白質形成的融合蛋白所進行的研究，展示了一個新的蛋白質藥物長效化的技術方法。融合蛋白 Albuferon 和 Albugranin 均是由釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）表達和制備，而本課題組的白蛋白融合蛋白均是由畢赤酵母菌（Pichia pastoris）表達制備的。除了重組人血清白蛋白/干擾素 α2b 融合蛋白有較詳細的報道外[11,13-14]，重組人血清白蛋白/干擾素 α2a 融合蛋白和其他白蛋白融合蛋白的理化特性均未見報道。

利用我們創(chuàng)建的人血清白蛋白與治療性蛋白質的“無縫連接”方式將人血清白蛋白基因和治療性蛋白質基因融合，重組在酵母菌或脊椎動物細胞染色體上，將完整的融合蛋白分泌到細胞外。融合蛋白可以經(jīng)我們建立的一個具通用性的簡捷分離純化工藝[15]，獲得符合臨床用藥要求標準的高純度原料藥（原液）。為了獲得質量穩(wěn)定，安全有效的可用于臨床用藥的注射用針劑，進行了融合蛋白通用型制劑配方的篩選，可將人血清白蛋白融合蛋白制成為穩(wěn)定可靠的凍干粉針劑[16]。數(shù)個具長效性的重組人血清白蛋白/治療性蛋白質融合蛋白候選新藥已經(jīng)由本課題組通過這一技術平臺完成了包括藥學研究、動物安全性評價和臨床試驗方案設計在內(nèi)的臨床前研究工作，進入申報臨床試驗研究許可階段。

本文首次報道了由畢赤酵母（Pichia pastoris）重組工程菌分泌表達，經(jīng)過分離純化工藝獲得的兩種干擾素 α 融合蛋白所開展的理化特性分析，獲得的研究數(shù)據(jù)對理解人血清白蛋白融合蛋白的蛋白質特性、對融合蛋白可在體內(nèi)形成長效性，提供了分子結構的基礎性證明，也將對同類融合蛋白研究提供啟示作用。這些研究結果也將作為《注射用重組人血清白蛋白/干擾素 α2a 融合蛋白》和《注射用重組人血清白蛋白/干擾素 α2b 融合蛋白》新藥的質量標準和檢定指標（制檢規(guī)程），用于指導今后臨床用藥的生產(chǎn)質量控制，具有實際應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 本研究中使用的化學試劑均為分析純或藥用級；限制性內(nèi)切酶、DNA 連接酶、聚合酶、胰蛋白酶、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、DNA和蛋白質分子量標準品均購自美國 Promega 公司；分離純化介質填料均購自美國 GE Healthcare公司；兩性電解質購自美國 Ampholyte 公司；等電點標準品購自美國 Bio-Rad 公司；人血清白蛋白特異單克隆抗體購自美國 Sigma 公司；特異識別人干擾素 α 的鼠單克隆抗體購自美國 Calbiochem公司；重組人干擾素 α 生物學活性測定國家標準品購自中國藥品生物制品檢定所；畢赤酵母菌宿主蛋白檢測試劑盒為美國 Cygnus 公司產(chǎn)品；Dig-DNA 標記試劑盒為美國 Roche 公司產(chǎn)品；改進型 Lowry 法蛋白含量檢測試劑盒為美國 Pierce公司產(chǎn)品；細菌內(nèi)毒素檢測試劑盒為中國湛江安度斯生物有限公司產(chǎn)品；糖蛋白染色試劑盒為美國Thermo 公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器 LC-10Avp Plus 高效液相色譜儀為為日本島津公司產(chǎn)品；TSK-GEL/G2000SWXL 色譜柱（7.8 mm × 300 mm）購自日本 Tosoh 公司；氣相色譜儀（Agilent 6890N）和火焰離子化檢測器（FID）為美國 Agilent 公司產(chǎn)品；全自動控制 200 L發(fā)酵罐系統(tǒng)為中國江蘇鎮(zhèn)江東方生工公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 rHSA/IFNα2a 和 rHSA/IFNα2b 表達酵母工程菌株的構建 采用常規(guī)的基因克隆和 PCR 技術，分別擴增人血清白蛋白基因和人干擾素成熟肽基因片段先后插入轉移載體質粒 DNA 中。帶有分泌肽的人血清白蛋白基因全 DNA 序列的畢赤酵母菌轉移質粒 pAO815-HSA[17]含有 Bsu36I 和質粒 DNA 上的 XhoI 限制性內(nèi)切酶位點用于干擾素 α 成熟肽基因的插入。人干擾素（IFNα2b）基因的克隆是以人白細胞中提取的總 RNA 為模板，利用 RT-PCR 技術合成和擴增獲得的。干擾素 α2a成熟肽 DNA 序列的改造是使用點突變獲得的。人干擾素成熟肽的 N 端與人血清白蛋白成熟肽的C 端之間直接無縫基因融合，獲得 pAO815-HSA/IFNα2b 轉移質粒。pZY-HSA/IFNα2a 轉移質粒則含有 Zerocin 抗生素活性基因，可以生長在含有Zerocin 的 MD 培養(yǎng)基中。含有全融合蛋白基因序列的轉移質粒 DNA，通過電脈沖轉導與畢赤酵母菌 GS115 菌株染色體 DNA 同源序列間發(fā)生重組，將轉移質粒中的表達組盒重組在酵母菌染色體上。具體 DNA 克隆程序和所用的合成 HSA、hIFNα2a 和 hIFNα2b 的 DNA 引物序列等參見文獻[9]。融合蛋白基因表達啟動子是酵母菌的乙醇氧化酶（AOX1），當甲醇作為酵母菌生長唯一碳源使用時，也就同時啟動了融合蛋白的表達和生產(chǎn)。1.2.2 兩種 rHSA/IFNα 工程菌種子庫的建立和發(fā)酵工藝 高效表達 rHSA/IFNα 融合蛋白的畢赤酵母工程菌（rHSA/IFNα2a；rHSA/IFNα2b）按《中國藥典》2005 版三部[18]的《生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程》要求制備主種子庫和工作種子庫。菌種穩(wěn)定性經(jīng)連續(xù)傳代 30 次來驗證目的蛋白的表達水平變化。隨機選取工程菌菌落 50 個，采用 PCR 方法驗證目的蛋白基因序列是否有陽性反應。工作種子經(jīng)二級種子培養(yǎng)擴增 36 h后，接種于 200 L 發(fā)酵罐中，采用常規(guī)無機鹽培養(yǎng)基或改進的優(yōu)化無機鹽培養(yǎng)基進行酵母菌菌體的生長和擴增（約 24 h），待菌體濕重達到 350 ～ 400 g/L 時啟動甲醇流加，進入融合蛋白的誘導生產(chǎn)階段（約48 ～ 72 h）。甲醇和溶氧濃度均控制在適當數(shù)值條件，發(fā)酵工藝基本參照方法[17]。

1.2.3 rHSA/IFNα 的分離純化工藝 發(fā)酵結束后，發(fā)酵液經(jīng)板框過濾或連續(xù)流離心機將上清液和菌體分離。上清液經(jīng) 0.22 μm 濾芯除去不溶物和顆粒狀物質后，利用蠕動泵將含融合蛋白的上清液，直接上經(jīng)平衡液（25 mmol/L NaAc，pH 5.0）平衡的含 Capto-MMC介質的層析柱，上樣后用平衡液再平衡；使用緩沖液（50 mmol/L PB，pH 7.0）將雜蛋白洗脫，緩沖液（50 mmol/L PB，pH 7.0，0.6 mol/L NH4Cl）將融合蛋白洗脫，純度達 80% 以上；融合蛋白進一步經(jīng)疏水性介質（HIC）純化，使之純度達 95% 左右；融合蛋白再進一步經(jīng)離子交換層析填料做進一步精純，而后使用分子篩介質換液，獲得純度達 98% 以上的融合蛋白，作為注射用重組人血清白蛋白/干擾素 α 融合蛋白的原料藥（原液）。rHSA/IFNα 的分離純化工藝基本參照方法[15]。原液的蛋白含量測定采用文獻[18]附錄VIB 蛋白質測定法第二法 Lowry 法或改進型Lowry 試劑盒進行測定。原液中的細菌內(nèi)毒素測定采用文獻[18]附錄 XIIE 細菌內(nèi)毒素檢查法中的凝膠法，檢測細菌內(nèi)毒素試劑盒的鱟試劑標定靈敏度為 0.25 EU/ml。

1.2.4 rHSA/IFNα 免疫學鑒別 純化制備的rHSA/IFNα 按文獻[18]附錄 VIII A 免疫印跡法和VIII B 免疫斑點法進行兩種抗體的分別鑒別，第一抗體稀釋比為 300 ～ 1000 倍，第二抗體（熒光標記抗體）的使用則按出品單位操作說明書執(zhí)行。

1.2.5 rHSA/IFNα 的體外細胞學生物活性測定 rHSA/IFNα.的體外細胞學生物活性采用細胞病變抑制法[19]進行測定。干擾素具有可以保護人羊膜細胞（WISH）免受水泡性口炎病毒（VSV）破壞的作用，用結晶紫對存活的 WISH 細胞染色，于波長 570 nm 處測定其吸光度，可得到干擾素對WISH 細胞的保護效應曲線，以此測定重組人血清白蛋白/干擾素 α 融合蛋白（rHSA/IFNα）生物學活性。

1.2.6 rHSA/IFNα 純度分析

1.2.6.1 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDSPAGE） rHSA/IFNα 原液的電泳純度測定采用非還原型 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法進行測定。分離膠濃度為 7.5%，上樣量 10 μg（考馬斯亮藍R250 染色），對電泳結果用掃描儀成像，應用分析軟件分析各條帶的百分比，計算目的蛋白所占百分比。

1.2.6.2 凝膠分子排阻-高效液相法（SECHPLC） 采用凝膠分子排阻-高效液相法（SECHPLC）對干擾素融合蛋白進行純度檢測。高效液相色譜儀以 50 mmol/L PB，0.1 mol/L NaCl 緩沖液（pH 7.0）為流動相，在室溫條件下，進行洗脫。上樣量不低于 10 μg，檢測波長為 214 和 280 nm雙波長。以 rHSA/IFNα 色譜峰計算理論塔板數(shù)應不低于 1000。按面積歸一化法計算，rHSA/IFNα 峰面積要求不低于總面積的 95.0%。

1.2.7 rHSA/IFNα 分子量測定

1.2.7.1 還原型 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法 聚丙烯酰胺凝膠的分離膠濃度為 10%，上樣量為1 μg。經(jīng)考馬斯亮藍 R250 染色，對電泳結果用掃描儀成像，應用分析軟件以已知分子量標準品各條帶的相對遷移率距離制作直線回歸，根據(jù)目的蛋白的遷移率距離帶入直線回歸方程計算出 rHSA/IFNα 分子量。

1.2.7.2 質譜法 rHSA/IFNα 質譜分子量的測定由北京蛋白質組研究中心承擔。使用基質輔助激光解吸附電離飛行時間串聯(lián)質譜儀進行檢測，檢測條件：N2激光源，波長 337 nm；檢測方式：正離子，線性方式（飛行管長 1.5 m，加速電壓 20 kV），基質：SA。檢測到的多肽分子量與 rHSA/IFNα 各自的氨基酸序列的理論分子量進行比較。

1.2.8 圓二色光譜分析 rHSA/IFNα 的圓二色光譜測定工作由中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點研究室承擔。對照品 rhIFNα2a 和rhIFNα2b 為本室利用重組大腸桿菌表達，經(jīng)純化獲得的；rHSA 為本室制備的經(jīng)畢赤酵母工程菌表達和純化，純度為 99.9%。

1.2.9 甲醇和甘油殘留量測定 氣相色譜儀和火焰離子化檢測器用于甘油和甲醇檢測，方法為毛細管柱頂空進樣等溫法[20-21]，以不同量甲醇或甘油作為標準品參照，每個量點連續(xù)進樣 2 次，測量參照標準品溶液的峰面積，記錄色譜圖。待測樣品則按相同方法進樣和測定，根據(jù)用標準品制備的曲線，計算出待測樣品中的甘油或甲醇含量（殘留量）。甲醇的殘留量測定也采用了變色酸比色法[22]進行比較。

1.2.10 宿主蛋白和外源性 DNA 殘留量測定 畢赤酵母菌的宿主蛋白質殘留量測定使用檢測試劑盒進行測定。畢赤酵母菌的外源性 DNA 殘留量測定，采用自制提取的畢赤酵母菌總 DNA，利用Dig-DNA 標記試劑盒制備畢赤酵母菌的總 DNA探針。rHSA/IFNα 原液中殘留的外源性 DNA 經(jīng)變性為單鏈 DNA 吸附于固相膜上，在一定溫度下與相匹配的單鏈 DNA 探針標記復性而雜交結合為雙鏈 DNA，并使用相應的顯示系統(tǒng)顯示雜交結果，與已知含量的陽性 DNA 對照比對后，給出待測原料藥（原液）中的外源性 DNA 殘留量數(shù)值。

1.2.11 rHSA/IFNα 化學特性

1.2.11.1 N 端氨基酸序列分析 rHSA/IFNα 的N 端前 15 個氨基酸序列測定由北京大學生命科學學院按 Edman 降解法進行測定。適量 rHSA/IFNα 原液樣品處理后對純水充分透析，轉移至經(jīng)預處理的 PVDF 膜上，干燥后直接在蛋白質 N 端氨基酸測序儀按標準測定方法測定。

1.2.11.2 等電點分析 rHSA/IFNα 的等電點測定采用常規(guī)的等電聚焦垂直板電泳法測定。根據(jù)標準品的等電點（pI）對其相應的遷移率距離作直線回歸，將 rHSA/IFNα 的遷移距離代入直線回歸方程，求出待測樣品的等電點。

1.2.11.3 糖基化分析 rHSA/IFNα 原液和糖蛋白陽性對照品，辣根過氧化物酶糖蛋白和重組人促紅細胞生成素（rhEPO）、糖蛋白陰性對照大豆胰蛋白酶抑制因子一起進行 SDS-PAGE 分離，按糖蛋白染色試劑盒說明書操作，進行糖蛋白染色的電泳膠在掃描儀上掃描，再用考馬斯亮藍 R250 復染，掃描成像。

1.2.11.4 紫外光譜測定 rHSA/IFNα 的紫外光譜測定以 10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 6.5）為空白對照液，在常規(guī)紫外可見分光光度計上對rHSA/IFNα 原液稀釋樣品（用空白對照液稀釋至0.1 mg/ml）進行 450 ～ 260 nm 波長的連續(xù)掃描，測定其最大吸收波長位置。

1.2.11.5 自由巰基測定 自由巰基測定采用質譜分子量測定方法，由北京蛋白質組研究中心進行測定。將經(jīng)烷基化處理封閉自由巰基和未經(jīng)處理的同一來源 rHSA/IFNα 原液按 1.2.7.2 描述的質譜分子量測定方法進行比較，每一個烷基的分子量為59 D。

1.2.11.6 肽譜（RP-HPLC 法和肽質量指紋質譜法）

①胰蛋白酶裂解-反相高效液相色譜法：取rHSA/IFNα 原液稀釋至 1 mg/ml，用 1% 碳酸氫銨溶液充分透析，以終濃度 0.01 mol/L 二硫蘇糖醇（DTT）在 56 ℃ 下還原 60 min，以終濃度0.055 mol/L 碘乙酰胺室溫避光烷基化 30 min，按1∶50（mg/mg）加入胰蛋白酶溶液［取甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮處理過的（或序列分析純）胰蛋白酶適量，加 1% 碳酸氫銨溶液溶解，制成 0.1 mg/ml的溶液］到供試品溶液中，在 37 ℃ 保溫酶切 24 h后，按 1∶10 加入 50% 醋酸溶液，以 10 000 ×g離心 5 min（或通過 0.45 μm 膜過濾），精密量取上清液 100 μl，注入高效液相色譜儀，流動相及洗脫程序為：A 液為 0.1% 三氟乙酸-水溶液，B 液為0.1% 三氟乙酸-乙腈溶液。以流速為 1 ml/min，梯度洗脫 70 min（A 液從 100% ～ 30%，B 液從 0 ～70%），檢測波長為 214 nm，記錄色譜圖。

②激光質譜肽質量指紋圖譜的測定：使用基質輔助激光解吸附電離飛行時間串聯(lián)質譜儀進行檢測，由北京蛋白質組研究中心承擔。取待測樣品10 μl（10 μg），加入 10 μl 100 mmol/L NH4HCO3溶液，加入 100 mmol/L DTT 至終濃度 10 mmol/L，56 ℃ 反應 1 h。冷卻至室溫后，加入250 mmol/L 3-吲哚乙酸（IAA）至終濃度 25 mmol/L，避光反應 1 h。加入 0.5 μg Trypsin，37 ℃ 反應 12 h。將上述酶切產(chǎn)物與基質按 1∶3 混合點于靶上，自然晾干后，反射正離子模式（m/z 500 ～ 5 000）和線性正離子模式（m/z 3 000 ～ 20 000）下測定肽質量指紋譜（PMF），以已知 rHSA/IFNα2a或 rHSA/IFNα2b 氨基酸序列肽段理論分子量進行比對。

2 結果

2.1 rHSA/IFNα 工程菌的構建和表達產(chǎn)物

圖 1 重組人血清白蛋白/干擾素 α 融合蛋白成熟肽氨基酸序列Figure 1 The amino acid sequences of mature peptide of recombinant human serum albumin/interferon-α fusion protein(rHSA/IFNα2a)

利用基因工程技術構建的畢赤酵母工程菌種表達重組人血清白蛋白/干擾素 α2a 融合蛋白（rHSA/IFNα2a）成熟肽的理論氨基酸序列為圖 1。由畢赤酵母菌工程菌表達的 rHSA/IFNα2b 與rHSA/IFNα2a 的成熟肽氨基酸序列僅在第 23 位不同。分泌到發(fā)酵液中的融合蛋白是可溶性的蛋白質，具有 750 個氨基酸。rHSA/IFNα2a 的理論計算分子量為 85694.50 D，等電點為 pI 5.845；rHSA/IFNα2b 的理論計算分子量為 85722.52 D，等電點為 pI 5.845。共有 19 個二硫鍵，分別為53-62，75-91，90-101，124-169，168-177，200-246，245-253，265-279，278-289，316-361，360-369，392-438，437-448，461-477，476-487，514-559，558-567，586-683（1hIFNα98），614-723（29hIFNα128）。HSA 的第 34 個半胱氨酸（C）有一個游離的自由巰基。研究結果表明，在正確構象下 HSA 或rHSA/IFNα 的該 34 C 不會與的另一個 HSA 分子或另一個 rHSA/IFNα 分子之間的自由巰基形成共價二硫鍵，這是因為第 34 位的半胱氨酸被包裹在 HSA 分子內(nèi)部，兩個 HSA 分子之間不會形成共價二硫鍵形式的二聚體，僅可形成電荷相吸形式的聚合體。研究表明在 rHSA/IFNα 中的干擾素 α的兩個共價二硫鍵形成正常，沒有在形成融合蛋白時受到 HSA 大分子的影響，表明 rHSA/IFNα 的蛋白分子結構穩(wěn)定。

2.2 rHSA/IFNα 的大規(guī)模發(fā)酵工藝的建立

對表達 rHSA/IFNα 的 2 個工程菌進行主種子庫和工作種子庫的建立和檢定使之符合國家對生物制品生產(chǎn)用菌種的要求。隨機選取 50 個工程菌菌落，進行目的基因 PCR 檢測，為 100% 陽性。酵母重組工程菌經(jīng)連續(xù) 30 個代次的傳代，目的蛋白表達水平穩(wěn)定與原始菌種相同。采用 5、30 和200 L 不同規(guī)模的發(fā)酵系統(tǒng)進行工程菌的發(fā)酵測試和優(yōu)化，確定了 rHSA/IFNα 畢赤酵母工程菌在200 L 規(guī)模的發(fā)酵工藝。融合蛋白分泌到酵母細胞外的培養(yǎng)液中，取發(fā)酵上清液 10 ～ 30 μl 進行還原和非還原的 SDS-PAGE 分析結果顯示，發(fā)酵上清液中總蛋白（不低于 1 g）的 40% 以上是 rHSA/IFNα 單體融合蛋白目的產(chǎn)物（圖 2A，B）?？梢源_定畢赤酵母工程菌株的 rHSA/IFNα 表達水平均不低于 300 mg/L。兩者的表達水平?jīng)]有顯著差異。發(fā)酵工藝穩(wěn)定，且可線性放大、無機鹽培養(yǎng)基配方組分簡單、成本低廉可滿足今后產(chǎn)業(yè)化的要求。

2.3 rHSA/IFNα 蛋白質的分離純化

發(fā)酵結束后，進行 pH 和電導率值調整，上清液經(jīng) 0.22 μm 柱狀濾芯過濾處理后，經(jīng)介質填料的連續(xù)分離和純化。精純獲得 rHSA/IFNα 溶液，按改進型 Lowry 法測定，蛋白質含量在 5 mg/ml 左右，細菌內(nèi)毒素含量在 1 EU/ml 以下。制備的rHSA/IFNα 溶液符合生物制品的要求，可以作為《注射用重組人血清白蛋白/干擾素 α2a 融合蛋白》或《注射用重組人血清白蛋白/干擾素 α2b 融合蛋白》的原料藥（原液）。

圖 2 在 200 L 發(fā)酵罐中畢赤酵母工程菌經(jīng)甲醇誘導表達重組人血清白蛋白/干擾素 α 融合蛋白，rHSA/IFNα2a（A）和 rHSA/IFNα2b（B）Figure 2 Expression of rHSA/IFNα by Pichia pastoris from a 200 L bioreactor (fermenter)

2.4 rHSA/IFNα 免疫鑒別

rHSA/IFNα 是由白蛋白和干擾素 α 蛋白質兩個分子融合組成的。免疫印跡試驗結果顯示，特異識別人血清白蛋白的單克隆抗體與 rHSA/IFNα 有特異的免疫學反應，也與作為陽性對照品的血源人血清白蛋白（pHSA）和酵母菌表達的重組 HSA（rHSA）有免疫反應，但不與陰性對照品人干擾素（rhIFNα）有免疫反應；特異識別人干擾素的單克隆抗體則與 rHSA/IFNα 和陽性對照品重組人干擾素（rhIFNα）有免疫特異反應，但不與陰性對照品pHSA 和 rHSA 有特異反應（圖 3A、B）。免疫斑點法可以獲得相同的鑒別結果。

2.5 rHSA/IFNα 的體外細胞學生物活性測定

rHSA/IFNα 原液的體外細胞學生物活性測定結果表明，作為融合蛋白的 rHSA/IFNα 的生物比活性為 2.5 × 105IU/mg，而 rhIFNα 的生物比活性為 1 × 108IU/mg。rHSA/IFNα 和 rhIFNα 的分子質量比為 4.5∶1。由此計算，在等摩爾分子時，4.5 mg 融合蛋白中有 1 mg 是 IFNα，但是 rHSA/IFNα 實測得到的體外生物活性僅有 rhIFNα 的1/400。rHSA/IFNα2a 和rHSA/ IFNα2b 兩者之間的體外細胞生物活性測定值沒有顯著的統(tǒng)計學意義上的差異。

圖 3 融合蛋白 rHSA/IFNα 的免疫印跡鑒別試驗Figure 3 The western-blotting results come from by different first antibodies

2.6 rHSA/IFNα 蛋白質的物理特性分析

2.6.1 rHSA/IFNα 蛋白質純度分析 取 10 μg的 rHSA/IFNα 蛋白質在非變性條件下做 SDSPAGE，結果顯示分離純化的 rHSA/IFNα 電泳純度達 99%；凝膠分子排阻-高效液相（SEC-HPLC）在波長 280 和 214 nm 記錄結果顯示均為單一峰，峰面積不低于總面積的 99%。rHSA/IFNα 經(jīng)SEC-HPLC 測定獲得相同結果。因此，在原液中可能存在的單體 IFNα 分子、單體 HSA 分子和聚合體形式的 rHSA/IFNα 的總值不會高于 10 μg/mg。

2.6.2 分子量測定 在還原條件下以已知蛋白質分子量為參照物，進行直線回歸方程計算，分子量的測定結果為（85.7 ± 8.6）KD。對 rHSA/IFNα2a理化對照品和 rHSA/IFNα2b 用基質輔助激光解吸飛行時間質譜儀進行測定的分子量為 85640.8 D和 85781.5 D，分別與理論分子量 85694.5 D 和85722.5 D 值相近。

2.6.3 圓二色光譜分析 應用圓二色光譜儀分別對 rHSA/IFNα2a、rIFNα2a 和 rHSA 蛋白質溶液或rHSA/IFNα2b、rIFNα2b 和 rHSA 開展遠紫外光譜分析測定，對所獲得的光譜曲線分別進行了疊加分析比較。在圖 4A 中顯示了 rHSA + rIFNα2a（藍）、rHSA/IFNα2a（紅）、rHSA（綠）和 rhIFNα2a（黑）分子間圓二色光譜疊加結果。rHSA/IFNα2b 的測試結果獲得相似的圖形；圖 4B 中顯示 rHSA/IFNα2a（藍）和 rHSA/IFNα2b（粉）的疊加。結果表明重組人血清白蛋白/干擾素 α 融合蛋白和重組人血清白蛋白、重組人干擾素 α 理論加和的圓二色圖形相似度非常高，表明在融合蛋白中的人血清白蛋白和人干擾素 α 的各自空間結構沒有發(fā)生變化。結果與參考文獻[13]相似。這些結果預示融合蛋白中的 HSA 和干擾素分子的空間構象沒有變化。

圖 4 對 rHSA/IFNα 蛋白質紫外圓二色疊加圖譜分析Figure 4 Protein UV-Circular dichroism spectra (CD)analysis of rHSA/IFNα

2.6.4 甲醇和甘油殘留量測定 無論采用變色酸比色法或是氣相色譜法，在 rHSA/IFNα 原液中甲醇殘留量都在 0.0001%（g/g）以下，遠低于《中國藥典》2005 版二部中對作為原料藥殘留溶劑-甲醇的限度要求值（0.3%）。甘油的殘留量采用氣相色譜法測定，其殘留量低于儀器和方法檢出的下限值，可以判定為未檢出。

2.6.5 宿主蛋白質和外源性 DNA 殘留量 采用試劑盒檢測了 rHSA/IFNα 原液中的畢赤酵母菌宿主蛋白的殘留量，結果表明 2 個新藥原液中的酵母菌蛋白質含量均在 0.05% 以下，測定的回收率值在 70% ～ 130% 之間，符合國家對注射用重組蛋白質藥物中宿主蛋白質殘留量限定的要求。rHSA/IFNα 原液中的畢赤酵母菌外源性 DNA 殘留量經(jīng)測定，每毫克融合蛋白或臨床每人次劑量小于 10 ng 的標準。

2.7 rHSA/IFNα 的化學特性

2.7.1 N 端氨基酸序列測定 2 個 rHSA/IFNα的 N 端序列前 15 個氨基酸的測定結果均為：Asp-Ala-His-Lys-Ser-Glu-Val-Ala-His-Arg-Phe-Lys-Asp-Leu-Gly-，與 rHSA/IFNα 理論序列相符。對不同批次的 rHSA/IFNα 原液分別進行 N 端氨基酸序列測定獲得相同的結果。

2.7.2 等電點 對 rHSA/IFNα2a 和 rHSA/IFNα2b進行的等電聚焦和等電點測定結果為一個條帶，等電點 pI 測定值為 5.1 左右，這與理論值（pI 5.845）相近。圖 5 為連續(xù) 3 批次的 rHSA/IFNα2a 和rHSA/IFNα2b 原液等電點檢定結果。

圖 5 兩個融合蛋白 rHSA/IFNα 的等電點測定Figure 5 Isoelectric focusing (IEF) of rHSA/IFNα fusion proteins

2.7.3 糖基化 利用高碘酸溶液處理含有蛋白的凝膠或者膜，該溶液會氧化糖蛋白上含有的順式二元醇糖基團形成醛基基團，從而可以與特定試劑形成希夫堿鍵并產(chǎn)生品紅色的條帶而得到檢測，稱為高碘酸希夫堿（PAS）試劑法。對 5 μg 的 rHSA/IFNα 經(jīng)過 SDS-PAGE 分離后使用試劑盒進行染色，比較隨后的用考馬斯亮藍 R250 復染色電泳膠（圖 6A、B），顯示由畢赤酵母菌表達制備的 2 個rHSA/IFNα 融合蛋白均為非糖基化或低糖基化蛋白質。

圖 6 畢赤酵母菌表達的兩個 rHSA/IFNα 融合蛋白的糖基化程度分析Figure 6 Glycoprotein Staining and Coomassie Brilliant blue re-staining of two rHSA/IFNα .proteins on SDS-PAGE

2.7.4 紫外光譜測定 rHSA/IFNα 原液中的蛋白質呈典型蛋白質紫外吸收峰，最大吸收峰波長在278 nm 左右。

2.7.5 自由巰基測定 rHSA/IFNα2a 樣品烷基化在封閉和不封閉條件下測試的質譜分子量分別為85788.4 D 和 85706.1 D，兩者之差為 82.3 D，計算 82.3 D/57 D = 1.4，表明 rHSA/IFNα 中含有約1.4 個自由巰基。理論氨基酸序列中 rHSA/IFNα含有 1 個自由巰基（半胱氨酸 C）位于第 34 位。因此測定值與理論值一致。在對 rHSA/IFNα2b 開展的自由巰基測定工作獲得了相同的結果。

2.7.6 肽圖分析 rHSA/IFNα2a（粉色）和 rHSA/IFNα2b（黑色）經(jīng)變性和烷基化后，胰蛋白酶水解獲得的各自的 RP-HPLC 肽圖，并在疊加后顯示出絕大部分的肽圖圖形相似，明顯不同的兩個峰值則以箭頭標示（圖 7A），可以作為 rHSA/IFNα原液的質量鑒別指標之一。在 rHSA/IFNα2a 肽圖（圖 7B）中第 17 分鐘左右有 1 個峰形是 rHSA/IFNα2b 中對應位置沒有的峰；在 rHSA/IFNα2b 的第 24 分鐘出現(xiàn)的 1 個峰則是 rHSA/IFNα2a 樣品中沒有的峰（圖 7C）。這兩個差異可以確定作為2 個融合蛋白 rHSA/IFNα2a 和 rHSA/IFNα2b 之間的鑒別指標。rHSA/IFNα2a 和 rHSA/IFNα2b 各自的批次間重現(xiàn)率較好（圖 7D 和圖 7E）。

根據(jù)已知 rHSA/IFNα2a 和 rHSA/IFNα2b 的全長氨基酸序列計算出各自的理論肽譜，將實測肽質量指紋圖譜與理論圖譜進行比對，檢出氨基酸序列的覆蓋率分別為 83% 和 82%。以 rHSA/IFNα2a為例，該融合蛋白 N 端氨基酸序列完全匹配到41 個氨基酸殘基；C 端匹配到 42 個殘基。HSA的 C 端匹配出 112 個殘基和干擾素 α2a 的 N 端匹配出 83 個殘基。rHSA/IFNα2b 的 N 端氨基酸序列完全匹配出 50 個殘基，C 端匹配出 52 個殘基。在融合蛋白的融合位點人血清白蛋白的 C 端匹配出 11 個殘基，干擾素 α2b 的 N 端則匹配出50 個殘基。2 個融合蛋白直接相連的氨基酸序列部位都能清楚檢出。2 個融合蛋白的 C 端最后1 個氨基酸 E 都沒有匹配，是由于在其之前的氨基酸是賴氨酸（K）。賴氨酸是胰蛋白酶的酶切特異識別位點。2 個 rHSA/IFNα 融合蛋白的肽序列中氨基酸第 608 位（干擾素 α 的第 23 位）的肽序列，也能清楚地匹配，也可以作為融合蛋白 rHSA/IFNα2a 和 rHSA/IFNα2b 區(qū)別的特異性指標。

3 討論

為表達兩種融合蛋白 rHSA/IFNα2a 和 rHSA/IFNα2b，我們分別構建了 2 個畢赤酵母工程表達菌株。經(jīng)測試工程菌的基因重組可穩(wěn)定傳代。發(fā)酵工藝各經(jīng)十余罐次不同規(guī)模的發(fā)酵制備，顯示發(fā)酵工藝的穩(wěn)定和可重復性。發(fā)酵培養(yǎng)基組分簡單，適合用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)重組人血清白蛋白/干擾素融合蛋白。畢赤酵母工程菌表達的融合蛋白不僅與 HSA 的特異單克隆抗體有陽性反應，也與干擾素 α 的特異單克隆抗體有特異免疫學反應。體外細胞生物學活性測定，展示出人干擾素 α 特有的抑制 VSV 病毒侵染 WISH 細胞的生物活性功能。研究觀察到兩個融合蛋白之間，在體外生物活性測定值上沒有任何統(tǒng)計學意義上的差異。干擾素α 融合蛋白的生物活性與單體干擾素 α 之間相比在數(shù)據(jù)上為 1/400，考慮到分子量差異 4.5 倍，實際上融合蛋白中的干擾素 α 的生物活性下降了100 倍。rHSA/IFNα 的體外生物活性大大降低可能是由于融合蛋白中的 IFNα 分子與干擾素受體結合區(qū)域，受到融合蛋白的遮蔽。在干擾素的 N 端第 1 個氨基酸是半胱氨酸 C，其與干擾素的第 98位的半胱氨酸 C 需要形成 1 個二硫鍵來構成干擾素 α 的關鍵空間結構。干擾素 α 與 HSA 融合并沒有影響到這個關鍵二硫鍵的形成，干擾素的空間結構也沒有發(fā)生變化，但干擾素與受體結合的能力大大降低，這導致了干擾素融合蛋白體外生物活性下降。我們已完成的動物試驗和文獻報道的帶有連接肽[14]和不帶有連接肽[13]的人血清白蛋白與干擾素 α2b 形成的融合蛋白，在動物體內(nèi)和臨床上患者體內(nèi)抗病毒的能力并沒有下降，顯示融合蛋白中的干擾素在人和動物體內(nèi)并沒有受到 HSA 大分子的空間構型的干擾和影響。

圖 7 rHSA/IFNα2a 和 rHSA/IFNα2b 的還原型-烷基化胰蛋白酶酶解 RP-HPLC肽圖圖譜分析[A：rHSA/IFNα2a（粉色）和rHSA/IFNα2b（黑色）的肽圖疊加；B：rHSA/IFNα2a（粉色）在第 17.5 min 的一個特有區(qū)別峰；C：rHSA/IFNα2b 在第 24.8 min 時的一個特有區(qū)別峰；D：rHSA/IFNα2a 兩個批次 9213Y20090501（黑色）和 9213Y20081003（粉色）間的比較；E：rHSA/IFNα2b 兩個批次9216Y20100502（黑色）和9216Y20100503（粉色）間的比較]Figure 7 The RP-HPLC peptide mapping of fusion proteins rHSA/IFNα2a and rHSA/IFNα2b compares under reducing condition and enzymatic digestion.[A: Mapping pile up of rHSA/IFNα2a (pink) and rHSA/IFNα2b (black); B: Identify peak at 17.5 min for rHSA/IFNα2a (pink); C: Identify peak at 24.8 min for rHSA/IFNα2b (black); D: Mapping from different Batches of rHSA/IFNα2a,9213Y20090501(black) and 9213Y20081003 (pink); E: Mapping from different Batches of rHSA/IFNα2b, 9216Y20100502(black)and 9216Y20100503]

從不同時間的大規(guī)模發(fā)酵誘導表達融合蛋白的結果可以看出，隨著誘導時間的延長，酵母菌分泌的目的蛋白在發(fā)酵液中獲得積累，增加上清液中融合蛋白的含量。同時，觀察表明目的蛋白表達產(chǎn)物（rHSA/干擾素 α）也還是有被降解的現(xiàn)象存在。融合蛋白的降解物存在，會對下游目的蛋白的分離純化有直接影響。因為目的蛋白降解物是和目的蛋白具有相同的肽段，親和層析介質和疏水介質（HIC）在特異結合目的蛋白上的特定肽段時，會受到競爭性結合影響。為此，雖然延長生產(chǎn)時間，融合蛋白單位產(chǎn)量會有十分顯著地增加，但是可能會為下游的純化帶來困難，因此可以限定誘導 72 h左右時，結束發(fā)酵進入分離純化程序。通過 2 個融合蛋白的分離純化工藝優(yōu)化，并經(jīng)多批次的驗證，發(fā)酵和純化工藝穩(wěn)定可靠，且可線性放大。融合蛋白 rHSA/IFNα2a 和 rHSA/IFNα2b 原液符合臨床用藥對原料藥純度的要求。

對兩個融合蛋白的理化特性分析表明，經(jīng)分離純化的融合蛋白在物理特性分析中顯示，在SDS-PAGE 電泳、凝膠分子排阻-高效液相（SECHPLC）測定中均呈單一峰；對原液中的甲醇、甘油、畢赤酵母菌宿主蛋白質和外源性 DNA 殘留量的測定方法的建立和檢定結果表明兩個 rHSA/IFNα 原液的蛋白質純度分析結果可靠。對 rHSA/IFNα 的化學特性分析結果表明紫外吸收測定顯示具有蛋白質特定的紫外吸收峰值；等電點和分子量測定結果也符合理論計算值；遠紫外區(qū)圓二色 CD光譜主要反映蛋白質肽鍵的圓二色性，辨識蛋白質的二級和三級結構。而圓二色光譜分析證明融合蛋白中的 HSA 和干擾素 α 各自的空間結構沒有因為形成融合蛋白而發(fā)生錯配，它們維持了各自的二硫鍵正確配對；應用RP-HPLC 技術建立的肽圖分析方法簡單，可以作為與理化對照品或批次間原液生產(chǎn)制備的鑒別手段之一，還可以作為兩個融合蛋白的鑒別方法。肽質量指紋質譜分析結果，顯示83% 的 rHSA/IFNα2a 和 82% 的 rHSA/IFNα2b氨基酸肽段可以被檢出，包括融合蛋白的 N 端、C 端、HSA 和 IFNα 連接部位的氨基酸序列。同時，決定是干擾素 α2a 或 2b 藥物分子的單一氨基酸差異也可以清楚地鑒別。肽質量指紋圖譜簡單、可重復，是區(qū)別兩者的最好和可靠的方法。雖然融合蛋白的 C 端的氨基酸 E 未能匹配，但是rHSA/IFNα2a 質譜分子量測定結果 85640.8 D 與理論分子量 85694.5 D 之間的差異為 53.7 D，其遠遠小于谷氨酸的理論分子量 147.1 D。同理，對rHSA/IFNα2b 測定的結果相似，也可以獲得解釋。N 端蛋白質序列測定也再次證明由酵母菌分泌出的融合蛋白，切割加工過程正確，獲得的融合蛋白是單一肽序列結構，蛋白質分子完整。

對比文獻[11-12]使用釀酒酵母表達的 rHSA/IFNα2b 和 rHSA/GCSF 融合蛋白，我們使用畢赤酵母來表達 rHSA/IFNα2b 要有較明顯的優(yōu)勢，首先是表達量要高 10 ～ 100 倍，其次融合蛋白被酵母糖基化水平也要低得多。使用畢赤酵母菌進行rHSA/IFNα 的生產(chǎn)和制備，在純化的原料藥中含有多少熱源（由后處理過程中污染而來的）、宿主蛋白質、外源性 DNA、甲醇和甘油殘留量（雜質）是需要確定的，以保證在臨床用藥時，不會由于這些殘存的宿主物質而帶來臨床上的異源蛋白刺激反應。

rHSA/IFNα 的發(fā)酵生產(chǎn)制備過程中使用的培養(yǎng)基中含有甘油，作為碳源。理論上，甘油在酵母菌生長和擴增過程被完全消耗后，才轉為使用甲醇作為碳源和重組融合蛋白的表達誘導劑。為了用藥完全，有必要對 rHSA/IFNα 原液樣品中的甘油和甲醇殘留量進行檢測。

通過研究，我們對兩個融合蛋白的理化特性所開展的獨立研究，獲得了十分有益的數(shù)據(jù)和試驗結果，也獲得了區(qū)別這兩個融合蛋白的技術方法和指標。本研究的檢定方法和指標可以作為指導具長效性的《注射用重組人血清白蛋白/干擾素 α2a 融合蛋白》和《注射用重組人血清白蛋白/干擾素 α2b 融合蛋白》原料藥制造和檢定質量標準規(guī)程建立的依據(jù)。

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Expression and the physical and chemical characterizations studies of two recombinant human serum albumin/interferon-α (2a; 2b) fusion proteins with long-acting bio-function

FU Yan, HAN Guo, YANG Xiao-nan, FU Yu-song, XING Jing, HU Jun-xin, CHEN Ying, Yun Wen-qi, YU Zai-lin

ObjectiveTo analyze and compare the physical and chemical characterizations of recombinant human serum albumin/interferon alpha-2a fusion protein and recombinant human serum albumin/interferon alpha-2b fusion protein drugs.

MethodsThe genetically engineered yeastPichia pastorisstrains used in the expression of rHSA/IFNα2a or rHSA/IFNα2b fusion proteins were constructed separately.The fusion protein was directly secreted by yeast into a simple non-organic culture medium,then purified by three-step highly-efficient chromatography.The physical and chemical characterizations of the highly purified drug-level fusion proteins were investigated in detail.

ResultsCharacterization analysis results from the two fusion proteins were obtained including protein purity, which is more than 98%.The first 15 amino acids of the N-terminal sequence of the fusion protein match that of the predicted sequence, with the molecular mass of Maldi-TOF/TOF spectrum being 85788.4D and 85706.1D for rHSA/IFNα2a and rHSA/IFNα2b, respectively.UV-circular dichroism (CD) spectra is not different compared with HSA or interferon-α, and fusion protein’s IEF (pI) is around 5.1.The fusion proteins are non-glycoprotein with staining, and UV-wavelength specification shows typical protein spectroscopy.Measurement of free-sulfhydryl (SH) group matchs the predicted value; and mass spectrometric peptide mapping shows 83% or 82%identity to the predicted peptide fragments, respectively.The residues in the bulk preparations are also investigated and meet the standard requirement, including the endotoxin, host protein, exogenous DNA, methanol and glycerol.The immune-identification is positive and the anti-virus bio-assayin vitrois 2.5 × 105IU/mg, with no difference seen between two fusion proteins.

ConclusionsThe methods used and results obtained from this study may be used as qualification standards in making the clinically available final products of long acting interferon-α protein drugs, “Recombinant human serum albumin/interferona2a fusion protein for injection” and “recombinant human serum albumin/interferona2b fusion protein for injection”.

Interferon-αlpha; Long-acting interferon; Serum albumin;Pichia; Recombinant fusion proteins

YU Zai-lin, Email: zyu88@yahoo.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.02.002

北京市海淀區(qū)科學技術委員會項目支持資金（K20100133Z）；天津市科學技術委員會項目支持資金（07ZCKFSH02400）；國家 863 計劃重大科技攻關（2007AA021604）；國家“重大新藥創(chuàng)制”專項（2009ZX09301-008N20）

100085 北京美福源生物醫(yī)藥科技有限公司（富巖、韓國、邢靜、于在林）；300457 天津林達生物科技有限公司（富巖、楊小楠、陳穎、胡俊霞、于在林）；300457 天津溥瀛生物技術有限公司（富俞淞、云文琦、于在林）

于在林，Email：zyu88@yahoo.com

2011-03-07

Author Affiliations: Beijing Bio-Fortune Ltd, Beijing 100085, China (FU Yan, HAN Guo, XING Jing, YU Zai-lin); Tianjin Sino-Biotech Ltd, Tianjin 300457, China (FU Yan, YANG Xiao-Nan, CHEN Ying, HU Jun-xia, YU Zai-lin); Sino-Biotech (Tianjin)Ltd, Tianjin 300457, China (FU Yu-Song, YUN Wen-qi, YU Zai-lin)

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