閔睿，王宗謙，陳望，趙欣欣，李艷濃，丁紅

（中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院腎內(nèi)科，沈陽 110032）

交感能受體阻斷劑和去腎神經(jīng)對5/6腎切除大鼠的腎臟保護作用

閔睿，王宗謙，陳望，趙欣欣，李艷濃，丁紅

（中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院腎內(nèi)科，沈陽 110032）

目的探討交感能受體阻斷劑與去腎神經(jīng)對慢性進行性腎小球硬化（5/6腎切除大鼠慢性腎衰竭動物模型）的腎臟保護作用。方法 雌性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量為（200±10）g，隨機分成4組，每組10只。陰性對照組行假手術（麻醉后行腎周包膜剝除術），術后2周開始灌服飲用水；陽性對照組行5/6腎切除術，術后2周灌服飲用水；交感阻斷劑組行5/6腎切除術，術后2周灌服交感能受體阻斷劑（阿爾瑪爾20mg·kg－1·d－1）；去腎神經(jīng)組行5/6腎切除術后2周行殘腎去腎神經(jīng)術（2周后開始灌服飲用水）。干預時間為8周。所有大鼠術后第2、4、6、8、10周用鼠尾測壓儀測量大鼠血壓并將大鼠置于代謝籠，留取24h尿液，之后以考馬斯亮藍法行尿蛋白定量檢測；術后10周即實驗結(jié)束時采血測定血紅蛋白及生化指標；同時留取腎臟標本行腎臟病理、免疫印跡測定Ⅲ型膠原（Col-Ⅲ）、Ⅳ型膠原（Col-Ⅳ）及血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1-R），應用實時熒光定量PCR檢測Col-Ⅲ、Col-Ⅳ及AT1-R的mRNA的表達。結(jié)果 與陰性對照組相比，陽性對照組大鼠的血壓［（173.49±16.48）mmHg vs（118.67±13.34）mmHg）］和尿蛋白定量［（35.35±4.58）mg/24h vs（6.19±2.70）mg/24h）］均明顯升高（P＜ 0.05），腎臟病理改變明顯加重（P＜0.05），Col-Ⅲ、Col-Ⅳ和AT1-R及其mRNA的表達均明顯增多（P＜0.05）；與陽性對照組相比，交感阻斷劑組和去腎神經(jīng)組大鼠的血壓改善［（107.99±12.35）mmHg，（115.67±15.53）mmHg vs（173.49±16.48）mmHg）］，尿蛋白定量減少［（14.23±0.69）mg/24h，（16.49±3.77）mg/24h vs（35.35±4.58）mg/24h）］（P＜ 0.05），病理改變減輕，Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、AT1-R及其 mRNA的表達有不同程度的改善，其中尤以AT1-R的蛋白定量及其mRNA的表達明顯減少（P＜0.05）；但兩個干預組不論是血壓、尿蛋白定量、血紅蛋白水平、生化指標、病理改變還是Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、AT1-R水平以及其mRNA表達均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。結(jié)論 交感能受體阻斷劑和去腎神經(jīng)均能夠明顯減輕和延緩5/6腎切除大鼠的腎小球纖維化、硬化，起到良好的腎臟保護作用。

慢性腎臟??；交感能受體阻斷劑；5/6腎切除模型；去腎神經(jīng)

慢性腎衰竭乃至尿毒癥是常見病、多發(fā)病，在我 國每年約有10余萬人罹患尿毒癥，只有腎臟替代治療才能維持尿毒癥患者長期生存，然而無論透析或腎移植都相當昂貴，使醫(yī)療開支巨大，且至少半數(shù)以上的病人因經(jīng)濟所限而放棄治療，勞動力損失極大。因此，防止各種慢性腎臟疾病（chronic kidney disease，CKD）進展為尿毒癥或終末期腎病（end stage renal disease，ESRD）才是根本的防治措施。

眾所周知，高血壓和蛋白尿是CKD發(fā)生與發(fā)展最主要的兩大獨立危險因素。近年來，人們一直關注腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）在CKD發(fā)生與發(fā)展中的重要作用，通過使用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）和（或）血管緊張素受體阻斷劑（angiotensin Ⅱ receptor blocker，ARB）治療 CKD，取得了一定的療效，但十分有限。研究表明，交感神經(jīng)系統(tǒng)（sympathetic nervous system，SNS）活性在 CKD的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮著至關重要的作用［1，2］。一方面，交感神經(jīng)興奮使血壓升高；另一方面，交感神經(jīng)過度興奮使RAS異常激活，從而加重高血壓和蛋白尿，加速CKD進展。而且，交感異常活化與CKD心血管并發(fā)癥密切相關。為此，我們通過制備慢性腎衰竭動物模型，分別給予交感能受體阻斷劑或去腎神經(jīng)，觀察和比較其對腎臟的保護作用，為探索防治和延緩CKD發(fā)生與發(fā)展新的方法或手段提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品、試劑與儀器

阿爾瑪爾（10mg×10日本住友制藥株式會社）；Collagen IV抗體、CollagenⅢ抗體、血管緊張素Ⅱ1型受體（angiotensinⅡ subtype 1receptor，AT1-R）抗體 （1E10-1A9，abcam 公 司）；TIANScript RTKit（TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒）、RNAsimple total RNAKit總RNA提取試劑盒（天根）。鼠尾測壓儀RBP-1B（北京中日友好臨床醫(yī)學研究所）；電泳系統(tǒng) （電泳）DYY-10C、電泳系統(tǒng)（轉(zhuǎn)?。〥YCZ-24DN、凝膠成像系統(tǒng)WD-9413B型（北京六一）；超微量分光光度計NANODROP2000、紫外分光光度計NANO2000（美國Thermo）；熒光定量PCR儀（韓國BIONEER）；PCR儀（杭州博日儀器）。

1.2 實驗對象及分組

雌性Wistar大鼠［實驗動物生產(chǎn)許可證為：SYXK（遼）2003-0019，飼養(yǎng)許可證為：SYXK（遼）2003-0015］40只，體質(zhì)量190～210g，隨機分成4組，每組10只。陰性對照組行假手術，術后2周開始灌服飲用水（4mL·d-1）；陽性對照組行5/6腎切除術，術后 2周開始灌服飲用水（4mL·d－1）；交感阻斷組行5/6腎切除術，術后2周開始灌服阿爾瑪爾（20mg·kg－1·d－1，1mg·mL－1）；去腎神經(jīng)組行 5/6腎切除術后2周參照文獻［3］行殘腎去腎神經(jīng)術，術后2周灌服飲用水（4mL·d－1）。去腎神經(jīng)術后如大鼠出現(xiàn)跛行或癱瘓，則剔除試驗。

1.3 指標測定

1.3.1 一般檢查：（1）尿蛋白定量：術后 2、4、6、8、10周，將動物置入代謝籠留取24h尿液，以考馬斯亮藍法行尿蛋白定量檢測；（2）血壓：術后 2、4、6、8、10周以套尾法測量大鼠血壓，測量2次取平均值，按舒張壓＋1/3脈壓差的方法計算平均動脈壓；（3）生物化學檢測：術后10周（干預8周）后麻醉，經(jīng)腹主動脈采血，留取血標本，行血紅蛋白、總蛋白、白蛋白、尿素氮、肌酐測定。

1.3.2 腎臟病理檢查：手術后第10周處死大鼠，摘除殘腎后，切取適當大小組織塊于4%甲醛溶液中固定2～4h。常規(guī)石蠟包埋，切取3μm石蠟切片，行HE染色。鏡下觀察病理變化并拍照。從系膜增殖、節(jié)段球硬化、球囊黏連等幾個方面按-～+++4個等級半定量分析腎臟的病理改變。其中系膜增殖程度分級：“-”為無系膜增殖，“＋”為輕度系膜增殖，“++”為中度系膜增殖，“+++”為重度系膜增殖。節(jié)段腎小球硬化程度分級：“-”為無腎小球病變，“＋”為硬化節(jié)段＜25%，“++”為硬化節(jié)段介于25%～50%之間，“+++”為硬化節(jié)段＞50%。球囊黏連分級：“-”為無球囊黏連，“＋”為黏連范圍＜25%，“++”為黏連范圍介于25%～50%之間，“+++”為黏連范圍＞50%。上述檢測均由2位觀察者對每個樣本進行盲法評分，每個樣本觀察15～20個腎小球，陰性對照組每個樣本觀察12～15個腎小球。

1.3.3 免疫印跡：采用Western blot檢測技術，相對定量分析殘腎組織Ⅲ、Ⅳ型膠原及AT1-R的表達。用NP-40裂解液提取腎組織總蛋白，取30μg總蛋白上樣行10%SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，考馬斯亮藍染色，蒸餾水脫色，封閉。洗膜后加入一抗置于雜交袋中4℃孵育過夜。次日TTBS洗后加酶標二抗，37℃溫箱孵育1h后復洗。取出后TTBS洗15min×4次。加入ECL工作液，將PVDF膜固定在暗盒內(nèi)，暗室曝光1min。顯影、停影、定影、沖洗、晾干。膠片放入成像系統(tǒng)拍照。

1.3.4 實時熒光定量PCR：采用Real-time PCR技術定量測定殘腎組織中Ⅲ、Ⅳ型膠原及AT1-R的mRNA表達。利用RNAsimple total RNAKit提取試劑盒提取樣本總RNA，利用TIANScript RTKit對RNA樣本進行逆轉(zhuǎn)錄以得到對應的cDNA。利用得到的cDNA樣本對actin和H-FABP引物進行PCR擴增，對得到的PCR產(chǎn)物進行電泳分析，并經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照后進行熒光定量分析。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 尿蛋白定量

與陰性對照組比較，陽性對照組大鼠術后4、6、8、10周尿蛋白均逐漸增加，其中第6周開始明顯增加。與陽性對照組比較，干預組大鼠尿蛋白排泄量均顯著降低，但2組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05，表1）。

表15/6腎切除術后24h尿蛋白定量的比較（±s）Ta b.1Th e c o mp a r i s o n o f p r o t e i n u r i a p e r 24h a f t e r SNX（±s）1）P＜0.05vs negative control group；2）P＜0.05vs positive control group.

2.2 血壓的變化

與陰性對照組比較，陽性對照組術后第6周開始血壓升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），之后第6、8、10周之間無明顯升高。與陽性對照組比較，交感阻斷組和去腎神經(jīng)組大鼠的平均動脈壓下降從術后第6周開始差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），第6、8、10周平均動脈壓無明顯下降，但2組間差異無統(tǒng)計學意義（表2）。

表25/6腎切除術后大鼠平均動脈壓比較（±s）Ta b.2Th e c o mp a r i s o n o f MAPa f t e r SNX（±s）1）P＜0.05vs negative control group；2）P＜0.05vs positive control group.

2.3 生物化學檢測結(jié)果比較

與陰性對照組比較，5/6腎切除術后10周，所有手術組大鼠血肌酐水平均明顯升高（P<0.01），陽性對照組及干預組間比較血肌酐差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組間血紅蛋白、尿素氮、白蛋白、總蛋白變化差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表3）。

表35/6腎切除術后化驗指標比較（±s）Ta b.3Th e c o mp a r i s o n o f Hb，Cr，BUN，TP，ALBa f t e r SNX（±s）

2.4 腎臟病理結(jié)果

5/6 腎切除大鼠腎臟組織出現(xiàn)腎小球系膜增生、小球節(jié)段硬化、球囊黏連、腎間質(zhì)局灶淋巴細胞浸潤及纖維化等病理改變，部分腎小管內(nèi)可見蛋白管型。與陽性對照組比較，干預組大鼠殘腎的病理改變均有程度不同的減輕，以去腎神經(jīng)組大鼠病理改變最輕（表 4，圖 1）。

表45/6腎切除術后病理改變Ta b.4Th e c o mp a r i s o n o f p a t h o l o g y a f t e r SNXMesangioproliferative FSGS Adhesions-＋+++++-＋+++++-＋+++++Negative control 140 105 27 8 0 118 15 5 2 125 10 4 1Positive control 180 96 38 35 11 108 22 38 121） 113 31 27 91）Sympathetic blocking agent 180 118 28 26 81） 121 32 19 81） 134 18 24 41）Renal denervation 180 117 30 27 61） 124 24 25 71） 132 25 18 51）Group n 1）P＜0.05vs positive control group.

2.5 Western blot檢測結(jié)果

與陰性對照組比較，陽性對照組Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原以及AT1-R的表達均明顯增加。與陽性對照組比較，所有干預組Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原以及AT1-R的表達均明顯減少，以去腎神經(jīng)組減少最明顯（圖2）。

2.6 Real-time PCR結(jié)果

結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，陽性對照組Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原以及AT1-RmRNA的表達均明顯增加。與陽性對照組比較，所有干預組Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原以及AT1-RmRNA的表達均明顯減少，以去腎神經(jīng)組表達最少（表5～7）。

3 討論

5/6 腎切除手術模型是一種慢性進行性腎小球硬化動物模型。本試驗在術后第2周尿蛋白量開始增加，至術后第6周增加更明顯，且出現(xiàn)血壓的增高、腎功能的輕度異常以及早期腎小球硬化的表現(xiàn)，說明腎小球硬化動物模型制備是成功的。

表5各組Co l-ⅢmRNA的表達Ta b.5Th e e x p r e s s i o n o fCo l-ⅢmRNAGroup COL-Ⅲ-A Actin ΔCT ΔΔCT 2-ΔΔCT Negative control 19.8574 17.1342 2.7233 0.0000 1.0000Positive control 18.9179 17.9588 0.9591 －1.7642 3.3968Sympathetic blocking agent 19.8938 18.7039 1.1898 －1.5335 2.8948Renal denervation 20.3935 18.8126 1.5809 －1.1424 2.2075

近年研究發(fā)現(xiàn)交感的異常激活參與了腎衰竭的進展，并且與患者的心血管風險存在顯著的相關性，對于CKD的預后起到了很關鍵的作用［4］。大量的動物實驗和臨床證據(jù)證明，ESRD患者交感活性增高。CKD患者交感激活，其血漿兒茶酚胺水平明顯增高［5，6］，兒茶酚胺可通過β腎上腺素受體介導的增殖作用以及對足突細胞的損傷導致腎臟的損害［7］。兒茶酚胺亦能誘導血管平滑肌細胞和血管外膜成纖維細胞的增殖，加速腎小球硬化的進展。切除慢性腎衰竭患者的雙側(cè)腎臟后其血壓和交感活性恢復正常［1，2］，對腎衰竭模型進行雙側(cè)的去腎神經(jīng)后也可顯著地改善升高的血壓［8］，提示交感的異常激活是由受損的腎臟所產(chǎn)生的。去除交感傳出神經(jīng)可能會增加腎臟血管的收縮［9］，并且去神經(jīng)后尿鈉排泄增多［10］可能導致RAS的激活，因此去腎神經(jīng)盡量不要干擾傳出神經(jīng)；并且已經(jīng)證實，僅僅去除腎臟的傳入神經(jīng)就可以達到抑制交感活性的作用［3］。因此我們試驗選擇的是去除腎臟的傳入神經(jīng)。腎上腺素能受體阻斷劑亦能降低腎臟交感活性，達到腎臟保護作用。有很多的研究也顯示了5/6腎切除模型中α及β受體阻斷劑的腎臟保護作用。第三代的β受體阻斷劑，例如卡維地洛和奈必洛爾，通過刺激NO的釋放［11］，似乎比其他傳統(tǒng)的β受體阻斷劑具有更多的腎臟保護作用。

本試驗中采用了第三代的β受體阻斷劑——阿爾瑪爾拮抗交感的激活，去腎神經(jīng)選擇的是脊神經(jīng)后根切斷術，去除腎臟的傳入神經(jīng)。與陽性對照組比較，2組尿蛋白排泄量明顯減少，血壓下降，腎臟病理改變相對較輕，代表腎臟纖維化硬化的Ⅲ、Ⅳ型膠原和AT1-R及其mRNA的表達減少。因此，我們推斷，對慢性腎小球硬化模型進行交感阻斷，不論是藥物還是手術方法均能起到良好的腎臟保護作用。交感能受體阻斷劑聯(lián)合去腎神經(jīng)是否具有更好的腎臟保護作用，尚有待進一步研究證實。

［1］Koomans HA，Blankestijn PJ，Joles JA.Sympathetic hyperactivity in chronic renal failure：a wake-up call ［J］.JAm Soc Nephrol，2004，15（3）：524-537.

［2］Neumann J，Ligtenberg G，Klein II，et al.Sympathetic hyperactivity in chronic kidney disease：pathogenesis，clinical relevance，and treatment［J］.Kidney Int，2004，65（5）：1568-1576.

［3］Campese VM，Kogosov E.Renal afferent denervation prevents hypertension in rats with chronic renal failure［J］.Hypertension，1995，25（4pt2）：878-882.

［4］Ye S，Ozgur B，Campese VM.Renal afferent impulses，the posterior hypothalamus，and hypertension in rats with chronic renal failure［J］.Kidney Int，1997，51（3）：722-727.

［5］Klein IH，Ligtenberg G，Neumann J，et al.Sympathetic nerve activity is inappropriately increased in chronic renal disease ［J］.JAm Soc Nephrol，2003，14（12）：3239-3244.

［6］Cerasola G，Vecchi M，Mule G，et al.Sympathetic activity and blood pressure pattern in autosomal dominant polycystic kidney disease hypertensives［J］.Am JNephrol，1998，18（5）：391-398.

［7］張承英，陳香美.交感神經(jīng)興奮在慢性腎臟病進展中的作用［J］.醫(yī)學綜述，2007，13（10）：751-753.

［8］Ciriello J，de Oliveira CV.Renal afferents and hypertension［J］.Curr Hypertens Rep，2002，4（2）：136-142.

［9］Lohmeier TE.The sympathetic nervous system and long-term blood pressure regulation ［J］.Am JHypertens，2001，14（6pt2）：147S-154S.

［10］Szenasi G，Bencsath P，Szalay L，et al.Fasting induces denervation natriuresis in the conscious rat ［J］.Am JPhysiol，1985，249（5pt2）：F753-F758.

［11］Kalinowski L，Dobrucki LW，Szczepanska-Konkel M，et al.Thirdgeneration beta-blockers stimulate nitric oxide release from endothelial cells through ATPefflux：a novel mechanism for antihypertensive action［J］.Circulation，2003，107（21）：2747-2752.

（編輯 武玉欣，英文編輯 劉寶林）

The Renoprotective Actions of Sympathetic Blocking Agent and Renal Denervation in the Rat Renal Ablation Model

MINRui，WANGZong-qian，CHENWang，ZHAOXin-xin，LIYan-nong，DINGHong
（Department of Nephrology，The Fourth Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110032，China）

ObjectiveTo disscuss the renoprotective actions of the sympathetic blocking agent and renal denervation in the rat renal ablation model.Methods40wistar rats were randomly devided into 4groups.The first group served as negative control by sham operating.The second one as positive control by 5/6subtotal nephrectomy（SNX）.The third one was underwent SNX，The fourth group underwent SNXand resection of dorsal roots，i.e.rhizotomy.The negative control，the positive control group and the fourth group were administrated tap water，the third group was given sympathetic blocking agent for 8weeks.ResultsAt the end of the study，the blood pressure of the rats was 118.67±13.34mmHg in the negative control group，173.49±16.48mmHg in the positive control group，115.67±15.53mmHg in the third group and 107.99±12.35mmHg in the fourth group，respectively.Albuminuria was 6.19±2.70，35.35±4.58，16.49±3.77，14.23±0.69mg/24h，respectively.The glomerulosclerosis of the third and fourth group were better than that of the others.The lowest indices for collagen Ⅲ，collagenⅣ and AT1-Rwere found in the third and fourth group（P＜0.05）.ConclusionThe sympathetic blocking agent and renal denervation can protect the remanent kidney injury.

chronic kidney disease；sympathetic blocking agent；5/6subtotal nephrectomy；renal denervation

R692

A

0258-4646（2011）05-0400-05

doi CNKI：21-1227/R.20110523.1816.028

http://www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20110523.1816.028.html

遼寧省教育廳高?？蒲杏媱潱?008845）

閔睿（1976-），女，主治醫(yī)師，碩士.

王宗謙，E-mail：zqw1813@163.com

2010-11-03

網(wǎng)絡出版時間：2011-05-1815:25