孫敏卓,孟仟祥,房 嬛,徐 茵

(中國科學(xué)院油氣資源研究重點實驗室,甘肅蘭州 730000)

不同溶劑抽提冷杉脂溶性物質(zhì)的GC/MS分析

孫敏卓,孟仟祥,房 嬛,徐 茵

(中國科學(xué)院油氣資源研究重點實驗室,甘肅蘭州 730000)

為了研究不同溶劑超聲波抽提的冷杉脂溶性物質(zhì)中有機化學(xué)成分的異同,采用氯仿一元溶劑、V(氯仿)∶V(甲醇)=3∶1的混合二元溶劑以及V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(丙酮)=4 ∶1∶1的混合三元溶劑,超聲波抽提冷杉脂溶性物質(zhì)的化學(xué)成分,氣相色譜法分離,質(zhì)譜法鑒定其結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明,3種不同溶劑所抽提的脂溶性物質(zhì)在提取率、化學(xué)成分及含量等方面存在較大的差異。用氯仿一元溶劑超聲波抽提的脂溶性物質(zhì)的提取率最高,化學(xué)成分比較全面,是冷杉脂溶性物質(zhì)抽提的理想溶劑。

冷杉;超聲波抽提;脂溶性物質(zhì);氣相色譜-質(zhì)譜法(GC/MS)

冷杉為松科冷杉屬植物,高大挺直的塔狀常綠喬木。冷杉的枝葉、嫩葉和樹皮中含有揮發(fā)油,可用來制備冷杉精油。冷杉樹皮中含有大量提煉物,其組成成分類似于樹木嫩枝綠葉中的提煉物[1]。目前,對冷杉化學(xué)成分的研究多集中于其揮發(fā)油,研究方法多采用水蒸氣蒸餾法,一般可檢測到萜類化合物[2-3]。而對冷杉中有機化合物的全貌分析及檢測則很少,尤其是對冷杉不同餾分中生物標(biāo)志化合物分布特征的研究未見報道。本工作擬采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC/M S)法對不同溶劑超聲波抽提的冷杉脂溶性物質(zhì)成分進(jìn)行比較分析,為這一藥用和商用資源的研究開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗部分

1.1 主要儀器與裝置

6890N-GC/5973N-M SD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀:美國安捷倫科技有限公司產(chǎn)品,配有電子轟擊電離源(EI)及美國N IST02L譜庫。

KQ-50DE型數(shù)控超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品,溫度35℃,頻率90 Hz。

1.2 主要材料與試劑

冷杉:采自青藏高原,將摘下的新鮮冷杉樹枝放在深色透氣袋中,袋口微開,置于陰涼處自然陰干,保存,備用;氯仿、正己烷、二氯甲烷、甲醇、無水乙醚、三氟化硼、硅膠和氧化鋁(分析純);天津化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱:美國J&W HP-5石英毛細(xì)柱(30 m×0.25 mm×0.25μm);升溫程序:起始溫度80℃,以4℃/min升至290℃,保持30 min;載氣(He)流速 1.1 m L/min;壓力2.4 kPa;進(jìn)樣量 1.0μL;分流比 10∶1。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊(EI)離子源,電子能量70 eV,傳輸線溫度280℃,離子源溫度230℃,母離子m/z285,激活電壓1.5 V,質(zhì)量掃描范圍m/z35～600。

1.3.3 超聲波條件 溫度40℃,頻率70 Hz。

1.4 樣品處理

稱取1.012 6 g、1.015 7 g和1.019 6 g粉碎后的冷杉樣品,分別加入50 mL氯仿一元溶劑,50 m LV(氯仿)∶V(甲醇)=3∶1二元混合溶劑,以及 50 m LV(氯仿)∶V(甲醇)∶V(丙酮)=4∶1∶1三元混合溶劑,于40 ℃、70 Hz條件下超聲波抽提15 min,過濾,濾渣重復(fù)上述步驟。超聲波抽提3次,合并3次濾液,回收溶劑,至恒重時稱重,分別為0.395 7 g、0.373 7 g和0.358 3 g。然后分別取0.100 0 g 3種脂溶性物質(zhì),經(jīng)V(硅膠)∶V(氧化鋁)=3∶1柱色層,分別以150 mL正己烷、100 mL二氯甲烷和100 m L甲醇作洗脫劑做族組成分離,分別得到冷杉一元、二元、三元溶劑抽提物的非極性餾分、弱極性餾分和極性餾分。最后,非極性餾分和弱極性餾分直接做 GC/M S分析,而極性餾分經(jīng)V(BF3)∶V(CH3OH)=1∶4的混合溶液甲酯化24 h,再經(jīng)乙醚萃取,進(jìn)行 GC/M S分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 抽提率

按1.4項處理冷杉樣品,所得提取率分別為39.08%、36.79%和35.14%,示于圖1。由此可知,一元溶劑的收率最大。

圖1 收率柱狀圖Fig.1 The histogram of yields

2.2 柱色層族組成特征

經(jīng)一元、二元、三元溶劑分別超聲波抽提得到的3種冷杉脂溶性物質(zhì),再經(jīng)不同溶劑柱色層洗脫得到非極性餾分、弱極性餾分、極性餾分,列于表1。

表1 冷杉不同溶劑抽提物柱色層族組成Table 1 The column chromatography composition of the extraction of different solvent of Fir

從表1可以看出,3種溶劑超聲波抽提所得的脂溶性物質(zhì)中主要為極性餾分,占脂溶性物質(zhì)的95%以上,非極性餾分和弱極性餾分僅占脂溶性物質(zhì)的4%左右。同時可以看出,一元溶劑抽提物的脂溶性物質(zhì)中,非極性餾分和弱極性餾分明顯高于二元抽提物中對應(yīng)的餾分;二元溶劑抽提物的脂溶性物質(zhì)中非極性餾分和弱極性餾分大于三元抽提物中對應(yīng)的餾分。

2.3 各餾分的化合物特征

2.3.1 非極性餾分 一元、二元、三元溶劑超聲波抽提冷杉樣品所得脂溶性物質(zhì)的非極性餾分中各系列化合物的相對百分含量列于表2。從3種不同溶劑抽提脂溶性物質(zhì)的非極性餾分中檢測出正構(gòu)烷烴和類異戊二烯烷烴系列,以及松香烷衍生物系列,共22種有機化合物,列于表3。冷杉脂溶性物質(zhì)的非極性餾分以nC21和nC23正構(gòu)烷烴的相對豐度最高為特征,它們的最低相對百分含量為66.719%,最高為86.127%,正構(gòu)烷烴碳數(shù)分布為nC16～nC31。

表2 冷杉非極性餾分?jǐn)?shù)據(jù)表Table2 The data of the non-polar fraction of Fir

表3 冷杉非極性餾分鑒定表Table3 The identif ication table of the non-polar fraction of Fir

Pr/Ph為氧化還原常數(shù),可判斷原生質(zhì)在降解過程中環(huán)境的氧化還原條件。3種溶劑抽提所得的冷杉Pr/Ph值非常接近,約為0.345。由此表明,在冷杉離株之后的降解過程中,氧化還原環(huán)境大致相同。

OEP值為判識烷烴奇偶碳優(yōu)勢的參數(shù),高等植物原生質(zhì)中正構(gòu)烷烴呈現(xiàn)絕對的奇碳優(yōu)勢,偶數(shù)碳異常低,其OEP值較高[4]。植物離株后,若遇到較強烈的熱作用或細(xì)菌-酶作用,均可以使植物的奇偶優(yōu)勢發(fā)生變化,即奇數(shù)碳的相對豐度逐漸變高[5],其演化終點為沒有奇偶優(yōu)勢,出現(xiàn)偶數(shù)碳優(yōu)勢[6]。所研究的冷杉OEP值約為10.000,表明其呈現(xiàn)強烈的奇數(shù)碳優(yōu)勢特征,故說明雖然冷杉離株之后經(jīng)一定的熱作用或細(xì)菌-酶作用,但仍保持植物原生質(zhì)的特點。

∑C22-/∑C23+值為高低碳數(shù)正構(gòu)烷烴比值。在高等植物原生質(zhì)中,正構(gòu)烷烴的分布表現(xiàn)為高碳數(shù)優(yōu)勢,即 ∑C22-/∑C23+值遠(yuǎn)小于1。隨著高等植物離株之后的一系列降解過程,高碳數(shù)優(yōu)勢逐漸降低。所研究的冷杉 ∑C22-/∑C23+值為0.700～0.800,表明冷杉中的正構(gòu)烷烴系列曾經(jīng)歷過一定的降解過程,但降解過程不強烈。在降解作用下,其高碳數(shù)烷烴因去甲基和鏈斷裂效應(yīng)有向低碳數(shù)轉(zhuǎn)化的趨勢。

松香烷系列化合物是冷杉非極性餾分中十分重要的萜類化合物,它來自植物的樹脂,而且該系列化合物在石油地質(zhì)樣品中常用作指示高等植物母質(zhì)的重要生物標(biāo)志。冷杉中的萜類化合物具有一定的藥用價值,有治療感冒、風(fēng)濕和神經(jīng)痛等疾病的作用;冷杉針葉油單萜部分的化學(xué)組成可用于噴霧香精、香皂、牙膏、制藥及食品工業(yè)[7-8]。從表2可以看出,一元溶劑抽提物的非極性餾分中萜類化合物的相對百分含量略高于二元抽提物中萜類化合物,三元抽提物的非極性餾分中萜類化合物的相對百分含量最低。由此說明,一元溶劑抽提冷杉中的脂溶性物質(zhì)優(yōu)于二元和三元溶劑抽提。

2.3.2 弱極性餾分 從一元、二元、三元溶劑超聲波抽提冷杉樣品所得脂溶性物質(zhì)的弱極性餾分中檢測的有機化合物有較大的差別。

在一元溶劑超聲波抽提冷杉樣品所得脂溶性物質(zhì)的弱極性餾分中,檢測出一系列脂肪酸甲酯、氧化海松烯及一些大環(huán)化合物、甾族化合物等16種有機化合物,示于圖2a和表4。在二元溶劑超聲波抽提冷杉所得脂溶性物質(zhì)弱極性餾分中,檢測出氧化海松烯及少量脂肪酸甲酯、甾族化合物、芳烴化合物等9種有機化合物,示于圖2b。在三元溶劑超聲波抽提冷杉所得脂溶性物質(zhì)弱極性餾分中,僅檢測出氧化海松烯、脂肪酸甲酯等5種有機化合物,示于圖2c。

圖2 冷杉弱極性餾分的總離子流圖Fig.2 The total ion chromatograms of the weakly polar fraction of Fir

從圖2可以看出,在一元、二元、三元溶劑超聲波抽提冷杉樣品所得脂溶性物質(zhì)弱極性餾分中,檢測出的前6種化合物是一致的。在一元溶劑抽提物的弱極性餾分中,檢測到的有機化合物是相當(dāng)豐富的;而在二元、三元溶劑抽提物的弱極性餾分中,檢測到的有機化合物則相對匱乏。可見對于弱極性餾分而言,一元溶劑的超聲波抽提要優(yōu)于二元和三元溶劑的超聲波抽提。

2.3.3 極性餾分 極性餾分是冷杉脂溶性物質(zhì)中最主要的餾分,占脂溶性物質(zhì)的95%以上。從一元、二元、三元溶劑超聲波抽提所得脂溶性物質(zhì)的極性餾分中主要檢測出直鏈脂肪酸系列化合物[9],且3種餾分檢測的結(jié)果相同,列于表5。直鏈脂肪酸碳數(shù)分布為nC14～nC30,呈雙駝峰型,前駝峰的主峰碳為nC16,后駝峰的主峰碳為nC22,示于圖3。

表4 冷杉弱極性餾分鑒定表Table 4 The identification table of the weakly polar fraction of Fir

表5 冷杉極性餾分鑒定表Table 5 The identification table of the polar fraction of Fir

圖3 冷杉極性餾分的總離子流圖Fig.3 The total ion chromatograms of the polar fraction of Fir

一元、二元、三元溶劑超聲波抽提冷杉樣品所得脂溶性物質(zhì)極性餾分的4種生物標(biāo)志化合物參數(shù)的差別較小,列于表6。表明上述3種溶劑對冷杉的超聲波抽提物極性餾分中生物標(biāo)志化合物的表征差別不大。

表6 冷杉極性餾分的參數(shù)表Table 6 The parameter table of the polar fraction of Fir

EOPf和CPIA值都是判識脂肪酸奇偶碳優(yōu)勢的參數(shù)[10]。在高等植物原生質(zhì)中,正構(gòu)脂肪酸呈現(xiàn)絕對的偶碳優(yōu)勢。所研究不同溶劑冷杉超聲抽提物的 EOPf和CPIA值相似,表明3種不同溶劑經(jīng)超聲波抽提得到極性餾分特征相似,即極性餾分中脂肪酸的分布并未受到不同溶劑抽提的影響。同時,EOPf和CPIA值顯示冷杉脂肪酸系列并未受到降解因素的影響,仍保留原生質(zhì)中強烈的偶碳數(shù)優(yōu)勢特征。比較冷杉中關(guān)于正構(gòu)烷烴的分布特征,發(fā)現(xiàn)在冷杉離株之后的熱力及細(xì)菌-微生物作用的降解過程對正構(gòu)烷烴有較明顯的影響,但脂肪酸系列卻基本保持原貌。

在脂肪酸中,異構(gòu)脂肪酸的存在是細(xì)菌微生物發(fā)育的證據(jù)之一[11-14],也就是說,在高等植物原生質(zhì)中,脂肪酸一般都是以正構(gòu)脂肪酸的形式存在,而在其離株之后的細(xì)菌作用下,正構(gòu)脂肪酸逐漸轉(zhuǎn)化為異構(gòu)脂肪酸。因此,可以用∑iCn∶0/ ∑nCn∶0值 (異構(gòu)脂肪酸與正構(gòu)脂肪酸的比值)來作為判識細(xì)菌作用程度的參數(shù),即該值越大,樣品受細(xì)菌微生物的作用越強烈,反之樣品受細(xì)菌微生物的作用越弱。所研究的冷杉脂溶性物質(zhì)極性餾分值約為0.130,說明其受過細(xì)菌微生物的作用,但受降解的程度并不強烈。

3 結(jié)論

1)有機溶劑超聲抽提法分離天然有機產(chǎn)物中脂溶性物質(zhì),由于其時間短而且抽提率較高,可作為有效的分離方法在實驗室中使用。

2)從冷杉不同溶劑的超聲抽提所得到的脂溶性物質(zhì)抽提率來看,一元溶劑＞二元溶劑＞三元溶劑。

3)不同溶劑的超聲抽提物經(jīng)柱色層族組成分離結(jié)果表征,雖然非極性和強極性餾分的3種溶劑抽提法分布特征相同,但弱極性餾分以一元溶劑得到的信息最為豐富,因此一元溶劑氯仿超聲波抽提法是最佳的。

4)研究表明,植物離株之后若在室溫空氣中保存,則易受到細(xì)菌-微生物的降解作用,主要受降解影響的是正構(gòu)烷烴系列的去甲基和鏈斷裂效應(yīng)增強,主要表現(xiàn)為高碳數(shù)正構(gòu)烷烴向低碳數(shù)降解的過程。因此,在研究天然有機物時,所研究的植物為避免受到細(xì)菌微生物的作用,應(yīng)該在植物離株后及時密封保存,盡量與空氣隔絕,以保持植物本身的生物特征。

致謝:感謝中國科學(xué)院青藏高原研究所白艷博士后提供的冷杉樣品。

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Com ponen t Analysis of L ipid-Soluble Substances Extracted by Different Solvents from Fir by GC/MS

SUN M in-zhuo,M ENG Qian-xiang,FANG Xuan,XU Yin
(Key Laboratory of Petroleum Resources Research,Institute of Geology and Geophysics,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China)

The chem ical components of lipid-soluble substances f rom Fir w ere extracted by ultrasonic extraction with the single solvent(chloroform),the binary solvents(V(chloroform)∶V(methanol)=3∶1)and the ternary solvents(V(chlo roform)∶V(methanol)∶V(acetone)=4∶1∶1)respectively,separated and identified by gas chromatography-mass spectrometry(GC/M S).The results show that the extraction rate,composition and their contents of lipid-solvent substances are notably varied by different solvents.The single solvent(chloroform)for extracting lipid-solvent substances is better than the other in raising yield and chemical composition,which is an ideal solvent for extracting of lipid soluble substances from Fir.

Fir;ultrasonic extraction;lipid-soluble substances;gas chromatography-mass spectrometry(GC/M S)

O657.63

A

1004-2997(2011)04-0222-07

2011-01-21;

2011-05-16

國家自然科學(xué)基金項目(40703001)資助

孫敏卓(1979～),女(漢族),陜西岐山人,助理研究員,從事氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和生物標(biāo)志化合物研究。E-mail:sunmz04@sina.com