蔡蔚 袁軼峰 賀菊喬 伍參榮

（1湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 長沙 410007；2湖南中醫(yī)藥大學(xué) 長沙 410007）

前癃通膠囊對人前列腺組織bcl-2、bax表達(dá)的影響

蔡蔚1袁軼峰1賀菊喬1伍參榮2

（1湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 長沙 410007；2湖南中醫(yī)藥大學(xué) 長沙 410007）

目的：檢測前癃通對前列腺組織bcl-2、bax表達(dá)的影響。方法：（1）免疫組化法檢測前癃通對體外培養(yǎng)BPH患者前列腺組織bcl-2、bax蛋白表達(dá)的影響。（2）RT-PCR法檢測前癃通對體外培養(yǎng)BPH患者前列腺組織塊細(xì)胞bcl-2 mRNA、bax mRNA基因表達(dá)的影響。結(jié)果：前癃通高、中劑量組對前列腺組織bcl-2蛋白、bcl-2 mRNA基因的表達(dá)有不同程度的抑制作用，對bax蛋白、bax mRNA基因的表達(dá)有不同程度的增強(qiáng)作用。結(jié)論：前癃通對前列腺組織能抑制bcl-2的基因表達(dá)，增強(qiáng)bax的基因表達(dá)，從而抑制前列腺增生。

良性前列腺增生癥；前癃通膠囊；前列腺組織；bcl-2；bax

前癃通膠囊是我們根據(jù)氣虛血瘀理論，臨床應(yīng)用多年治療良性前列腺增生癥（BPH）的經(jīng)驗(yàn)方，在多年的臨床運(yùn)用中取得了較好的療效。本研究旨在前期工作的基礎(chǔ)上，借助現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，進(jìn)一步探討前癃通膠囊對BPH患者體外培養(yǎng)前列腺組織細(xì)胞bcl-2、bax表達(dá)的影響，為前癃通膠囊的療效評價(jià)進(jìn)一步提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 前列腺組織的培養(yǎng) 在手術(shù)室無菌條件下，經(jīng)恥骨上前列腺摘除術(shù)切除的新鮮前列腺標(biāo)本迅速放入在4℃冰箱中預(yù)冷的組織洗滌液內(nèi)，冰浴狀態(tài)下帶回實(shí)驗(yàn)室。在2 h內(nèi)開始組織消化。參照文獻(xiàn)

[1～2]，經(jīng)前列腺組織處理、培養(yǎng)液潤洗、接種，逐日觀察培養(yǎng)組織，至組織塊之間的細(xì)胞互相融合，即可直接用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及分組

1.2.1 實(shí)驗(yàn)藥物及制備 前癃通膠囊：由黃芪、丹參、三七、穿山甲、王不留行等藥物組成，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供，批號000605，每粒0.5 g（含生藥0.5 g）。取前癃通膠囊50 g，加入Hank's液溶解，用組織培養(yǎng)液配制成1 g/mL，1 500 rpm離心去除沉淀，用0.22 μm微孔濾膜濾過除菌，4℃保存?zhèn)溆谩Ｋ舴遥诜河缮綎|健康藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：1210016，10 mg/片。取他莫昔芬20 g，用Hank's液溶解,用組織培養(yǎng)液稀釋配制成1 ng/mL，用0.22 μm微孔濾膜濾過除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 藥物對培養(yǎng)組織的毒作用 取上述制備好的前癃通膠囊藥液，用1 640培養(yǎng)液幾何比稀釋成25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78 mg/L濃度，生物光學(xué)倒置顯微鏡下觀察前癃通膠囊對培養(yǎng)的前列腺組織的毒性作用。結(jié)果6.25、3.13、1.56 mg/L組對細(xì)胞的毒性作用小于制定標(biāo)準(zhǔn)，因此選擇作為試驗(yàn)用藥濃度。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇形態(tài)良好、長滿單層的組織培養(yǎng)物隨機(jī)分為：模型對照組（即空白組）、他莫昔芬組、前癃通高劑量組（6.25 mg/L）、前癃通中劑量組（3.13 mg/L）和前癃通低劑量組（1.56 mg/L）。

1.3 SABC法檢測各組bcl-2、bax蛋白表達(dá)

1.3.1 實(shí)驗(yàn)材料 （1）bcl-2試劑盒（湖南麗欣生物公司）；（2）bax試劑盒（湖南麗欣生物公司）；（3）DAB試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；（4）即用型SABC免疫組化染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司)；（5）鼠抗人bcl-2單克隆抗體系（武漢博士德生物工程有限公司）；（6）鼠抗人bax單克隆抗體系（武漢博士德生物工程有限公司）；（7）山羊抗兔IgG（武漢博士德生物工程有限公司）；（8）PBS（湖南麗欣生物公司）。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）載玻片防脫片處理：選擇APES，撈片后置烤箱60℃30～60 min以使切片緊密粘附。（2）切片脫蠟至水，30%H2O21份+蒸餾水10份混合，室溫5～10 min以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。（3）微波修復(fù)抗原：將切片浸入0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液，PH 6.0，電爐或微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔5～10 min，重復(fù)1～2次，冷卻后進(jìn)行下一步。（4）滴加山羊血清封閉液，室溫20 min。甩去多余液體，不洗。（5）滴加鼠抗bcl-2抗體，37℃1～2 h。PBS（PH 7.2～7.6）洗2 min×3次。（6）滴加生物素化山羊抗兔IgG，20～37℃20 min，PBS（PH 7.2～7.6）洗2 min×3次。（7）滴加試劑SABC，20～37℃20 min，PBS（PH 7.2～7.6）洗5 min×4次。（8）DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒。取1 mL蒸餾水，加試劑盒中A、B、C試劑各1滴，混勻后加至切片。室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，一般5～30 min，蒸餾水洗滌。（9）蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片。顯微鏡觀察。觀察方法：在10×40倍視野下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野的bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)（棕黃色顆粒），取其均值。bax具體操作步驟同bcl-2。

1.4 RT-PCR法測定各組bcl-2 mRNA、bax mRNA基因表達(dá)

1.4.1 主要試劑 （1）Trizol試劑盒：上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供。（2）β-actin、bcl-2、bax引物：由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。（3）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒：上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供。

1.4.2 主要儀器 （1）PCR基因擴(kuò)增儀：TC-48/T/H（a）杭州大和株式會社；（2）天能凝膠成像系統(tǒng)(Tanon GISgel in aging system)：上海天能生物有限公司；（3）TGL16臺式高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀；（4）電泳儀：杭州大和株式會社。

1.4.3 β-actin、Bcl-2和 Bax引物序列 β-actin mRNA：sense:5-TTGGCACCACACTTTCTACA-3'；antisense：5’-TCACGCACGATTTCCCTCTCA-3’；擴(kuò)增片段長度442 bp。β-actin作為“看家基因”監(jiān)控RNA使用量，以消除不同樣本間加樣誤差。Bcl-2 mRNA：sense:5’-CCATGTGTCCATCTGACC-3’；antisense：5’-GCCATATAGTTCCACAAA-3’；擴(kuò)增片段長度330 bp。Bax mRNA：sense:5’-CTAGCA AACTGGTGCTCAAGG-3’；antisense：5’-CGAAGT AGGAGAGGAGGCCT-3’；擴(kuò)增片段長度147 bp。

1.4.4 總RNA的提取 參考文獻(xiàn)[3]。（1）取10 mg低溫保存的前列腺組織塊加1 mL酚和異硫氰酸胍的均相溶液(Trizol)，機(jī)械勻漿，吹打混勻；（2）將勻漿液轉(zhuǎn)至1.5 mL滅菌管中，室溫靜置15 min；（3）加入0.2 mL氯仿，輕搖震蕩15 s，室溫靜置2 min；（4）4℃、12 000 rpm離心15 min，取上清；（5）將上清水相（約1 mL）移入新的EP管，加入異丙醇0.5 mL，將管內(nèi)液體輕輕混勻，室溫靜置10 min；（6）4℃、12 000 rpm離心10 min，傾倒棄上清；（7）加入75%乙醇1 mL，清洗EP管，吹打混勻，4℃、7 500 rpm離心5 min，棄上清，重復(fù)1次；（8）所得RNA用紫外分光光度法定量，并于－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5 PCR擴(kuò)增 50 mL反應(yīng)體系中含有2× RT-PCR Buffer 25μL，模板RNA X μL(含量為1 μg)，β-actin、bcl-2和 bax上下游引物各 1 μL，RT/Taq Mix 1μL，其余體積為DEPC水。循環(huán)參數(shù)：（1）β-actin為94℃2 min，94℃50 s，55℃50 s，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃5 min；（2）bcl-2為94℃2 min，94℃30 s，50℃30 s，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃5 min；（3）bax為94℃2 min，94℃30 s，59℃45 s，72℃45 s，30個(gè)循環(huán)，72℃5 min。以上均采用熱啟動方式，預(yù)變性后，于72℃條件下加入Taq DNA聚合酶。

1.4.6 PCR產(chǎn)物電泳鑒定 RT-PCR后的DNA產(chǎn)物加入染料后離心1 000 rpm×30 s，充分振蕩，取10 μL于115%瓊脂糖凝膠電泳，100 V，1 h，EB染色，紫外燈下拍照。

1.4.7 圖像分析 采用天能凝膠成像系統(tǒng)測定PCR產(chǎn)物電泳密度。各基因mRNA表達(dá)強(qiáng)度以其PCR產(chǎn)物電泳密度值與看家基因β-actin的比值(bcl-2/β-actin、bax/β-actin)來表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (±S)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用q檢驗(yàn)（用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析）。

2 結(jié)果

2.1 各組bcl-2蛋白表達(dá)的結(jié)果 他莫昔芬組和前癃通高、中劑量組對bcl-2蛋白的表達(dá)有不同程度的抑制作用，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01、P＜0.05），低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；高、中劑量組與他莫昔芬組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1 免疫組化法檢測bcl-2蛋白表達(dá)的指數(shù) (±S)

表1 免疫組化法檢測bcl-2蛋白表達(dá)的指數(shù) (±S)

注：與模型組比較：○P＜0.05，●P＞0.05，△P＜0.01；與他莫昔芬組比較：▲P＞0.05；與低劑量組比較：☆P＞0.05，★P＜0.05；與中劑量組比較：□P＞0.05。

組別 n bcl-2模型組 5 11.60±2.07他莫昔芬組 5 9.20±1.48○低劑量組 5 10.40±1.52●▲中劑量組 5 8.80±0.84○▲☆高劑量組 5 7.80±1.79△▲★□

2.2 各組bax蛋白表達(dá)的結(jié)果 他莫昔芬組和前癃通高、中劑量組對bax蛋白的表達(dá)有不同程度的增強(qiáng)作用，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；高劑量組與他莫昔芬組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與中劑量組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 免疫組化法檢測bax蛋白表達(dá)的指數(shù) (±S)

表2 免疫組化法檢測bax蛋白表達(dá)的指數(shù) (±S)

注：與模型組比較：▲P＜0.01，○P＞0.05；與他莫昔芬組比較：●P＜0.01，☆P＞0.05；與低劑量組比較：★P＞0.05，□P＜0.01；與中劑量組比較：■P＜0.05。

組別 n bax模型組 5 9.20±0.84他莫昔芬組 5 13.80±1.48▲低劑量組 5 10.60±0.55○●中劑量組 5 11.20±1.48▲●★高劑量組 5 13.00±0.71▲☆□■

2.3 各組bcl-2 mRNA基因表達(dá)的結(jié)果 他莫昔芬組和前癃通高、中劑量組對bcl-2 mRNA的表達(dá)有不同程度的抑制作用，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01、P＜0.05），低劑量組與模型組比較，對bcl-2 mRNA作用不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；高、中劑量組與他莫昔芬組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表3。

表3 前癃通對前列腺組織bcl-2 mRNA表達(dá)的影響 (±S)

表3 前癃通對前列腺組織bcl-2 mRNA表達(dá)的影響 (±S)

注：與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與他莫昔芬組比較：△P＞0.05，△△P＜0.01；與低劑量組比較：#P＞0.05，##P＜0.05。

組別 n bcl-2 mRNA模型組 5 17.46±3.18△△##他莫昔芬組 5 13.35±2.64**#低劑量組 5 15.74±4.23中劑量組 5 14.25±3.86*△#高劑量組 5 12.76±3.31**△##

2.4 各組bax mRNA基因表達(dá)的結(jié)果 他莫昔芬組和前癃通高、中劑量組對bax mRNA的表達(dá)有不同程度的增強(qiáng)作用，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05、P＜0.01），低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；高劑量組與他莫昔芬組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見表4。

表4 前癃通對前列腺組織細(xì)胞bax mRNA表達(dá)的影響 (±S)

表4 前癃通對前列腺組織細(xì)胞bax mRNA表達(dá)的影響 (±S)

注：與模型組比較：*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01；與他莫昔芬組比較：△P＞0.05，△△P＜0.05；與低劑量組比較：#P＞0.05，##P＜0.05。

組別 n bax mRNA模型組 5 14.12±2.92△△#他莫昔芬組 5 17.85±3.51**#低劑量組 5 15.43±2.13*△中劑量組 5 17.42±4.22**△#高劑量組 5 18.82±3.58***△##

3 討論

前癃通膠囊是我們臨床應(yīng)用多年治療良性前列腺增生的經(jīng)驗(yàn)方，具有益氣利水、活血散結(jié)之功效。經(jīng)臨床應(yīng)用證實(shí)[4]，該藥療效確切，實(shí)驗(yàn)研究顯示，該藥對大鼠前列腺基底細(xì)胞凋亡有影響。本實(shí)驗(yàn)通過觀察該藥對BPH患者體外培養(yǎng)前列腺組織bcl-2、bax表達(dá)的影響，進(jìn)一步從細(xì)胞分子水平探討前癃通膠囊的作用機(jī)制。

以往的研究發(fā)現(xiàn)增生前列腺組織的細(xì)胞凋亡水平明顯低于正常前列腺組織，引起前列腺細(xì)胞凋亡的調(diào)控基因有bcl-2、bax、fax、C-myc、P 53等。在參與調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因中bcl-2蛋白家族是最重要的凋亡調(diào)節(jié)因子，bcl-2和bax又分別是其中主要的抗凋亡和促凋亡成員。研究表明[5]，bcl-2基因主要在前列腺基底上皮細(xì)胞中表達(dá)，說明前列腺增生時(shí)由于bcl-2對上皮細(xì)胞發(fā)揮凋亡作用，可使前列腺上皮細(xì)胞壽命延長，凋亡數(shù)目減少。Colombel等[6]通過免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，bcl-2表達(dá)于前列腺移行帶、外周帶和中央帶的基底上皮細(xì)胞，在BPH中強(qiáng)陽性表達(dá)。bcl-2的抗凋亡作用使前列腺基底細(xì)胞增殖與凋亡失衡而引起前列腺增生。謝慶祥等[7]研究表明BPH中bcl-2異常高表達(dá)，提示bcl-2表達(dá)增強(qiáng)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的減少在BPH的發(fā)生過程中起重要作用，與本研究結(jié)果一致。

bax是一個(gè)水溶性蛋白，與bcl-2蛋白大約有21%的同源性，其過量表達(dá)可抑制bcl-2功能而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究表明[8]，前列腺上皮和間質(zhì)中見bax表達(dá)，提示bax對上皮和間質(zhì)細(xì)胞凋亡均有調(diào)控功能，BPH上皮細(xì)胞bax表達(dá)減少，提示其促進(jìn)上皮細(xì)胞凋亡的功能亦降低，從而導(dǎo)致上皮細(xì)胞凋亡減少，引起上皮細(xì)胞聚集、增生，表明bax參與BPH的上皮增生形成過程，而BPH間質(zhì)細(xì)胞中bax表達(dá)與正常者無明顯差異，甚至呈增加趨勢，推測bax在BPH的間質(zhì)增生過程中作用并不重要。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，前癃通膠囊能抑制體外培養(yǎng)前列腺組織bcl-2的蛋白及其基因表達(dá)，同時(shí)又能增強(qiáng)bax蛋白及其基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。其治療前列腺增生癥的機(jī)理可能是通過對凋亡因子的調(diào)控，調(diào)節(jié)bcl-2和bax基因，促使細(xì)胞凋亡而起作用。

[1]鄂征.組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)[M].北京:北京出版社,2001. 35-38

[2]司徒鎮(zhèn)強(qiáng),吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng)[M].西安:興界圖書出版社,2003.22-77

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Objective:To explore the influence of Qian-long-tong capsule on the expressions of bax,bcl-2 in prostatic tissue.Methods: (1)Immunity histochemistry analysis was used to explore the influence of Qian-long-tong capsule on the expressions of bcl-2 protein and bax protein in prostatic tissue mass.(2)RT-PCR was used to examine the effect of Qian-long-tong capsule on expressions of bcl-2 mRNA gene and bax mRNA gene.Results:During high and medium dose groups of Qian-long-tong capsule,there were different degree of inhibitory action on the expressions of bcl-2 protein and bcl-2 mRNA gene,while enhancement action on the expression of bax protein and bax mRNA gene.Conclusion:Qian-long-tong capsule can inhibit the expression of bcl-2 gene,enhance the expression of bax gene thus inhibit the hyperplasia of prostate tissue.

Benign Prostate Hyperplasia（BPH）;Qian-long-tong capsule;Prostatic tissue mass;bcl-2 gene;bax gene

R 697.3

B

10.3969/j.issn.1671-4040.2011.01.001

2010-07-21）