趙恒伍，張錦程，李長(zhǎng)有

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，沈陽(yáng) 110001）

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞中Ihh和p38MAPK的表達(dá)

趙恒伍，張錦程，李長(zhǎng)有

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，沈陽(yáng) 110001）

目的探討血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）對(duì)大鼠成骨細(xì)胞Ihh和p38MAPK的調(diào)節(jié)作用。方法 取胎鼠顱蓋骨分離培養(yǎng)成骨細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)成骨細(xì)胞中Ihh及其受體Ptch1和p38MAPK的表達(dá)，檢測(cè)成骨細(xì)胞在不同濃度（0，2，20ng/ml）及不同時(shí)間（0，12，24h）的VEGF作用下Ihh和p38MAPK的表達(dá)情況。結(jié)果 成骨細(xì)胞表達(dá)Ihh及其受體Ptch1，同時(shí)表達(dá)p38MAPK。隨著VEGF濃度的增加，Ihh和p38MAPK的表達(dá)量均明顯增加；隨著VEGF作用時(shí)間的增加，Ihh和p38MAPK的表達(dá)量與對(duì)照組相比有明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì)。結(jié)論Ihh與其受體Ptch1在成骨細(xì)胞中共表達(dá)，Ihh以自分泌方式調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞功能；VEGF上調(diào)成骨細(xì)胞中Ihh和p38MAPK的表達(dá)，并且VEGF可能通過(guò)調(diào)節(jié)p38MAPK的表達(dá)而影響Ihh的表達(dá)，可能存在VEGF-p38MAPK-Ihh通路。

成骨細(xì)胞；大鼠；Ihh；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作為血源性因子具有調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的功能。Hedgehog（Hh）蛋白家族包括3個(gè)成員：Sonic Hedgehog（Shh）、Indian Hedgehog（Ihh） 和 Dersert Hedgehog（Dhh）。其中，Shh和Ihh作為重要的信號(hào)分子，在肢體發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，Ihh影響成骨細(xì)胞的發(fā)育［1］。p38絲裂素活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路在成骨細(xì)胞增殖、分化中有重要意義［2］。本研究對(duì)VEGF是否可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞中Ihh和p38MAPK的表達(dá)進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：新生SD大鼠胎鼠，清潔級(jí)，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 藥品和試劑：鼠重組VEGF蛋白（美國(guó)Pepro－Tech公司），α-MEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），I型膠原酶（美國(guó)Sigma公司），堿性磷酸酶染色試劑盒（南京建成生物工程研究所），茜素紅（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)解剖教研室惠贈(zèng)），Trizol、實(shí)時(shí)PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），PCR引物由TaKaRa公司合成。

1.2 方法

1.2.1 成骨細(xì)胞培養(yǎng)：出生24h內(nèi)的大鼠，切下顱蓋骨，用剪刀將骨組織剪碎，0.5%Ⅰ型膠原酶5ml 37℃預(yù)消化20min，棄消化液，0.5%Ⅱ型膠原酶5ml 37℃消化20min，移取消化液，將骨片再次0.5%Ⅱ型膠原酶5ml 37℃消化20min，移取消化液，如此反復(fù)4次，將移取的消化液1000r/min離心10min，棄上清，加入培養(yǎng)液適量；混勻消化的細(xì)胞，以1.2×104/cm2接種于 25cm2培養(yǎng)瓶，置 5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組：第4代成骨細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)，用含1%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基同步化后隨機(jī)分為：（1）正常對(duì)照組：只加1%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)；（2）VEGF 組：不同濃度（0，2，20ng/ml）及不同時(shí)間（0，12，24h）的 VEGF 培養(yǎng)。

1.2.3 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)IhhmRNA、Ptch1mRNA和p38MAPKmRNA的表達(dá)：Trizol提取總細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。Ihh上游引物為5′-TGCCTCCGT CCTCTGCT-3′，下游引物為 5′-CACTACCTGGTCAA GTCTCAAA-3′；Ptch1上游引物為 5′-TCCTGATTGC GTCTGTTG-3′，下游引物為 5′-AGCCCTGTGGTTCT TGTC-3′；p38MAPK 上游引物為 5′-AGACCGTTTCA GTCCATCA-3′，下游引物為 5′-TCACATTCTCGTGC TTCAT-3′；內(nèi)參照 GAPDH，上游引物為 5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物為 5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。PCR 反應(yīng)條件為 95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 30s，45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，采用PCR儀（Gene 6000）軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞培養(yǎng)鑒定

成骨細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中表現(xiàn)出均一的短梭形或三角形，培養(yǎng)一段時(shí)間后細(xì)胞呈鋪路石樣改變，經(jīng)ALP染色胞質(zhì)呈黑紫色（圖1A，B）。含β硝酸甘油的培養(yǎng)基培養(yǎng)2周，可見(jiàn)鈣結(jié)節(jié)形成，經(jīng)茜素紅染色呈磚紅色結(jié)節(jié)（圖1C）。

2.2 成骨細(xì)胞中Ihh、Ptch1和p38MAPKmRNA的表達(dá)

PCR結(jié)果顯示，成骨細(xì)胞中Ihh及其受體Ptch1mRNA清晰表達(dá)，p38MAPKmRNA也清晰表達(dá)（圖2）。

2.3 VEGF調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞中Ihh和p38MAPKmRNA的表達(dá)

在不同濃度（0，2，20ng/ml）VEGF 作用下，Ihh和p38MAPKmRNA的表達(dá)量均隨VEGF濃度的增加而增多，在20ng/ml VEGF作用下Ihh和p38MAPKmRNA的表達(dá)量分別約為無(wú)VEGF作用時(shí)的2.6倍（圖3A）和4.7倍（圖3B）；在同一劑量（20ng/ml）VEGF的作用下，Ihh和p38MAPKmRNA的表達(dá)量隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增多，在24h時(shí)Ihh和p38MAPKmRNA的表達(dá)量分別約為0h的2.8倍（圖4A）和 2.9倍（圖 4B）；無(wú) VEGF作用時(shí)，Ihh和 p38MAPKmRNA的表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)均無(wú)明顯變化（圖4）。

3 討論

Ihh是一種分泌型蛋白，屬于Hedgehog信號(hào)家族，是果蠅節(jié)段性極性基因Hedgehog在脊椎動(dòng)物體內(nèi)的同源物，主要表達(dá)于哺乳動(dòng)物肥大軟骨細(xì)胞，與胚胎發(fā)育過(guò)程中骨骼的形成密切相關(guān)。Ptch1是Ihh信號(hào)通路受體細(xì)胞上的受體蛋白及下游目標(biāo)基因，為一類12通道的跨膜蛋白，當(dāng)Ihh蛋白與Ptch1結(jié)合后，誘導(dǎo)一系列下游信號(hào)分子的釋放，發(fā)揮其調(diào)控作用［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞中Ihh及其受體Ptch1同時(shí)表達(dá)。近年研究發(fā)現(xiàn)Ihh參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育的軟骨內(nèi)成骨過(guò)程，其主要作用是影響軟骨細(xì)胞的終末分化，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化［4］。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Ihh可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。干預(yù)Ihh信號(hào)（Ihh缺如、抑制Ihh受體Ptch1）發(fā)現(xiàn)，鼠的骨領(lǐng)和初級(jí)骨小梁都未形成［5，6］。這些都說(shuō)明了Ihh與其受體Ptch1結(jié)合調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞功能。本研究證實(shí)Ihh及其受體Ptch1可在成骨細(xì)胞合成，通過(guò)自分泌方式調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞功能。

MAPK屬絲氨酸蘇氨酸激酶，是一類分布于胞質(zhì)中具有絲氨酸和酪氨酸雙重磷酸化能力的蛋白激酶。MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是細(xì)胞外信號(hào)引起細(xì)胞核內(nèi)反應(yīng)的通道之一，可參與細(xì)胞的形成、運(yùn)動(dòng)、凋亡、分化及生長(zhǎng)增殖等多種生理過(guò)程［7］。p38MAPK途徑是MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的通道之一，是成骨細(xì)胞增殖分化調(diào)節(jié)的重要信號(hào)通路之一［8］。本研究也證實(shí)了p38MAPK在成骨細(xì)胞是有表達(dá)的。

本研究還證實(shí)，VEGF促進(jìn)成骨細(xì)胞中Ihh的表達(dá)，同時(shí)也可促進(jìn)p38MAPK的表達(dá)。VEGF作用下，Ihh和p38MAPK的表達(dá)量與VEGF存在劑量依賴性和時(shí)間依賴性；隨著VEGF劑量加大、VEGF作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Ihh和p38MAPK的表達(dá)量增加。Kim等［9］在成骨樣細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，VEGF對(duì)p38MAPK有調(diào)節(jié)作用，這與我們研究的結(jié)果一致。但關(guān)于VEGF是否具有調(diào)節(jié)Ihh作用的文獻(xiàn)報(bào)道很少。Li等［10］發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中Ihh的表達(dá)通過(guò)p38MAPK途徑，p38MAPK的表達(dá)增加可促進(jìn)Ihh的表達(dá)增加。由此推斷，成骨細(xì)胞中VEGF可能通過(guò)促進(jìn)p38MAPK的表達(dá)促進(jìn)Ihh的表達(dá)。本研究證實(shí)，VEGF可促進(jìn)Ihh的表達(dá)，VEGF作用下p38MAPK的表達(dá)與Ihh的表達(dá)有相關(guān)性。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，VEGF可調(diào)節(jié)p38MAPK和Ihh，提示可能存在VEGF-p38MAPK-Ihh調(diào)節(jié)通路。

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（編輯陳 姜，英文編輯王又冬）

Effect of Vascular Endothelial Growth Factor on the Expressions ofIhhandp38MARKin Osteoblasts

ZHAO Heng-wu，ZHANG Jin-cheng，LI Chang-you
（Department of Orthopedics，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo explore the effect of vascular endothelial growth factor （VEGF）on the expressions of Indian hedgehog（Ihh）and p38mitogen-activated protein kinase （MAPK）in osteoblasts.MethodsThe osteoblasts from the calvarial of neonatal rats were cultured and treated with different concentrations （0，2，and 20ng/ml）of VEGF for various durations （0，12，and 24hours）.The expressions levels ofIhhand its receptorPtch1andp38MAPKin the osteoblasts were determined with real-time polymerase chain reaction.ResultsIhh，Ptch1，andp38MAPKexpression were observed in the osteoblasts.With the increase of the concentration of VEGF，the expressions levels ofIhhandp38MAPKsignificantly increased.Compared with control group，the expresions ofIhhandp38MAPKtended to increase with the prolongation of the duration of VEGF treatemnt.ConclusionIhhandPtch1were coexpressed in the osteoblasts.Ihhregulates the osteoblasts in an autocrine manner.VEGF might upregulates the expressions ofIhhby regulatingp38MAPKexpression.VEGF-p38MAPK-Ihh pathway might exist in the osteoblasts.

osteoblast；rat；indian hedgehog；vascular endothelial growth factor

R593.22

A

0258-4646（2011）02-0113-04

doiCNKI：21-1227/R.20110212.0950.004

遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（20092119）

趙恒伍（1985-），男，碩士研究生.

李長(zhǎng)有，E-mail：cyli@mail.cmu.edu.cn

2010-11-23