司書毅，姜威，白碩可

微生物藥物研究進(jìn)展與發(fā)展趨勢

司書毅，姜威，白碩可

微生物藥物作為廣泛使用的臨床藥物具有重要的地位，尤其是在抗感染、抗腫瘤、降血脂和抗器官移植排異方面具有不可替代的作用。自 1929年青霉素被發(fā)現(xiàn)后，20 世紀(jì) 40年代以來，已有上百種抗生素先后用于臨床的細(xì)菌感染治療、腫瘤化療、降血脂以及器官移植抗排異反應(yīng)?？傮w上，由于微生物藥物特別是抗生素的廣泛應(yīng)用使人類的壽命延長了 15年。廣義的微生物藥物即由微生物發(fā)酵獲得的藥物現(xiàn)約占全球醫(yī)藥生產(chǎn)產(chǎn)值的 50%。

1 功能基因組學(xué)研究為創(chuàng)新微生物藥物提供更多的藥物靶標(biāo)

隨著人類基因組學(xué)和微生物基因組學(xué)研究的深入，近期將有 5000 個(gè)功能基因或蛋白被認(rèn)為是潛在的藥物靶標(biāo)，是 20 世紀(jì)末已經(jīng)確定的藥物靶點(diǎn)的 10 倍以上[1]，這為微生物新藥的篩選與發(fā)現(xiàn)奠定了更廣闊的基礎(chǔ)。微生物藥物的藥物靶標(biāo)與病原微生物的基因組學(xué)及功能基因組學(xué)研究的進(jìn)展相關(guān)。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，截止 2009年，世界范圍內(nèi)已有 2500 種以上的病毒，582 種細(xì)菌，100 多種真菌的基因組完成測序。以中國深圳華大基因研究院為核心的“協(xié)作組”于 2009年8月已經(jīng)正式啟動(dòng)為期三年的“萬種微生物基因組計(jì)劃”，最近幾年將有更多的微生物基因組學(xué)及功能基因組學(xué)數(shù)據(jù)面世。與此同時(shí)，蛋白基因組學(xué)研究正在興起，2002 – 2005年我國科學(xué)家領(lǐng)銜的“人類肝臟蛋白組學(xué)計(jì)劃”，鑒定和發(fā)現(xiàn)了一大批有重要功能的蛋白質(zhì)，構(gòu)建了大規(guī)模的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫；系統(tǒng)測定了一部分人類重大疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；全面系統(tǒng)地解析出 108 個(gè)獨(dú)立蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了一批潛在的藥物作用靶標(biāo)；制備了國際上最大規(guī)模的蛋白質(zhì)單克隆抗體庫。日本理化研究所在 2002 –2006年實(shí)施了蛋白質(zhì) 3000 項(xiàng)目，在 5年內(nèi)，主要利用 X-射線衍射分析和 3D-NMR 分析方法解析了以各種模式微生物為主要來源的近 3000 個(gè)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，為解析這些蛋白質(zhì)的主要功能奠定了基礎(chǔ)。

作為病原微生物來講，功能基因組研究成果為微生物必需基因和致病基因的確定提供了前提。對于一般的病毒來講，其整個(gè)基因組可以編碼 10 個(gè)左右的蛋白基因，其中有 4 ~ 6 個(gè)功能蛋白可作為藥物靶標(biāo)，如再加上特定病毒的細(xì)胞輔助蛋白，可有 10 個(gè)以上的藥物靶標(biāo)。對于細(xì)菌來講，其基因組要遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于病毒，一般其基因組大多在 2 ~ 6 Mb之間，其編碼的蛋白基因在數(shù)千個(gè)（如已知結(jié)核桿菌 H37Rv 基因組包含 3924 個(gè)編碼蛋白基因），其微生物特有的必需基因可能數(shù)以百計(jì)。這些必需基因如果和真核相應(yīng)的基因同源性小，可以被認(rèn)為是抗微生物藥物的潛在藥物靶標(biāo)[2]。真菌的基因組在2.5 ~ 81.5 Mb，作為真核生物，其許多蛋白是保守的，在生物的進(jìn)化中被保留下來；另一些蛋白在進(jìn)化中被放棄了，并代之以新的蛋白基因。通過與人類功能基因的比較，找出真菌必需的和與人類有差異的基因與蛋白，對醫(yī)療上重要真菌基因組的分析有可能鎖定抗真菌藥物靶標(biāo)。幾個(gè)致病性真菌的基因組已經(jīng)被完全測序，因此與人類不存在同源性且為真菌生長所必須的基因的預(yù)測成為可能，并且成為研究毒副作用低的殺真菌藥物的靶標(biāo)。如在白色假絲酵母的基因組序列中發(fā)現(xiàn)了 228 個(gè)基因，這些基因都存在于其他 5 個(gè)被測序的真菌基因組中，但在人或鼠的基因組中缺乏同源性。這些基因是利用小分子物質(zhì)抑制白色假絲酵母的潛在靶標(biāo)來尋找抗真菌藥物的藥物靶點(diǎn)[3]。

2 高通量藥物篩選在微生物藥物早期發(fā)現(xiàn)的應(yīng)用，加速了苗頭化合物的獲得

從土壤微生物中篩選抗生素，是現(xiàn)代規(guī)?；幬锖Y選的開端。隨著高通量篩選技術(shù)的發(fā)展，利用微生物發(fā)酵產(chǎn)物粗提品的藥物篩選，由于重復(fù)性較差，活性成分純化的難度大，限制了創(chuàng)新微生物藥物篩選的速度和成功率，也使大的制藥公司更傾向于利用組合化學(xué)制備的大規(guī)?；衔飵斓母咄克幬锖Y選。雖然篩選效率大大提高，但得勢不得利，其獲得新的化學(xué)實(shí)體的數(shù)量并沒有顯著提高，而且隨著新藥標(biāo)準(zhǔn)的提高，新的化學(xué)實(shí)體反而成下降趨勢。因此，天然產(chǎn)物作為創(chuàng)新藥物的篩選資源再次受到重視。而微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物相對于動(dòng)植物次級(jí)代謝產(chǎn)物來講，具有更易開發(fā)利用、不破壞生態(tài)環(huán)境、可通過發(fā)酵大量獲得和易于采用生物技術(shù)等優(yōu)點(diǎn)。我國科技部自“九五”期間開始資助支持國內(nèi)籌建國家新藥（微生物）新藥篩選實(shí)驗(yàn)室，“十五”、“十一五”期間又以篩選平臺(tái)的形式資助支持微生物藥物高效篩選。十年來，我國微生物藥物的篩選技術(shù)有了長足的進(jìn)步。在藥物篩選微生物資源方面已經(jīng)建立了近 15 萬株的篩選用菌株庫和20 萬個(gè)微生物發(fā)酵液提取品庫。高通量微生物藥物篩選模型已達(dá)到 150 種，年篩選量已由“十五”期間的 20 萬樣次，發(fā)展到“十一五”期間的 100 萬樣次。通過大量的規(guī)?；暮Y選，已經(jīng)獲得一批藥物先導(dǎo)化合物和藥物候選物，有些已經(jīng)進(jìn)入臨床前研究階段。就微生物藥物的篩選規(guī)模和水平來講，我國的創(chuàng)新微生物藥物篩選已達(dá)到國際先進(jìn)水平。

3 模式生物學(xué)方法是高效獲得創(chuàng)新微生物藥物先導(dǎo)化合物的有效方法

經(jīng)典的抗生素篩選是模式微生物學(xué)篩選方法，最早并且使用比較多的是馴化敏感菌的方法。隨著技術(shù)的發(fā)展，利用克隆分子靶標(biāo)建立生化檢測的高通量篩選方法已經(jīng)取得優(yōu)勢。但此方法往往會(huì)忽略了在細(xì)胞水平的作用，利用分子水平獲得的苗頭化合物在發(fā)展為先導(dǎo)化合物和候選藥物時(shí)具有更多的淘汰率。因此，重新審視模式微生物的方法，將分子靶與細(xì)胞相結(jié)合的方法將大大提高苗頭化合物的命中率。細(xì)胞生物學(xué)的研究正是更多地沿用了模式生物的方法，利用相對簡單的模式生物來研究細(xì)胞生命的結(jié)構(gòu)、功能。如細(xì)胞周期與調(diào)控的研究，就是采用了酵母菌作為模式生物來研究并獲得突破的。創(chuàng)新微生物藥物的發(fā)現(xiàn)，尤其是抗生素的發(fā)現(xiàn)，完全可以利用模式微生物進(jìn)行規(guī)模化篩選，并結(jié)合臨床耐藥菌的檢測，使新型抗生素的發(fā)現(xiàn)更高效、更可靠。

4 規(guī)模化開發(fā)利用微生物資源，獲得高質(zhì)量大規(guī)模的微生物產(chǎn)物純品庫將有利于創(chuàng)新微生物藥物的快速發(fā)現(xiàn)

迄今為止，世界范圍內(nèi)曾經(jīng)獲得的具有可靠結(jié)構(gòu)表述的天然微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物只有 20 000 多個(gè)，而直接作為藥物或經(jīng)改造成為臨床用藥或農(nóng)用的微生物產(chǎn)物接近 200 個(gè)。是所有化合物種類中成藥率最高的。但所謂的 20 000 多個(gè)微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物其大部分只是在不同的實(shí)驗(yàn)室短暫存在的，大多數(shù)化合物只是用于測定了化學(xué)結(jié)構(gòu)和單一的抗菌或特定活性后就用完，無法留存下來。如果能有數(shù)以千計(jì)的微生物產(chǎn)物純品，對于集中進(jìn)行多活性的規(guī)模化篩選，快速獲得微生物藥物先導(dǎo)化合物是非常有意義的。隨著化學(xué)分離手段的進(jìn)步與發(fā)展，以及我國在藥物研發(fā)經(jīng)費(fèi)投入的加大，在我國開展規(guī)?；⑸锎渭?jí)代謝產(chǎn)物的分離純化與鑒別，建立規(guī)?；奈⑸锂a(chǎn)物純品庫已經(jīng)成為可能，而且也十分必要。這是創(chuàng)新微生物藥物快速高效發(fā)現(xiàn)的必然要求，同時(shí)也是人類戰(zhàn)勝細(xì)菌耐藥的戰(zhàn)略需求，因?yàn)槲⑸锎渭?jí)代謝產(chǎn)物中蘊(yùn)藏著抵御烈性微生物和耐藥微生物的多樣性的高效分子。利用微生物天然化合物資源戰(zhàn)勝微生物侵襲與耐藥是自然之作，也是人類賴以借用的有力武器。

5 微生物基因組學(xué)揭示了微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物具有廣泛的結(jié)構(gòu)多樣性和巨大的開發(fā)潛力

已知現(xiàn)在可培養(yǎng)并能產(chǎn)生微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物以供研究的微生物只占所有微生物種類的 2% ~5%。而相關(guān)能產(chǎn)生抗生素或有用次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生菌的基因組學(xué)研究表明，微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成基因往往成簇存在，一般一株鏈霉菌的基因組中編碼與次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成相關(guān)的基因簇有 20 多個(gè)，而一株絲狀真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇可能有 30 個(gè)以上。因此，每株鏈霉菌或每株絲狀真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物的種類應(yīng)該以數(shù)十計(jì)，因?yàn)槌擞?20 多種生物合成的途徑外，還有相互之間的組合，產(chǎn)物的修飾。因此，微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物本身就是一個(gè)多樣性的化學(xué)結(jié)構(gòu)群。這些次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇決定了微生物可以利用各種原料進(jìn)行多樣性的組合合成多樣性的有機(jī)分子。而這些分子又注定在調(diào)節(jié)蛋白活性上具有天賦的功能。因此，有理由相信，微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物具有很好的成藥性并不是巧合，而是具有一定的必然性。

6 微生物藥物的再發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu)改造與優(yōu)化將提高創(chuàng)新微生物藥物發(fā)現(xiàn)的效率

隨著抗生素在臨床的應(yīng)用，由于微生物固有的耐藥機(jī)制和不斷誘導(dǎo)所產(chǎn)生的耐藥性，使許多臨床上的抗生素失去療效?，F(xiàn)在臨床感染 MSAR、VRE、多藥耐藥和超級(jí)耐藥菌不斷被報(bào)道，各種耐藥菌的感染率不斷上升，這就迫切需要新的抗生素出現(xiàn)。但實(shí)際上，近四十年來，僅有 4 種新的結(jié)構(gòu)骨架抗生素面世，情況并不樂觀。由于回報(bào)率相對較低，許多大的企業(yè)紛紛把注意力轉(zhuǎn)向了生物技術(shù)大分子藥物如抗體藥物等的研發(fā)。但是，創(chuàng)新微生物藥物的研發(fā)仍在不斷進(jìn)行。其中，挖掘已有的微生物活性產(chǎn)物潛力，發(fā)現(xiàn)新的活性，對微生物產(chǎn)物進(jìn)行新的結(jié)構(gòu)修飾不失為一種策略。近年來，各國批準(zhǔn)的新微生物藥物或正處在臨床試驗(yàn)的一批微生物藥物，很多都是已有微生物藥物的再發(fā)現(xiàn)或結(jié)構(gòu)優(yōu)化產(chǎn)物（表 1）。因此，開展對微生物產(chǎn)物的多活性藥物篩選，包括對已有微生物藥物新活性的發(fā)現(xiàn)及機(jī)制研究，也會(huì)促進(jìn)新的微生物藥物的產(chǎn)生。

表 1 近 10年來各國批準(zhǔn)的新微生物藥物

7 展望

進(jìn)入二十一世紀(jì)以來，微生物藥物的研究方興未艾。隨著生物醫(yī)學(xué)、微生物基因組學(xué)、功能基因組學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)以及生物信息學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，更多的藥物作用靶點(diǎn)將不斷被發(fā)現(xiàn)。近年來，國際上在現(xiàn)有微生物藥物及其衍生物的進(jìn)一步開發(fā)利用方面，取得了可喜的成績。近 10年新的化學(xué)實(shí)體中，有 10% 以上屬于微生物藥物，但多數(shù)屬于新的衍生物的開發(fā)，如雷帕霉素的兩個(gè)衍生物用于抗腫瘤藥物[4]，多個(gè)碳青霉稀類藥物的開發(fā)，屬于對微生物藥物硫霉素的改進(jìn)和發(fā)展。與此同時(shí)，隨著海洋微生物及其他極端環(huán)境中微生物資源的開發(fā)利用，每年發(fā)現(xiàn)新微生物產(chǎn)物的數(shù)量在增加，微生物藥物的發(fā)現(xiàn)也將進(jìn)入新的階段。隨著我國“十一五”期間，“重大新藥創(chuàng)制”和“艾滋病及肝炎等重大傳染性疾病防治”兩個(gè)重大專項(xiàng)的啟動(dòng)與實(shí)施，我國對于創(chuàng)新微生物藥物的投入有所改善，我國每年新分離的微生物產(chǎn)物達(dá)到 200 多個(gè)。我國地大物博，環(huán)境多樣，具有豐富的微生物資源，只有繼續(xù)深入發(fā)掘微生物來源的藥物，才能更好地應(yīng)對各種突發(fā)流行性疾病的威脅，為保障人類生命健康作出應(yīng)有的貢獻(xiàn)。

[1]Du HZ, Liu GL, Wang TJ, et al.Progress in the international development of biotechnology medicines.Chin J New Drugs, 2009,18(22):2118-2130.(in Chinese)

杜海洲, 劉桂玲, 王天津, 等.國際新生物技術(shù)藥開發(fā)研究進(jìn)展.中國新藥雜志, 2009, 18(22):2118-2130.

[2]Wang Y, Wang QJ, Liao MY.Application of the technologies of proteomics in drug-induced hepatotoxicity.Chin J New Drugs, 2008,17(04):348-352.(in Chinese)

王瑩, 王全軍, 廖明陽.蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在藥物肝毒性研究中的應(yīng)用.中國新藥雜志, 2008, 17(04):348-352.

[3]Qian Z.The genone research of the targets in antifungal drugs.(2007-03-05)[2011-03-20].http://www.100md.com/html/DirDu/2007/03/05/39/15/04.htm.

錢震.抗真菌藥物靶點(diǎn)的基因組研究.(2007-03-05)[2011-03-20].http://www.100md.com/html/DirDu/2007/03/05/39/15/04.htm.

[4]Li DF, Chen XH.Recent developments of rapamycin analogues.World Clin Drugs, 2010, 31(1):31-34.(in Chinese)

栗東方, 陳秀華.雷帕霉素衍生物的開發(fā)進(jìn)展.世界臨床藥物,2010, 31(1):31-34.

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.02.001

十一五“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項(xiàng)（2009ZX09302-004、2009ZX09301-003）；十一五國家科技支撐計(jì)劃（2008BAI64B02）

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所

司書毅，Email：sisyimb@hotmail.com

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