劉娟

當歸多糖對不同化學性肝損傷的干預作用

劉娟

目的觀察純化當歸多糖對酒精性及四氯化碳性肝損傷的干預作用,并探討其初步機制。方法分別采用乙醇及四氯化碳制造小鼠肝損傷模型,給予純化當歸多糖,按 100mg/kg和200mg/kg口服給藥進行干預。觀察血清 sALT、sAST的變化;測定抗氧化指標 SOD、MDA、GSH的含量;以苯胺羥化酶反映 CYP2E1活性。結果當歸多糖兩劑量組均可降低酒精性及四氯化碳性肝損傷模型組的sALT、sAST,減輕肝臟損傷;兩組引起的抗氧化功能下降均可被當歸多糖不同程度的抑制;當歸多糖可抑制乙醇所致的 CYP2E1上調,但對四氯化碳所致的 CYP2E1酶活性降低卻無明顯影響。大劑量組的上述作用更為明顯。結論純化當歸多糖對不同化學性肝損傷均有明顯的干預作用,但其干預能力因保護機制不同而有所差別。

當歸多糖;乙醇;四氯化碳;肝損傷;CYP2E1

肝損傷是臨床常見的癥狀,許多因素如病毒、藥物、酒精等均可導致肝損的產生,若診治不當,會導致肝衰竭,引起嚴重后果。現代醫(yī)學對肝損的研究比較深入,已從多方面探討了其發(fā)生機制,并研制了抗脂質過氧化劑、抗免疫反應劑等保肝藥物,但有些因其不良反應或療效不夠理想而限制了臨床使用。多糖作為一種天然活性成分,低毒價廉的優(yōu)勢使其具有廣泛的應用前景。目前已證實,蘆根多糖、云芝多糖和枸杞多糖均具有良好的護肝作用[1,2]。

當歸多糖(ASP)是從我國的一味傳統(tǒng)中藥當歸中提取的重要活性成分,研究表明其具有豐富的生物學活性,包括影響造血系統(tǒng)、調節(jié)免疫、抗腫瘤等等[3,4]。本文從甘肅岷縣新鮮當歸中提取分離了含量較高的 ASP,分別觀察其對酒精性及四氯化碳性肝損傷的作用如何,并對其可能的機制進行探討。

1 材料和方法

1.1 藥品 制備純化當歸多糖:甘肅岷縣新鮮當歸,經水煮-醇沉法得當歸粗多糖,經 Sevag法去蛋白,醇沉,冷凍干燥10h,所得當歸多糖為淺米灰色疏松狀粉末,測得其總糖含量為 96.8%。

1.2 試劑 氧化型輔酶Ⅱ;還原型谷胱甘肽;1-氯-2,4-二硝基苯;二硫雙硝基苯甲酸均為 Sigma產品;sALT、sAST、SOD及MDA等測定試劑盒,均為南京建成生物工程研究所;余均為市售分析純產品。

1.3 動物 健康♂昆明種小鼠,SPF級,體重 20～22g。湖北省醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。

1.4 方法

1.4.1 酒精性肝損傷模型的建立及處理 小鼠隨機分為四組:空白對照組;酒精模型組;ASP小劑量組(100mg/kg)及大劑量組(200mg/kg),i.g.給藥,qd×10d,其余動物給予等容量生理鹽水。末次給藥后 4h除空白對照,其余三組均給予 56%酒精 6.64g/kg i.g.,禁食不禁水,19h后重復一次。6h后,處死動物。

1.4.2 四氯化碳性肝損傷模型的建立及處理 小鼠隨機分為四組:空白對照組;CCl4模型組;ASP小劑量組(100mg/kg)及大劑量組(200mg/kg),i.g給藥,qd×10d,其余動物給予等容量生理鹽水。末次給藥后 4h,各組均按CCl40.15mg/kg劑量灌胃,空白對照給予等容量生理鹽水。6h后,動物斷頭處死。

1.4.3 標本制備 小鼠摘眼球取血,制備血清,置于-20℃保存。迅速剖腹取肝臟,置于冰凍生理鹽水中反復漂洗,濾紙吸干,稱重。采用 Tris-HCl 50mmol/L,pH 7.4制備肝勻漿。9000g離心 20min,取上清液為 S9組分,于-80℃保存。

1.4.4 檢測指標 賴氏法測定血清 sALT及 sAST活性。黃嘌呤氧化酶法測定 SOD活力。TBA法測定MDA含量。DTNB比色法測定GSH含量。測定肝 S9的苯胺羥化酶以反映CYP2E1活性。

2 結果

2.1 ASP對急性酒精性肝損傷小鼠的干預作用

2.1.1 ASP對小鼠sALT、sAST及肝臟指數的影響 酒精模型組小鼠 sALT、sAST較空白對照組上升 83.8%及 133.7%(P均 ＜0.01),肝臟指數明顯增大(P＜0.01),反映了短期急性攝入乙醇所產生的肝臟損害。與模型組相比,兩劑量組ASP均可顯著抑制酒精所致小鼠 sALT(分別降低 25.2%、35.3%)及 sAST水平 (分別降低 31.8%、34.4%)的上升幅度,并使肝臟指數保持正常(表1)。

表1 ASP對急性酒精性肝損傷小鼠 sALT、sAST及肝臟指數的影響

2.1.2 ASP對小鼠肝 S9組分 GSH、SOD及 MDA活性的影響 結果可見,模型組小鼠 MDA含量顯著增高,GSH、SOD活性明顯下降。ASP100mg/kg、200mg/kg對上述指標的改變均有一定程度的緩解,其中大劑量ASP的作用似乎更為顯著(見表2)。

表2 ASP對急性酒精性肝損傷小鼠 GSH、SOD及 MDA的影響

2.1.3 ASP對小鼠肝臟 CYP2E1活性的影響已知乙醇為CYP2E1誘導劑,其活性增加與乙醇肝毒作用有關。本文結果顯示,模型組 CYP2E 1酶活性升高(1.4倍),ASP100mg/kg對 CYP2E1有一定的抑制趨勢,而 200mg/kg劑量組則明顯抑制了 CYP2E 1的上調,與模型組相比具有顯著性差異。(圖1)＜0.01

圖 1ASP對急性酒精性肝損傷小鼠 CYP2E 1活性的影響

2.2 ASP對急性四氯化碳性肝損傷小鼠的干預作用

2.2.1 ASP對小鼠sALT、sAST及肝臟指數的影響 結果顯示,CCl4模型組小鼠 sALT、sAST分別上升至空白對照組的11.0倍及 9.5倍(P均＜0.01),表明肝臟嚴重受損,但肝臟指數無明顯變化。與模型組相比,ASP兩劑量組均抑制了CCl4所致小鼠 sALT(分別降低 14.4%、15.3%,P均 ＜0.01)及 sAST水平 (分別降低 11.1%、17.8%,P均 ＜0.01)的上升幅度(表3)。

表3 ASP對四氯化碳性肝損傷小鼠 sALT、sAST及肝臟指數的影響

2.2.2 ASP對小鼠肝 S9組分 GSH、SOD及 MDA活性的影響 結果可見,模型組小鼠 SOD、GSH活性明顯下降,MDA含量則顯著增高。給予 ASP 100mg/kg、200mg/kg進行干預后,SOD活性較模型組分別上升了 7%(P＜0.05)和 11.5%(P＜0.01),呈現出一定程度的劑量關系;GSH則恢復至對照組的 83.2%和 84.2%(P均＜0.05);MDA的增高亦有部分逆轉,分別下降至模型組的 95.0%及 93.7%(P均 ＜0.05)。 (表4)

表4 ASP對四氯化碳性肝損傷小鼠 GSH、SOD及 MDA的影響

2.2.3 ASP對小鼠CYP2E1活性的影響 結果顯示,四氯化碳性模型組 CYP2E 1酶活性僅為正常組的 9.2%,與文獻報道相符[5]。Wong等人的實驗表明,CCl4能夠抑制 CYP2E1蛋白合成,降低其酶活性。但 ASP 100mg/kg及 200mg/kg劑量組對 CYP2E1酶活性均無明顯影響。(圖 2)

圖 1ASP對四氯化碳性肝損傷小鼠 CYP2E 1活性的影響

3 討論

急性酒精性中毒是臨床上造成肝損傷的常見原因,這與乙醇在肝臟內經 CYP2E1催化后生成的毒性產物乙醛有關。實驗結果顯示,ASP能明顯抑制乙醇所致的血清轉氨酶升高,減輕肝損程度,而這種保護作用很可能與 ASP能特異性下調乙醇對 CYP2E1水平的誘導有密切關系:當 CYP2E1活性降低時,將減少乙醛及自由基的生成,從而有利于減輕酒精對肝細胞的損害。此外,ASP部分恢復抗氧化功能也應是ASP對抗酒精性肝毒的原因之一。

四氯化碳作為一個典型肝毒物質,進入體內后主要經肝臟CYP2E1代謝,生成 CCl3等產物。自由基可誘發(fā)膜脂質過氧化,并與蛋白質大分子進行共價結合,從而破壞肝細胞膜結構與功能的完整性,干擾了蛋白質的合成。實驗結果顯示,預先給予ASP處理,能有效抑制四氯化碳所致的血清酶漏出。ASP的這種保肝機制可能是由于其抑制肝細胞脂質過氧化反應,穩(wěn)定生物膜,從而降低膜的通透性,使肝細胞變性和壞死減輕,并迅速恢復肝細胞的功能。上文已提及,CYP2E1參與了 CCl4的肝毒形成機制,但關于 CCl4對CYP2E1活性的影響,文獻報道不一。有研究結果顯示[5],CYP2E1活性明顯降低,認為可能是由于在代謝過程中被CCl4降解所致;也有人認為 CCl 4對 CYP2E 1的 mRNA及其蛋白有著顯著的誘導作用[6]。本文實驗結果可見,CCl4模型中 CYP2E1活性極度抑制,與前者一致。由于 ASP未影響CYP2E1的水平,提示此酶并非ASP保護 CCl 4性肝損傷的作用環(huán)節(jié),還應存在其他途徑,尚需進一步研究。

綜上所述,ASP對兩種肝損模型的癥狀均有不同程度的緩解,其中對酒精性肝損的保護作用要更為顯著,提示 ASP對不同化學性肝損傷皆有干預作用,但其干預能力因保護機制不同而有所差別。

[1] 張國升,凡明月.蘆根多糖對四氯化碳小鼠肝損傷的保護作用.中國藥理學通報,2002,18(3):354-355.

[2] 孫設宗,唐微.云芝多糖對小鼠實驗性肝損傷保護作用的研究.中國現代醫(yī)學雜志,2008,18(9):1217.

[3] 華自森,王建偉,宋姝丹,等.當歸多糖對 K 562白血病細胞JAK 2、STAT3表達和活化的影響.解剖學雜志,2009,32(1):8-11.

[4] 孫文平,羅紅,楊光,等.當歸多糖激發(fā)免疫反應的特征研究.大連醫(yī)科大學學報,2009,31(2):262-264.

[5] Wong FW,ChanWH,Lee SS.Resistance to carbon tetrachloride induced hepatotoxicity in mice which lack CYP2E 1expression.Toxicol Appl Pharmacol,1998,153:109-118.

[6] Ha KT,Yoon SJ,ChoiDY,Kim DW,Kim JK,Kim CH.Protective effect of Lycium chinense fruiton carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity.JEthnopharmacol,2005,96(3):529-535.

430065武漢科技大學醫(yī)學院藥學系